促细胞生长效应试验对牛血清采血年龄段判定的探讨

第24卷总第50期 西北民族大学学报(自然科学版)Vol.24,N o.3 2003年9月 Journal of Northwest University f or Nationalities(Natural Science)Sept,2003

促细胞生长效应试验

对牛血清采血年龄段判定的探讨

李 倬,乔自林,冯玉萍,冯若飞,何志全

(西北民族大学动物科学系,甘肃兰州730030)

[摘 要]本试验用生物工程与技术实验室提供的不同年龄段采取的牛血清,配成含不同血清浓度(2%、4%、6%、8%、10%)的M EM培养液,通过培养SP2/0细胞测定各试验组细胞的最大增殖浓度、倍增时间和克隆率,用以对牛血清采血年龄段的判定 结果显示,不同年龄段的牛血清对SP2/0细胞的促细胞生长效应试验存在差异性 在同一血清浓度下,随着牛采血年龄段的增长,其细胞的最大增殖浓度降低,倍增时间延长,克隆率下降 因此,用该试验方法推断牛血清采血年龄段是可行的

[关键词]促细胞生长效应;牛血清;采血年龄段

[中图分类号]Q5 [文献标识码]A [文章编号]1009-2102(2003)03-0059-04

细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的作用 在细胞培养的过程中,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成分动物血清对细胞的生长繁殖发挥着至关重要甚至是难以替代的作用 牛血清在血清应用中使用最为广泛,是目前细胞培养中用量最大的天然培养基 在牛血清中,胎牛血清品质最高,直接采用还未接触外界的胎牛血清,其中所含抗体、补体等对细胞生长有影响的有害成分最少 随着采血年龄的增加,牛血清中生长因子减少,而血清中抗体、补体等对细胞生长有影响的有害成分也随之增加,这些有害成分能够抑制细胞的生长,因此血清的品质常随采血年龄的增长而降低,利用率也下降 在收购时,鉴别血清原料的采血年龄段,防止成牛血清的参入已是各血清生产企业所共同面临的一个迫切需要解决的问题 本试验通过不同年龄段的牛血清在不同浓度下对SP2/0细胞株培养效果的比较试验,用最大增殖浓度、倍增时间、克隆率等指标来推断样品血清的采血年龄段,既为生产血清的厂家、使用血清的研究单位和生物制品生产企业提供一些参考,也为新生牛血清的生产和质控提供一些参考的依据

1 材料与方法

1.1 原料的准备

1.1.1 供试血清 胎牛血清(H yclone Laboratories,Inc.AKC11608);2h新生牛血清(内蒙古自治区呼和浩特市);6h新生牛血清(内蒙古自治区呼和浩特市);14h新生牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司);6月龄小牛血清1(Hy clone Laboratories,Inc.DDK 0019);6月龄小牛血清2(黑龙江大庆市);1岁龄以上成牛血清(内蒙古自治区呼和浩特市)

[收稿日期]2003-06-10

[作者简介]李倬(1964 ),男,甘肃甘谷人,副教授,从事动物基础医学和生物技术的教学与科研工作

1.1.2 供试细胞和培养液 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)、MEM粉末培养基 以上原料均由西北民族大学生物工程与技术实验室提供

1.2 设备及器械

1.2.1 olympus倒置显微镜、普通显微镜、二氧化碳培养箱(5%~6%CO2)、生物超净工作台、微量加样器、红细胞记数板、96孔细胞培养板、细胞培养瓶、试管、刻度吸管、注射器等

1.2.2 玻璃器皿的处理 上述玻璃器皿须经重铬酸钾 硫酸洗液浸泡过夜,然后用自来水将洗液冲洗干净,再泡24h,然后用超纯水冲洗10次以上,烘干,灭菌

1.3 MEM培养基的配制

9.726%MEM、4mmol/L谷胺酰氨、100IU/m L青霉素、100IU/mL庆大霉素、0.25%的水解乳蛋白、用7.5%碳酸氢钠调pH至7.2~7.4

1.4 试验

1.4.1 血清的处理 在无菌条件下,将7个供试血清0.22um过滤除菌,以备试验用

1.4.2 SP2/0细胞的准备 取一支在液氮中冷冻的SP2/0细胞投入38~39的水浴中,用力摇晃使其在1m in之内溶解,减少在溶解过程中对细胞的损伤 复苏后的SP2/0细胞用生物工程与技术实验室配制好的含血清M EM培养基适应培养2代供试验用

1.4.3 生长曲线、最大增殖浓度、倍增时间 在倒置显微镜下观察选择生长良好的SP2/0细胞,将细胞瓶中的营养液弃去,用M EM培养基将悬浮在细胞壁上的细胞吹打下来并稀释、记数 将供试血清按10%、8%、6%、4%、2%的血清浓度分别加到MEM培养基稀释好的细胞悬液中使细胞浓度为1! 104/mL 充分混匀后在96孔细胞培养板中每孔接种0.2mL,每个试验样接种8孔,置于37、6%CO2培养箱中培养,每24h记数一孔,共记数7d

1.4.4 克隆率 在倒置显微镜下观察选择一生长良好的SP2/0细胞,将细胞瓶中的营养液弃去,用M EM培养基将悬浮在细胞壁上的细胞吹打下来并稀释、记数 将供试血清按8%的血清浓度加到M EM培养基稀释好的细胞悬液中 将SP2/0细胞稀释到5个/mL,分别接种到96孔细胞培养板中,每孔0.2mL,每个供试血清样品接种48孔(B),置于37、6%的CO2培养箱中培养,显微镜观察,一周后记数克隆生成孔数(A)

1.5 计算结果

1.5.1 细胞生长曲线的最高峰值即血清促细胞生长的最大增殖量

1.5.2 血清促细胞生长的细胞倍增时间按公式计算:t=T/N,N=log2Y/X t为细胞倍增时间,Y为细胞峰值前一天的细胞数,X为接种细胞数,T为细胞生长时间

1.5.3 克隆率的计算 克隆率=A/B!100%

2 结果

8%浓度的不同年龄段牛血清对促细胞生长(克隆率测定)试验的结果见表一 不同年龄段牛血清对促细胞(SP2/0细胞株)生长效应影响的结果见表2

表1 SP2/0细胞在8%浓度牛血清试验的克隆率值

供试血清胎牛血清2h牛血清6h牛血清14h牛血清小牛血清小牛血清成牛血清A值(孔)41373832242216

B值(孔)48484848484848

克隆率值85.4%77.1%79.1%66.7%50.0%45.8%33.3%

注:由于实验经费有限,克隆率试验只在8%血清浓度下做了对照试验