蒽醌

蒽醌

2.1标准曲线的绘制：精密量取上述标准溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别至于25ml容量瓶中，在水浴上挥净乙醚，放凉，分别加5%氢氧化钠—2%氢氧化铵混合碱液至刻度，摇匀，以5%氢氧化钠—2%氢氧化铵混合碱液为空白对照，在490nm下，以1cm比色杯测定吸光度，用回归法求标准曲线方程。

2.2供试品溶液的制备及总蒽醌含量的测定：取本品50粒，倾出内容物，精密称定供试品内容物3g，于250ml烧瓶中，加5N硫酸45ml，直火加热水解2h，加入氯仿40ml，萃取3次（40ml，30ml，30ml），萃取液用蒸馏水洗涤2次（20ml，20ml），再用5%氢氧化钠—2%氢氧化铵混合碱液振摇萃取4次（30ml，20 ml ，20ml，20ml），合并萃取液，用氯仿洗涤数次至氯仿层无色，弃去氯仿层，用5%氢氧化钠—2%氢氧化铵混合碱液定容至100ml，摇匀，以5%氢氧化钠—2%氢氧化铵混合碱液为空白对照，在490nm下，以1cm比色杯测定吸光度，由线性方程计算即得供试品溶液的浓度。

蒽醌类化合物按结构的不同可分成羟基蒽醌类、氧化蒽酚及蒽酚类、二蒽酮类。

目前其提取方法主要采用溶剂提取法，如浸渍、渗漉、连续回流提取等方式，所用的溶剂主要有乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、吡啶、丙酮、硫酸溶液、盐酸溶液及氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化铵等溶液。其含量测定方法有重量法、荧光法、比色法、极谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法等，而单味植物药或其复方制剂中的蒽醌化合物含量，一般以大黄素或大黄酸、1，8-二羟基蒽醌为标准测定游离蒽醌或总蒽醌，结合蒽醌的量等于总蒽醌减去游离蒽醌。

1 比色法

根据蒽醌类及其苷大多数是黄色或橙红色的，羟基蒽醌能溶于碱溶液中而显红或紫红色；蒽酚和二蒽醌与碱液不显红色，只能呈黄色，需经氧化成羟基蒽醌后才与碱作用显红色；羟基蒽醌类因结构不同与醋酸镁的甲醇溶液反应可显橙、红、蓝、紫等色的性质而比色测定。

1.1 标准曲线的绘制：取经五氧化二磷干燥24 h的大黄素(或大黄酸、1，8-二羟基蒽醌)对照品适量用碱液(1 mol/L 氢氧化钠溶液或其与2%氢氧化铵溶液的混合溶液)或0.5%～1%醋酸镁甲醇溶液定溶，在500～550 nm波长处扫描，在最大吸收波长处测定吸收度，以吸收度对浓度绘制标准曲线，线性范围4～24 μg/ml。

1.2 游离蒽醌的测定：取药物细粉或其制剂粉末适量(约相当于游离蒽醌1.5 mg)加乙醚(或氯仿)溶解或用索氏提取器回流提取至提取液无色。将乙醚挥干，残渣用甲醇溶解，加醋酸镁甲醇溶液至定容；或将乙醚提取液移入分液漏斗中，用碱液提取并定容[1]，比色测定，依标准曲线计算含量。

1.3 总蒽醌的测定

1.3.1 先水解后提取：取供试品适量(约相当于总蒽醌1.5 mg)，用酸液(1～7.5

mol/L硫酸溶液或1.5～6 mol/L盐酸溶液)20～30 ml[2，3，4]，水浴回流1～2 h，以使结合态的蒽醌苷水解，使蒽醌游离，再用乙醚(或氯仿)萃取，并将过滤的药物残渣及滤纸经50℃干燥后用乙醚回流提取，待索氏提取器内提取液无色，合并乙醚液，照游离蒽醌测定法测定。

对含还原型蒽酮苷(如番泻苷)的样品，根据其可被三氯化铁氧化，酸水解成氧化型蒽醌苷元这一原理，称取供试品适量，加水30 ml超声处理15～30 min(提高溶解、提取效率，大大缩短溶解、提取时间)，加10.5%三氯化铁溶液20 ml，回流20～60 min[3]，再加盐酸1～3 ml继续回流30 min，放冷，再进行萃取与测定。

因蒽醌类与碱液显色后，过氧化氢不能使其褪色，而其它有色物质可被其氧化褪色的原理，对含有干扰测定成分的碱萃取液[2]，加1%过氧化氢溶液少量，在沸水浴中加热4 min氧化，冷却，定容，比色测定。

1.3.2 先提取后水解：取供试品适量，加甲醇(或乙醇、氯仿等)，对含蒽醌的浸膏制剂，超声处理30 min[5]，使溶解，对含蒽醌的原植物药粉末制剂，应置索氏提取器中回流提取，至提取液无色，将甲醇回收至干，残渣用酸液水解，乙醚(或氯仿)萃取，依法测定。

荧光分光光度法测定大黄中游离蒽醌的含量

2.1 测定波长的选择用2 ml

3.1 μg/ml的1，8 二羟基蒽醌标准液在300～600 nm波长范围内进行激发波长扫描，蒽醌的最大激发波长(λex)为460 nm，固定该激发波长，扫描得发射谱图，得到其发射波长(λem)为540 nm。结果见图1。

图1 蒽醌标准液的激发波长和荧光波长（略）

选择该最大激发波长和最大发射波长(即λex/λem=460 nm/540 nm)作为后继测定的工作条件。

2.2 标准曲线的制备精密称取105℃干燥至恒重的1.8 二羟基蒽醌2.5 mg置50 ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀得对照原液。精密量取对照原液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml分别置10 ml棕色容量瓶中，用丙酮定容，以丙酮试剂为空白，在λex =460 nm 和λem=540 nm处测其溶液的荧光强度，结果表明溶液的荧光强度(IF)与溶液浓度(C)在0.25～

3.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。见图2。

图2 游离蒽醌荧光强度标准曲线图（略）

2.3 条件考察

2.3.1 溶剂的影响选择丙酮、甲醇、氯仿试剂，考察了对反应体系的影响，结果表明样品在丙酮中荧光强度大、灵敏度高，且空白溶剂在此范围内几乎无荧光吸收(与文献报道一致［2］)，在激发波长为460 nm、发射波长为540 nm处，其拉曼光较小，对实验影响较小，图像也较直观，故本实验选用丙酮作溶剂，见图3。

图3 丙酮、甲醇、氯仿荧光效果图（略）

2.3.2 放置时间对游离蒽醌荧光强度的影响依照分析步骤,测定放置不同时间后的1，8-二羟基蒽醌的相对荧光强度。结果见表1。从表1中可以看出,随着放置时间的延长，相对荧光强度逐渐减小，荧光强度在0～3 h内基本稳定，因此应保证在3 h内测定荧光。

表1 放置时间对游离蒽醌荧光强度的影响（略）

2.4 样品的测定

2.4.1 样品溶液的制备取摄氏60℃干燥1 h的大黄粗粉80 mg，加50 ml 95%乙醇，先在25 kHz 频率下超声20 min，然后水浴上加热至微沸，回流1.5 h，采用3 000 r/min的转速离心30 min，取上清液，残渣再加50 ml 95%乙醇液加热回流30 min，离心取上清液，合并两次上清液，浓缩后挥去乙醇，残渣加二次蒸馏水10 ml，1 mol/L NaOH 2滴、氯仿15 ml，分离后将水溶液于冰水浴中并加乙醚10 ml、盐酸0.4 ml后立即密封振摇3 min，静止分层，如此方法萃取3次合并乙醚液，挥尽乙醚后加50 ml丙酮，得样品溶液。

2.4.2 精密度实验分别精密吸取样品溶液1 ml于5个10 ml棕色容量瓶中，加丙酮定容。在λex/λem=460 nm/540 nm下测荧光强度。结果见表2。RSD 为0.3%，表明该方法的精密度良好。