第五章 柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵机制柠檬酸生产分发酵和提取两部分。
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
现多采用通用发酵罐。
它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。
发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力，并有良好的密封性。
除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。
例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过不断变异和选育得到的。
菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
柠檬酸发酵机理
通过调整发酵温度和pH值，找到最适 宜的发酵条件，以提高柠檬酸的产量 和降低能耗。
产物的分离与纯化技术改进
分离技术
采用新型的分离技术，如超滤、纳滤、反渗透等，实现柠檬酸的高效分离和纯 化，降低分离成本。
纯化技术
采用结晶、离子交换、吸附等纯化技术，进一步提高柠檬酸的纯度，满足不同 应用需求。
细菌
某些细菌如柠檬酸杆菌、 氧化杆菌等也可以进行柠 檬酸发酵。
微生物的代谢途径
葡萄糖代谢
微生物将葡萄糖通过糖酵解途径 转化为丙酮酸，这是柠檬酸发酵 的起始步骤。
丙酮酸代谢
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下 转化为草酰乙酸，再经过三羧酸 循环转化为柠檬酸。
乙酰CoA的合成
在柠檬酸发酵过程中，乙酰CoA 是重要的中间代谢产物，可以用 于合成脂肪酸等物质。
厌氧发酵
微生物在厌氧条件下，将葡萄糖或其他糖类转化 为丙酮酸，再经过一系列反应生成柠檬酸。
3
好氧发酵
微生物在好氧条件下，通过糖酵解途径将葡萄糖 转化为丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬 酸。
柠檬酸发酵的分类
黑曲霉发酵
黑曲霉在好氧条件下进行发酵，通过糖酵解途径将葡萄糖转化为 丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬酸。
产物提取与精制
过滤分离
将发酵液进行过滤，分 离出菌体和未消耗的原
料。
离子交换
利用离子交换剂吸附柠 檬酸离子，与其他离子 进行交换，实现柠檬酸
的分离。
浓缩结晶
将分离出的柠檬酸溶液 进行浓缩和冷却，促使
柠檬酸结晶析出。
干燥与包装
将结晶的柠檬酸进行干 燥和包装，得到符合标
准的柠檬酸产品。
05 柠檬酸发酵的优化与改进
发酵工程第五章
糖代谢途径
EMP途径 HMP途径 ED 途径 TCA循环
糖代谢的调节机制
糖代谢的能荷调节
能荷 = [ATP] +1/2[ADP] / [ATP] +[ADP] +[AMP] 显然，能荷在0——1之间 G 磷酸化酶 磷酸果糖激酶 糖原 葡萄糖 关键酶 柠檬酸合 异柠檬酸脱氢酶
柠檬酸是微生物生长代谢过程中 的一个中间性产物，在正常的微 生物体内不能够积累的，如果有 积累的话，与柠檬酸合成有关的 各种酶的活性，则会受到抑制或 阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中， 这种抑制或阻遏是如何被克服的 呢？
（一）磷酸果糖激酶（PFK）活 性的调节
从葡萄糖到柠檬酸的合成过程中， PFK 是一种调节酶或者称之为关 键酶，其酶活性受到柠檬酸的强 烈抑制，这种抑制必须解除，否 则，柠檬酸合成的途径就会因为 该酶活性的抑制而被阻断，停止 柠檬酸的合成。
五、柠檬酸产生菌的育种
透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 现色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 不分解柠檬酸的菌株 选育不长孢子、少长孢子、迟长 孢子的菌株
第二节 乳酸发酵机制
分类 同型乳酸发酵 异型乳酸发酵
同型乳酸发酵
1葡萄糖 丙酮酸 乳酸脱氢酶
2乳酸
发酵菌种：乳酸链球菌、保加利亚乳 杆菌、德氏乳杆菌
异型乳酸发酵
异型乳酸发酵除生成乳酸外还生 成二氧化碳和乙醇和已酸 1，6磷酸葡萄糖途径 1葡萄糖 丙酮酸 乳酸脱氢酶 1 乳酸+乙醇 发酵菌种：肠膜明串球菌和葡聚 糖明串球菌
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。
6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
6. 柠檬酸发酵
2.柠檬酸生物合成途径
柠檬酸位于三 羧酸循环的起 始点，几乎所 有微生物都能 合成柠檬酸。
柠檬酸
3.柠檬酸产生菌
菌 种
假单胞菌 节杆菌 棒杆菌 短杆菌 诺卡氏菌 放线菌
柠檬酸
4.柠檬酸发酵生产菌
我国选育柠檬酸高产菌株
字佐米曲霉N558(产酸6％-7％)； 黑曲霉r144(产酸9％)； D353(产酸9％-10％)； N05016(产酸14％-17％)；
米曲霉 黑曲霉
5. 柠檬酸生物合成途径
l 在正常生长情况下．柠 檬酸在细胞内不会积累。 因为柠檬酸不是代谢途 径的终产物，而且是黑 曲霉的良好碳源.
l 柠檬酸积累是菌体代谢 失调的结果。
柠檬酸
柠檬酸积累
二、柠檬酸发酵工艺
l 柠檬酸发酵工艺的发展分为三个阶段：
1.表面发酵； 2.深层发酵； 3.固体发酵工艺。
课程名称:生物工艺学
1
柠檬酸发酵机理
2
柠檬酸培养工艺方法
一、柠檬酸发酵机理
1.柠檬酸简介
l 早期，柠檬酸主要从柑橘、菠 萝和柠檬等水果中提取。
l 1893年，wehmer发现青霉可以 生成柠檬酸。
l 19l7年Currie使用黑霉菌的浅 盘发酵生产柠檬酸，为柠檬酸 的发酵奠定基础。
黑曲霉
浅盘发酵
1.表面发酵
2.深层发酵
3.固体发酵
1.表面发酵工艺
l 发酵室为不锈钢金属制大型发酵 盘，具有保温、保湿。
l 原料：糖蜜原料。
l 发酵条件：采用间歇培养；孢子 需1-2天发芽，30℃，发酵6-8d， pH降至2。
l 生产力：柠檬酸0.2-0.4kg/m3.h
糖蜜原料 发酵控制室
2.固体发酵法
《柠檬酸发酵》课件
柠檬酸发酵的未来发展
生物技术进步
随着生物技术的不断发展，未来有望通过基因编辑和合成 生物学手段进一步提高柠檬酸发酵的产量和效率。
环保要求
随着环保意识的增强，开发低污染或无污染的柠檬酸发酵 工艺将成为未来研究的重要方向。
智能化发酵
借助物联网、大数据和人工智能等技术，实现柠檬酸发酵 过程的智能化监控和管理，提高生产效率和产品质量。
无水硫酸铵
作为氮源，提供菌种生长所需的氮元素。
玉米浆
含有丰富的维生素、氨基酸和生长因子，有 助于菌种的生长和代谢。
磷酸二氢钾
提供磷元素和钾元素，有助于菌种的正常代 谢。
菌种接种与发酵
菌种选择
选择高产柠檬酸的菌种，如黑曲霉、 青霉等。
接种量
根据发酵罐的大小和生产能力，确定 适宜的接种量，以保证发酵效率。
在缺氧条件下，菌体会进行厌氧呼吸，产生乳酸或乙醇等副产物，而不是柠檬酸 。因此，需要提供足够的氧来支持菌体的有氧代谢，从而获得高产量柠檬酸。
营养物质对柠檬酸发酵的影响
营养物质是柠檬酸发酵过程中的基础物质，包括碳源、氮源 、磷源和无机盐等。
不同的营养物质对柠檬酸发酵的影响不同。通过实验研究， 可以确定最佳的营养物质配比，以提高柠檬酸的产量。此外 ，添加一些生长因子或酶抑制剂也可以调节菌体的代谢途径 ，从而影响柠檬酸的产量。
柠檬酸发酵的控制策略
参数控制
通过控制温度、pH、溶氧浓度等关键 参数，保证发酵过程在最佳条件下进行
。
分离纯化
采用高效的分离纯化技术，如离子交 换、吸附、萃取等，将柠檬酸从发酵
液中提取出来。
补料控制
根据发酵过程的实时监测数据，适时 添加必要营养物质，避免因缺乏某些 关键成分而影响发酵。
柠檬酸发酵机制
一、柠檬酸合成途径
Hale Waihona Puke 葡 EMP途径氧化脱羧 丙
乙酰-CoA
柠
萄 糖
酮 羧化 酸
草酰乙酸
檬 酸
•
1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉
中存在EMP途径的所有酶；
• 1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80
％走EMP途径；
• 1958年，MeDomough等发现黑曲霉还 存在HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于
孢子形成阶段；
• 1954－1955年，Ramakrishman和 Martin研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
1，6-二磷酸果糖
• （3）TCA循环的阻断微弱，导致循环 中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡 状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超 过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱 氢酶活力来提高自身的积累。
柠檬酸的积累机制归纳：
①Mn2+ 缺乏
抑制蛋白
合成
NH﹢4
有一条呼吸活力强的不产生ATP 的侧系呼吸链
解除磷酸果糖激酶 的代谢调节，促进 EMP途径的畅通
抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有 激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果 糖激酶的抑制作用。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是 由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积 累的大量柠檬酸不敏感。
淀粉
葡萄糖
Pi
+ NH4
K+
6-磷酸果糖
柠檬酸酒精等的发酵生产
19
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
淀粉的糊化、液化
淀粉在水中经加热会吸收一部分水而 发生溶胀。如果继续加热至一定温度（ 一般60～80℃）,淀粉粒即发生破裂,造 成黏度迅速增大,体积也随之迅速变大, 这种现象称为淀粉的糊化
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
不同种类淀粉糊化温度有所不同, 苷薯、马铃薯、玉米和小麦淀粉的 糊 化 温 度 分 别 为 70 ～ 76℃ 、 59 ～ 67℃ 、 64 ～ 72℃ 和 65 ～ 68℃ 。 发 生 糊化现象称为淀粉的溶解，或称为 液化。马铃薯、小麦和玉米支链淀 粉 完 全 液 化 的 温 度 为 132℃ 、 70 ～ 80℃、136～141℃和146～151℃。
24
淀粉质原料酒精生产工艺流程
•
大米 曲霉菌 麸皮 淀粉质原料
酵母
•
↓
↓
米曲霉→米曲
固体试管酵母
•
↓
↓
•
米曲汁→试管培养→三角瓶培养 粉碎
三角瓶液体酵母
•
↓
↓
ห้องสมุดไป่ตู้
↓
•
曲种
蒸煮
卡式罐酒母
•
↓
↓
↓
•
糖化曲液 糖化→酒母糖化醪→小酒母
•
↓
↓
•
发酵
大酒母
•
↓
•
蒸馏
•
↓
•
•
酒糟废液 酒精 杂醇油
米曲汁
25
淀粉颗粒→淀粉分子→可发酵性糖→酒精→95％乙醇 (C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6→2nC2H6O+2nCO2+2nATP
现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌） 高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的先锋霉素（头孢菌 素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。
柠檬酸发酵的原理及应用
柠檬酸发酵的原理及应用原理介绍柠檬酸（C6H8O7）是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、饮料、医药等领域。
柠檬酸可以通过发酵过程来生产，其发酵原理主要包括以下几个方面：1.发酵菌种选择：柠檬酸发酵常用的菌种包括柠檬酸杆菌、黄曲霉等。
这些菌种具有较高的柠檬酸产量和较短的发酵周期，适合用于大规模生产。
2.基质选择：发酵过程中的基质是维持菌种生长和柠檬酸产量的关键因素。
常用的基质包括糖类（如葡萄糖、果糖）、淀粉、甘油等。
不同基质的选择会对柠檬酸的产量和品质产生影响。
3.发酵条件调控：发酵条件的调控对柠檬酸发酵的效果起着重要作用。
包括温度、pH值、搅拌速度、氧气供应等参数的调节，可以影响菌种生长和柠檬酸产量。
应用领域柠檬酸作为一种重要的食品和工业原料，在多个领域有广泛的应用。
以下列举了柠檬酸几个主要的应用领域：1. 食品和饮料工业•柠檬酸作为酸味调节剂，广泛用于饮料、果汁、果酱、糖果等食品的制作中，能够增加食品的酸味，提升口感。
•柠檬酸还可以作为乳化剂、稳定剂，用于调制乳制品、冷饮、糕点等，具有增加食品的稳定性和保质期的作用。
2. 医药和化妆品行业•柠檬酸作为医药中间体，可以用于制备多种药物，如抗生素、止血剂、解热药等。
•在化妆品制造中，柠檬酸可以作为调节剂、抗氧化剂等，用于调整pH值、抑制细菌生长，并起到保湿、美白等作用。
3. 清洁和生活用品•柠檬酸可作为有机酸性清洁剂，可去除水垢、油脂等，并且具有良好的环境友好性。
•在洗涤剂和洗衣粉中，柠檬酸可以作为增白剂，提升洗涤效果。
4. 金属清洁和锈蚀保护•柠檬酸可以与金属表面形成络合物，在清洁金属表面时起到去污、去锈蚀的作用。
•柠檬酸也可以用于金属防锈处理，形成覆盖层来阻止金属进一步生锈。
总结柠檬酸的发酵原理和应用领域涉及多个方面，其发酵原理包括酵母菌选择、基质选择和发酵条件调控等。
在食品、医药、清洁和金属保护等领域，柠檬酸具有广泛的应用，是一种重要的有机酸。
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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柠檬酸发酵原理
柠檬酸钙的生成： 发酵结束后滤去菌丝，滤液按总酸量的70% 加入碳酸钙 粉进行中和，随后煮沸柠檬酸钙沉淀出来，在95℃以上 高温时柠檬酸钙 溶解度低，而其他有机酸的钙盐溶解度 高，热水洗涤干净。
硫酸置换反应： 将洗净的柠檬酸加水搅成糊状，在搅拌下加入浓硫酸，温 度80℃以上，硫酸与钙离子形成硫酸钙沉淀下来，将柠 檬酸置换出来。硫酸的用量约为加入碳酸钙的85%-90%。 严格控制温度。
脱色： 得到纯净的晶体，首先须除去色素，活性炭脱色和打孔树 脂脱色。
去除阳离子杂质： 树脂进行离子交换，当有pH的溶液流出时，表示已有柠 檬酸流出，开始收集。 浓缩： 减压浓缩 结晶： 缓慢搅拌 缺点： 劳动强度大，设备易腐蚀，提取率仅70%左右，同时造 成环境污染。
谢 谢！
图1 柠檬酸深层发酵工艺流程
发酵条件：培养基为18%的薯 干粉，灭菌前加入0.05%的淀 粉酶；发酵温度为32摄氏度， 12h前通风量1：0.1，12h后的 通风量1：0.2，一般发酵周期 为112—120h。
柠檬酸的分离 提取
钙盐法： 发酵液中的柠檬酸变 成钙盐沉淀，然后用 硫酸将柠檬酸钙置换 出游离的柠檬酸，生 成的硫酸钙沉淀出来， 最后将柠檬酸进一步 纯化结晶。
丙酮酸
CO2
琥珀酸
α-酮戊二酸
思考 EMP、HMP、TCA存在大多 数真核生物细胞中，但是为什 么黑曲霉能够大量积累柠檬酸 呢？
黑曲霉如何积累柠檬酸
黑曲霉耐酸，耐低PH。 黑曲霉发酵柠檬过程中，在发酵初期，发酵液中萄葡 糖含量较高，而高浓度的萄葡糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱 氢酶合成的抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸度得 到积累（注意此时积累的是酸度而不仅是柠檬酸），但是 当酸度积累到PH≤2.0时，催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠 檬酸正逆反应的顺乌头酸水合酶，不表现出活力，这样 TCA循环在合成柠檬酸之后就不会向后继续反应，从而达 到柠檬的积累。
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵是一种微生物发酵过程，利用某些特定菌种的代谢途径，将特定底物转化为柠檬酸。
该过程的原理涉及以下几个方面：
1. 底物选择：柠檬酸发酵的底物通常选择糖类物质，如蔗糖、葡萄糖等。
这些底物能够被发酵菌种代谢利用，产生有机酸。
2. 菌种选择：柠檬酸发酵常用的菌种是柠檬酸杆菌（Aspergillus niger）和柠檬酸假单胞菌（Yarrowia lipolytica）等。
这些菌种具有良好的柠檬酸合成能力。
3. 代谢途径：柠檬酸发酵的代谢途径主要包括三个关键步骤：
- 糖类底物酵解：底物被菌种内的酵解酶作用下分解为各种代谢物，如丙酮酸和乳酸等。
- 柠檬酸产生：丙酮酸在菌种内经过一系列酶催化反应，被转化为柠檬酸。
柠檬酸亦可通过川崎循环途径合成。
- 转运和排泄：合成的柠檬酸会通过菌体内部的膜通道或转运蛋白被转运至菌体外，最终被释放出来。
4. 发酵条件：柠檬酸发酵的条件包括温度、pH值、底物浓度和氧气供应等。
适宜的发酵条件能够提高菌种的活性和产酸效率。
综上所述，柠檬酸发酵利用特定菌种的代谢途径，将糖类底物转化为柠檬酸。
这一过程涉及底物的酵解、柠檬酸的合成以及其转运和排泄等关键步骤。
发酵条件的调控对于柠檬酸发酵过程的效果具有重要影响。
柠檬酸发酵机制ppt课件
重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物 合成的代谢调节机制。
难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。
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第一节 概述
一、柠檬酸简介
❖ 柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是 生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三 羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。 无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙 醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
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(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为：
(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。
④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱 氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
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（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率
合成1分子柠檬酸需要3分 子乙酰辅酶A，也就是需要 1.5分子的葡萄糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%
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三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
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（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？
当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸
《柠檬酸发酵机制》课件
发酵在食品、饮料、药品和生物能源等领域具有重要的应用价值。
柠檬酸发酵的概述
柠檬酸
柠檬酸是一种有机酸，广通过微生物参与的发酵过程产生，这个过程复杂 而多样。
柠檬酸发酵的微生物参与者
1 Aspergillus niger
这个真菌物种可以产生大量的柠檬酸，并被广泛用于柠檬酸生产。
2 Yarrowia lipolytica
这个酵母菌也具有较高的柠檬酸产量，适用于工业规模生产。
柠檬酸发酵的反应过程
1
底物准备
选择适合的有机物作为柠檬酸发酵的底物。
2
发酵培养
将底物与适宜的微生物共同培养，提供适宜的温度和氧气条件。
3
柠檬酸生成
底物被微生物分解，生成柠檬酸和其他副产物。
柠檬酸发酵的影响因素
温度
适宜的温度可以促进柠檬酸生成的速率和产量。
营养物质
提供足够的营养物质，如糖类、氮源和微量元素， 有助于增加柠檬酸产量。
pH 值
不同微生物对 pH 值的要求不同，酸碱度对柠檬酸 发酵具有影响。
氧气供应
有些菌株需要适量的氧气参与发酵过程，而有些则 能在无氧条件下进行发酵。
柠檬酸发酵的应用领域
食品生产
柠檬酸在食品加工中用作风味调剂 剂和酸味调节剂。
药品工业
柠檬酸被用作制药过程中的溶剂和 酸化剂。
清洁剂生产
柠檬酸被用于生产清洁剂，具有溶 解和去污的作用。
结论和总结
1 柠檬酸发酵在许多领域具有广泛的应用 2 微生物是柠檬酸发酵的关键参与者
柠檬酸发酵技术在食品、医药和清洁剂等行业有 着重要的地位。
不同的微生物物种对柠檬酸发酵具有不同的产量 和效率。
《柠檬酸发酵机制》PPT 课件
第五章柠檬酸发酵工艺
适合任何精制淀粉， 所得的糖化液过滤性 能好
有副反应生成有色物 及复合糖类，淀粉转 化率低，糖液质量差， 糖化液中含有微量醇 和不溶性糊精
淀粉乳浓度30%， pH6.5，Ca2+ 0.01 mol /L,液化温度85~ 90℃，30~60min液 化DE值15~18%
设备要求低，操作容 液化效果一般，经糖
淀粉液化的方法
1、酸法：以强酸为催化剂，高温、高
压条件下进行，液化程度较难掌握
2、酶法：采用α-淀粉酶，在中性溶液中，
常温、常压条件下进行，液化程度容易掌握。 此法适应于柠檬酸工业。
3、机械液化：不使用催化剂，使淀粉浆
喷射入一个旋转的蒸汽加热器中，受热淀粉 立即糊化，在强烈的机械剪力的作用下，使 淀粉分散。不破坏淀粉颗粒表面和结晶结构。
❖ 淀粉的液化实质上是在淀粉颗粒因 受热吸水膨胀、糊化破坏了其结晶结 构之后进行的，这是因为淀粉颗粒对 于酶作用的抵抗力较强，很难直接液 化。例如：细菌α-淀粉酶水解淀粉和 水解糊化淀粉速度比为1：20000，因 此淀粉乳糊化是酶法液化的第一个重 要的步骤。
淀粉在常温下不溶于水，但当水温至53℃ 以上，淀粉的物理性能发生明显变化。淀 粉在高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液 的特性，称为淀粉的糊化。
➢ 通蒸汽进喷射器、保温系统，待出口温度达 90℃以上时，打开浆料回流阀，开始将浆料泵 入喷射器进行液化，出料口温度达到95-97℃ 时，关小回流阀，料液进入层流罐，在9095℃条件下，维持30-60分钟；
➢ 然后进行二次喷射，料温达到140-145℃，进 入维持罐维持3-5分钟后，经闪冷器迅速降温后 落入二次液化罐中，加余下的1/3淀粉酶，在 90 ℃左右维持30分钟，碘检查无蓝色反应，然 后用稀酸调pH至4.8-5.2，趁热过滤去渣。调整 好氮源之后，经连消或实消后发酵。
《柠檬酸发酵机制》课件
厌氧条件
微好氧条件
在微好氧条件下，微生物通过好氧糖 酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，再 经过一系列生物化学反应生成柠檬酸 。
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途 径将葡萄糖转化为丙酮酸，再经过一 系列生物化学反应生成柠檬酸。
柠檬酸发酵的原理
01
糖酵解途径
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸的过程。
医药行业
用于生产抗生素、解热镇痛药等。
其他领域
如环保、化妆品等。
柠檬酸发酵的发展趋势
高效发酵技术
环保生产
通过优化发酵工艺和提高菌种性能，提高 柠檬酸产率。
减少柠檬酸生产过程中的环境污染，实现 绿色生产。
生物工程技术的应用
市场需求变化
利用基因工程和代谢工程手段，改良菌种 性能，提高发酵效率。
随着人们对健康和环保意识的提高，对天 然、健康的食品添加剂需求增加，柠檬酸 作为天然食品添加剂的市场前景广阔。
实验操作步骤与注意事项
菌种接种与培养
按照规定的操作步骤，将菌种接种到培 养基中，控制好温度、湿度、pH等培 养条件。
取样与检测
在发酵过程中按规定时间间隔取样， 检测柠檬酸含量等指标，记录数据。
发酵罐操作
启动发酵罐，控制好罐内压力、温度 、溶氧等参数，确保发酵过程顺利进 行。
异常情况处理
如发现异常情况，如菌种退化、发酵 异常等，应及时采取措施处理，并记 录实验过程。
营养物质的消耗
随着菌体生长和产物生成，发 酵液中的营养物质如葡萄糖逐 渐被消耗。
代谢产物的积累
在适宜的条件下，柠檬酸等代 谢产物在发酵液中积累。
发酵过程控制的方法和策略
温度控制
保持适宜的发酵温度，有利于菌体生 长和产物生成。
柠檬酸发酵实验
糊化
灭菌
接种
摇瓶培养
五、实验结果与讨论 （一）实验结果 要求记录发酵开始0h、20h、42h和发酵结 束时对照组和实验组的变化. (二)思考题 1、实验中为什么不需要糖化完全？ 2、加入CaCO3在培养基中会怎样？为什么 会出现这种情况 3、经EMP途径合成柠檬酸的特点？ 4、经HMP途径合成柠檬酸的特点？
本实验以玉米淀粉为原料,采用黑曲霉经摇 瓶发酵产生柠檬酸,柠檬酸需进一步分离纯化 得到产品.
三、实验仪器及试剂
试剂：玉米淀粉、黑曲霉孢子悬液、α-淀粉 酶、水 仪器：三角瓶 300ml、玻璃棒、电子秤、摇 床、水浴锅、高压灭菌锅、移液管
四、实验步骤
1、试验流程
保藏菌株 活化菌株 α-淀粉酶 玉米淀粉 72h） 糊化液化 灭菌 孢子悬液 接种 300ml三角瓶摇瓶培养（150r.p.m
发酵工艺学实验——
柠檬酸发酵试验
中国海洋大学 食品科学与工程学院
一、实验目的 1、了解柠檬酸发酵的原理及过程； 2、掌握柠檬酸好气发酵操作；
三、实验原理 柠檬酸有称枸枸橼酸，学名2-羟基丙烷三 羧酸或2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，是水果 中含量极为丰富的一种有机酸。柠檬酸因无毒 水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉的 优点，被广泛的应用于食品、医药、化工、洗 涤等工业部门。 能够产生柠檬酸的微生物有很多，青霉、 毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些 菌株都能利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬 酸。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发 酵生产柠檬酸
பைடு நூலகம்
2、按下表的顺序进行实验操作
培养基制备
取两个300ml三角瓶标号，各加入30g淀粉和75ml水 ，搅拌均匀，对照组中加入CaCO3 2g. 两三角瓶内各加入0.6g α-淀粉酶 ，混合均匀后置 于75摄氏度的水浴锅内糊化1h. 将糊化后的三角瓶用八层纱布包扎置于灭菌锅内， 121℃下灭菌20min. 在超净工作台上按无菌操作用已灭菌的10ml移液管 移去10ml孢子悬液加入两三角瓶中. 将接完种的三角瓶，在150r.p.m 72h，在培养过程 中注意定期观察菌丝体生长情况并记录实验现象， 当ph达到2时发酵结束.
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二、柠檬酸及其盐的应用概况
1、在食品工业中的应用
酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱臭剂； 1、饮料 据统计75%～80%的柠檬酸用于饮料工业。 2、果酱与果冻 3、糖果 4、冷冻食品 5、酒类 6、冰淇淋和酸奶 7、脂肪与油 8、腌制品 9、罐头食品和水果加工 10、豆制品和调味品
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸 （GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着 体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到 影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。
国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设 备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现
柠檬酸合成机制是在阐明酒精发酵机制和TCA循环学说 提出的基础上才逐渐弄清楚。 1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1958年，MeDonugh等发现黑曲霉在柠檬酸生产的条件下， 存在HMP途径，且主要存在于孢子形成阶段。 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA 循环
4、在美容品、化妆品中的应用
在发蜡中应用：柠檬酸调节pH和金属离子螯合剂， 柠檬酸与柠檬酸钠配成缓冲溶液保持pH4.5～5.0，增 强发蜡的防腐作用 在洗发剂中的应用：去头皮屑、增加头发的光泽、 恢复头发弹性
生产泡腾型牙齿清洁剂
三、我国柠檬酸生产现状
生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生 产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生 物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡 罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安 徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上
4. 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株
思考题
1、柠檬酸发酵过程中有哪些控制要点，如何控制？
2、说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3、简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。
2、在医药工业中的应用
胃药和收敛剂，主要成分柠檬酸铋钾 泻药：柠檬酸镁，用于X光透视前的清肠和治疗便秘 稳定剂：利用柠檬酸的缓冲能力，维持活性配料的稳 定性，同时可起到防腐作用 掩盖剂：和水果香精合用，掩盖药物的苦味
3、在化学工业中的应用
去垢剂：柠檬酸能增加去污能力，在许多家用去垢剂 产品中可加快生物降解，作为磷酸盐的代用品，大量用 于洗衣粉、去污剂中。 金属净化：柠檬酸是高效鳌合清洗剂，对钙镁铁铜等 污垢有效，广泛用于金属表明的清洗，洗后废水可生物 降解不污染环境。
3. 不分解柠檬酸的菌株
原理：不利分解柠檬酸的菌株，说明其TCA循环中柠檬 酸后续酶的活性较低或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变 株。 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会 使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的 形成。 （为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵 生成柠檬酸的合成途 径是：葡萄糖经 EMP、HMP途径降 解生成丙酮酸，丙酮 酸一方面氧化脱羧生 成乙酰CoA，另一方 面经CO2固定化反应 生成草酰乙酸，草酰 乙酸与乙酰CoA缩合 生成柠檬酸。
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环， 在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛 酸循环被阻断或减弱。 (3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是 由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化 生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮 酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。
抑制，使EMP畅通无阻。 （2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水
合酶失活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法
1. 透明圈大的菌株
平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好
2. 显色圈大小
平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的 不产生ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节， 促进EMP途径畅通。 ②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱 羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸 合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和 异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸
乙醇乙酸
3醋酸 1柠檬酸 生成的柠檬酸一半转化为 异柠檬酸 酵母N源耗尽后开始烷烃 发酵，低浓度AMP抑制 NAD-异柠檬酸脱氢酶的 活性，柠檬酸大量合成并 积累。此时顺乌头酸水合 酶催化反应平衡为：柠檬 酸：异柠檬酸：顺乌头酸 = 90：7：3。细胞质中积 累大量异柠檬酸。
第五章 柠檬酸发酵机制
重点：柠檬酸生物合成途径； 柠檬酸生物合成的代谢调节机制。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。
第一节 概述
一、柠檬酸简介
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，英文文 献俗名citric acid，是生物体主要代谢产物之一。分 子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭、味极酸，易 溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特 点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻 遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内 不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不 可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起： ①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸 逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊 二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分子 乙酰辅酶A，也就是需要1.5 分子的葡萄糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧 系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。