葡萄糖氧化酶活力测定(分光度法)
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力-文档资料
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力1 引言葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。
由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。
电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。
傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。
缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。
因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。
本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。
反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。
在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm 波长下的变化速率定量计算出酶活力。
基本反应式为：β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2OH2O2+邻联茴香胺氧化型邻联茴香胺+2H2O1实验部分1.1仪器设备北京瑞利仪器XX公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器XX公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器XX公司BSA224S型分析天平。
1.2实验试剂和材料标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。
测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法
测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法周建芹 , 陈韶华 , 王剑文( 1. 苏州大学医学部药学院 , 江苏苏州215123; 2. 苏州大学医学部实验中心 , 江苏苏州215123 )摘 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖溶液产生的过氧化氢浓度 , 经过标要准曲线转换得到葡萄糖氧化酶的活力。
研究了缓冲液 pH 值、水浴温度、靛蓝胭脂红用量等对葡萄糖氧化酶活力测定的影响。
结果表明 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶活力时 , 缓冲液最佳 pH 值为 4、最佳水浴温度为100 ℃、靛蓝胭脂红最佳用量为 1.3 mL。
此方法的重现性较好 , 反应系统较稳定。
葡萄糖氧化酶在自然界中普遍存在 , 在食品、医药和发酵等工业生产及分析检测中用途广泛 , 是高等院校生物化学、酶学和酶工程等相关实验课程中经常选用的一种重要的模式酶。
在有氧情况下 , 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和过氧化氢 : 葡萄糖 + O2 葡萄糖酸 + H2 O2 。
测定葡萄糖氧化酶活力常用的方法有 2 种。
一种是滴定法 , 即用碱滴定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的葡萄糖酸 , 这种方法误差比较大 , 灵敏度比较低 , 尤其是葡萄糖含量比较低时。
另一种是利用葡萄糖氧化酶—辣根过氧化物酶—苯胺衍生物或染料隐性体偶联反应体系测定。
过氧化物酶在有氧存在时 , 催化葡萄糖氧化、生成的过氧化氢分解 , 分解出的氧又将苯胺衍生物或染料隐性体(如邻 - 联二茴香胺 ) 氧化变成红色或棕色物质 , 颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。
这种方法非常灵敏 , 但也存在显色物质不稳定、在 1 m in内有明显褪色、数据重复性不好等不足 , 而且因为要与辣根过氧化物酶联用 , 因此这个方法比较昂贵 , 增加了测定成本。
葡萄糖氧化酶活力测定的困难限制了其在学生实验及课外科研项目中的应用 , 因此寻找一种廉价、简便并且灵敏度高的活力测定方法很有意义。
葡萄糖(Glu)测定氧化酶法标准操作程序SOP文件
生成的醌亚胺的颜色深浅与样品中葡萄糖浓度成正比。
3 标本
血清及肝素/EDTA抗凝血浆，处理方法见标本准备。
稳定性：15－25℃8小时
2-8℃72小时
收集后的标本应该尽快检测，或者与细胞进行分离。
4 试剂
4.1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剂
来源：ROCHE配套试剂（详见试剂说明书）。
血糖降低：生理性血糖过低见于妊娠期、哺乳期、饥饿及长期剧烈体力劳动后。病理性血糖过低常见于过量的胰岛素治疗，胰岛细胞增生或瘤，严重肝病及对抗胰岛素的激素分泌不足。
12 危急值
成人女性和婴儿：<2.2或>22.2mmol/L
成人男性：>22.2或<2.7 mmol/L
新生儿：<1.6或>16.6 mmol/L
血糖增高:生理状态下，饱食后或运动后有一过性的血糖增高，注射葡萄糖、肾上腺素及精神紧张可使血糖升高。病理性升高多见于糖尿病。其它内分沁系统
ABCD医院
生化实验室
文件编号：
ABCD-SOP-04-23
葡萄糖（Glu）测定氧化酶法
版序：ABCD
页码：第3页，共3页
的疾病，如甲状腺机能亢进、垂体前叶嗜酸性细胞腺瘤、肾上腺皮质功能亢进、嗜铬细胞瘤、垂体前叶嗜碱性细胞机能亢进症等。
Measurement POINT(1)[34]
TECHNICAL LIMIT(HIGH) [ 25.2 ]
POINT(2)[ 0]
CALIBRATION METHOD [ LINEAR ]
POINT(3)[ 0 ]
CALIBRATION POINT [ 2 ]
葡萄糖氧化酶法测定血糖
900
900
测定管
12 900
900
2. 比色测定：用空白管溶液调零，测定吸光 度(OD500)。
3. 计算： 葡萄糖浓度(mmol/L) = [样品OD/标准管
OD]×标准品葡萄糖浓度
五、注意事项
1. 必须在线性范围内测定： 0.02-20 mmol/L，浓度超 过20 mmol/L用蒸馏水或生理盐水稀释1:2倍后测量；
量程100-1000ul 加样器 配蓝色枪尖 量程0.5-10ul 加样器配白色小枪尖
1.按照下表加样(桔色标记为试剂的简写)
蒸馏水(μl) ddH2O 标准品(μl) ＳS 样品(μl) B S 反应工作液(μl)2
900
900
37℃孵育15min
二. 实验原理
葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理：
根据Trinder反应原理,葡萄糖在葡萄糖氧化酶 (GOD)作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)； 然后用过氧化物酶(POD)催化过氧化氢，使色 原物质(4-氨基安替比林)生成醌亚胺，由无色 变成粉红色，颜色的深浅与葡萄糖浓度成正比， 在500－505nm处有最大吸收 值。
三、试剂 1.葡萄糖标准品 SS: 5.55 mmol/L； 2.反应工作液WS : 磷酸盐缓冲液，3,5-二氯-2-羟基苯
磺酸钠(DHBS)，葡萄糖氧化酶(GOD)，过氧化物酶 (POD)，色原物质(4-氨基安替比林)； 3.待测血清：B S 4. 蒸馏水。ddH2O 实验仪器：可见光分光光度计，水浴锅，微量加样器
1.学习分光光度计的原理及使用方法 2. 掌握葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)-过氧化物
酶(peroxidase,POD)测定血糖浓度的原理。
葡萄糖氧化酶的活力测定实验报告
葡萄糖氧化酶的活力测定实验报告葡萄糖氧化酶酶活测定葡萄糖氧化酶酶活测定1 酶活单位与定义pH6.0、30℃的条件下，每分钟能把 1.0μmol 的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2 的酶量为一个单位。
2 测定原理葡萄糖和氧反应，在葡萄糖氧化酶的作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。
3 试剂和溶液3.1 磷酸盐缓冲液（pH6.0）称取16.61g 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O ）和35.82g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），溶于无CO2 的水中，稀释到1000ml。
3.2 邻联茴香胺甲醇缓冲液1g 邻联茴香胺加在100ml 甲醇中搅拌溶解备用。
临用时现配，取0.1ml 加入到上述缓冲液12ml 中混匀。
3.3 180g/l 葡萄糖水溶液18g 葡萄糖加适量水溶解，并定容至100ml。
3.4 0.03%辣根过氧化物酶液称取辣根过氧化物酶（HRP,美国Ameresco 公司）10mg，溶于30ml 蒸馏水。
4 仪器设备721-分光光度计、恒温水浴、秒表5 分析步骤5.1 待测酶样品的处理将待测酶样做适当稀释后进行试验，使得测定△A 值在0.25～0.4。
5.2 测定6 结果表示与计算X=[△A÷（11.3×t×0.1）] ×nt—测定时间，min0.1—样品体积，ml11.3—消光系数n—稀释倍数所得结果表示至整数。
篇二：葡萄糖测定-葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶法测定血清（浆）葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶(glucose oxidase ，GOD) 利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。
过氧化物酶(peroxidase ，POD) 在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4- 氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder 反应。
17 生物化学实验--葡萄糖氧化酶法测定血糖含量
葡萄糖氧化酶法测定血糖含量【目的】1 ．掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验方法。
2 ．熟悉葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验原理。
【原理】葡萄糖氧化酶（ GA ）对β-D- 葡萄糖的特异性的很强。
溶液中的葡萄糖有α-D- 葡萄糖和β-D- 葡萄糖两型，二者处于动态平衡。
当β-D- 葡萄糖不断受酶催化而减少时，α-D- 葡萄糖便依靠平衡移动，全部转变为β-D- 葡萄糖参与反应。
GA 催化β-D- 葡萄糖分子中的醛基氧化生成葡萄糖酸和 H 2 O 2 ，后者在过氧化物酶（ PA ）作用下放出氧，其可将色原性氧受体“4- 氨基安替吡啉偶联酚” 的酚氧化，并与 4- 氨基安替吡啉缩合生成红色化合物，其反应如下。
于505nm 与同样处理的标准葡萄溶液比色，可测得葡萄糖含量。
【器材】1 ．分光光度计2 ．恒温水浴3 ．微量加样器4 ．刻度吸量管5 ．中号试管【试剂】1 ． 0.01mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液无水 Na 2 HPO 4 18.5g 和 KH 2 PO 4 5.3g 溶于 800ml 蒸馏水中，用少量 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 调 pH 至 7.0 ，再加蒸馏水稀释至 1L 。
2 ．酶试剂取 GA1200 单位、 PA1200 单位， 4- 氨基安替吡啉 10mg 、叠氮钠 100mg ，加上述磷酸盐缓冲液至 80ml 左右，调 pH 至 7.0 ，再加同上缓冲液至 100ml ，混匀。
冰箱内保存可稳定 3 个月。
3 ．酚试剂酚 100mg 溶于 100ml 蒸馏水中。
因酚易在空气中氧化成红色，可先配制成 50g /dl ，贮棕色瓶中，用前稀释。
4 ．酶 - 酚混合试剂将试剂 2 、 3 等量混合。
冰箱内保存可稳定 1 个月。
5 ．葡萄糖标准贮存液（ 20mg/ml ）无水 D- 葡萄糖于80 ℃ 烤箱内干燥恒重，冷却后，称取 2.0g 以 0.25% 苯甲酸溶解、稀释定容至 100ml 。
葡萄糖氧化酶检测的金标准
葡萄糖氧化酶检测的金标准引言葡萄糖氧化酶是一种重要的酶，在临床诊断和生物化学研究中具有广泛的应用价值。
本文将详细探讨葡萄糖氧化酶检测的金标准，包括其定义、检测方法、应用领域和意义等方面的内容。
什么是葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶是一种催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸的酶，它是细胞内氧化磷酸化过程中不可缺少的催化剂。
它能将葡萄糖与辅酶NAD+反应，产生葡萄糖酸和还原型辅酶NADH。
葡萄糖氧化酶可以通过可以通过测定还原型辅酶NADH的生成速率来测定葡萄糖的含量。
葡萄糖氧化酶检测的方法葡萄糖氧化酶检测的方法有很多种，常用的方法包括光度法、荧光法和电化学法等。
这些方法基于葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的特性，通过测定还原型辅酶NADH的光学或电化学特性来间接测定葡萄糖的含量。
光度法光度法是一种常用的葡萄糖氧化酶检测方法。
它利用葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的吸光度变化来测定葡萄糖的含量。
通常使用紫外光谱法或可见光谱法来测定还原型辅酶NADH的吸光度，然后通过与已知浓度的标准葡萄糖溶液比较来计算未知样品中葡萄糖的含量。
荧光法荧光法是另一种常用的葡萄糖氧化酶检测方法。
它利用葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的荧光特性来测定葡萄糖的含量。
通过测定还原型辅酶NADH所发射的荧光强度或荧光寿命来计算葡萄糖的含量。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的优点，常用于生物医学研究和药物检测等领域。
电化学法电化学法是葡萄糖氧化酶检测的另一种常用方法。
它利用葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的电化学特性来测定葡萄糖的含量。
通过将还原型辅酶NADH 在电极上氧化还原的电流变化来计算葡萄糖的含量。
电化学法具有高灵敏度和高选择性的优点，常用于生物传感器和医学诊断等领域。
葡萄糖氧化酶检测的应用领域葡萄糖氧化酶检测在临床诊断和生物化学研究中具有广泛的应用。
它可以用于血糖监测、糖尿病诊断、食品安全检测和生物传感器等领域。
测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法
测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法
周建芹;陈韶华;王剑文
【期刊名称】《实验技术与管理》
【年(卷),期】2008(025)012
【摘要】利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖溶液产生
的过氧化氢浓度,经过标准曲线转换得到葡萄糖氧化酶的活力.研究了缓冲液pH值、水浴温度、靛蓝胭脂红用量等对葡萄糖氧化酶活力测定的影响.结果表明:利用靛蓝
胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶活力时,缓冲液最佳pH值为4、最佳水浴温度为100℃、靛蓝胭脂红最佳用量为1.3 mL.此方法的重现性较好,反应系统较稳定.
【总页数】3页(P58-60)
【作者】周建芹;陈韶华;王剑文
【作者单位】苏州大学,医学部药学院,江苏,苏州,215123;苏州大学,医学部实验中心,江苏,苏州,215123;苏州大学,医学部药学院,江苏,苏州,215123
【正文语种】中文
【中图分类】R331
【相关文献】
1.一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法 [J], 任婷月;周万里;张利群;毕春元;李敬龙
2.黑曲霉ZM-8菌株菌丝体中葡萄糖氧化酶活力测定 [J], 马建忠;刘金鸽;王永刚;
火文
3.小檗碱和黄芩苷对葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量干扰作用研究 [J], 涂秀英;李瑛;魏学鑫;于梅;徐国良;章常华
4.葡萄糖氧化酶法用于测定糖尿病患者口服葡萄糖耐量试验的研究 [J], 左晓红;王文
5.一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法 [J], 惠瑶瑶; 郑斐; 王倩楠; 安贤惠
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
d-葡萄糖底物uv分光光度法 酶活测定方法
葡萄糖底物UV分光光度法是一种用于测定酶活的常见方法。
本文将介绍葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及其在生物化学和生物医学研究中的应用。
一、原理1. 葡萄糖酶（也称葡萄糖氧化酶）能够催化葡萄糖与氧气在水溶液中发生氧化反应，生成葡萄糖内酯和过氧化氢。
这个氧化反应是可以通过UV分光光度法测定的。
2. 葡萄糖底物UV分光光度法的原理是通过测定在酶催化下葡萄糖与氧气反应所产生的过氧化氢的浓度变化来间接测定酶的活性。
二、步骤1. 样品处理：将待测样品中的葡萄糖与底物混合，使底物的浓度在一定范围内，以确保底物的过量不会影响酶的活性测定。
2. 加入酶液：将一定量的葡萄糖酶加入混合液中，并在一定温度下孵育一段时间，使酶与底物发生反应。
3. 反应停止：加入一种化学试剂使反应停止，同时转化过氧化氢形成一种有色产物。
4. 测定吸光度：使用紫外-可见分光光度计测定产生的有色产物的吸光度，根据标准曲线计算出反应体系中的过氧化氢的浓度。
5. 计算酶活：根据过氧化氢的浓度变化和所加的酶的蛋白质含量等数据，计算出酶的活性。
三、应用1. 生物化学研究中的应用：葡萄糖底物UV分光光度法广泛应用于酶动力学研究中，可以用来测定各种酶的活性及其对底物的亲和力。
2. 生物医学研究中的应用：在生物医学研究中，葡萄糖底物UV分光光度法可以用来研究酶与疾病的关联性，例如糖尿病患者血清中的葡萄糖酶活性与血糖水平的关系。
结论葡萄糖底物UV分光光度法是一种简单、敏感、精确的酶活测定方法，具有广泛的应用前景和重要的科研意义。
通过对葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及应用进行了解和掌握，可以更好地指导实验操作并推动生物化学和生物医学领域的研究进展。
近年来，随着生物技术的不断发展，葡萄糖底物UV分光光度法在生物医学研究中的应用越发广泛。
除了用于酶动力学研究和疾病相关性分析外，葡萄糖底物UV分光光度法还在其他领域展现出了巨大的潜力。
1. 新药研发在新药研发过程中，葡萄糖底物UV分光光度法被用于筛选潜在的药物候选化合物。
生物化学：葡萄糖测定(酶法)
葡萄糖氧化酶法
1
【实验要求】
1. 掌 握 掌 握 血 糖 测 定 葡 萄 糖 氧 化 酶 法 （ GODPOD法）的原理，操作方法 2.熟悉葡萄糖测定的临床意义； 3.巩固分光光度计的使用。
2
【实验原理】
葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖 酸，并产生过氧化氢。在过氧化氢酶（POD）及色原性 受体4-氨基安替比林（4-AAP）的存在下，过氧化氢释 放氧使色素原氧化生成红色醌类化合物。醌的生成量与 葡萄糖成正比，在波长520nm处比色，求得葡萄糖含量。
7
【临床意义】
3.生理性或暂时性低血糖 见于饥饿、剧烈运动、注射胰岛 素后、妊娠和服用降糖药后。 4.病理性低血糖 见于(1)胰岛β细胞增生瘤等，使胰岛素分 泌过多；(2)对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能 减退，肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、 肾上腺皮质激素分泌减小；(3)严重肝病患者，由于肝脏储 存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。
8
【注意事项】
1、注意准确的加入所需要的液体量。 2、注意胆红素、谷胱甘肽、尿酸和维生素C等一些还 原性物质将使结果受到干扰。
9
【打扫卫生】
1、实验结束后对自己用过的试管、移液管等物 品进行清洗。 2、打扫桌面与地面卫生。 3、带齐本人物品，离开实验室。
10
谢 谢！
11
【计算】
血清葡萄糖（mmol/L）＝ Au Cs As
Au:测定管吸光度 As:标准管吸光度 Cs:标准管浓度
5
【参考范围】
血清葡萄糖：3.89～6.11 mmol/L
6
【临床意义】
1.生理性高血糖 见于饭后1～2h，注射葡萄糖或摄入高糖 食物后、情绪紧张肾上腺素分泌增加时，但不应超过 10mmol/L。 2.病理性高血糖 见于(1)内分泌腺功能障碍能引起高血糖， 如胰腺β细胞损害导致胰岛素分泌缺乏，血糖可超过正常， 临床上称为糖尿病。其他内分泌疾病引起的各种对抗胰岛 素的激素分泌增加也会出现高血糖；(2)颅内压增高：颅内 压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等； (3)由于脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等可使血 糖轻度增高。
分光光度计检测葡萄糖
如何用分光光度计检测食品中的葡萄糖1、分析原理：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。
通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。
2、仪器：722分光光度计。
3、试剂：除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1）乙醇。
（2）40%三氯乙酸：称取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀释至100ml。
（3）2 mol/LNaOH 溶液：称取8gNaOH，用水溶解并稀释至100ml。
（4）1 %邻联甲苯胺溶液：称取0.1g 邻联甲苯胺溶解于10ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4℃冰箱保存。
（5）乙酸缓冲液（pH5.0）：称取14.28g乙酸钠（CH3COONa•3H2O）溶于水中，加入2.7ml冰乙酸，并调节pH5.0，用水定容至1L。
（6）葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma公司）用水溶解，使酶含量为100U/ml。
4℃冰箱保存一周。
（7）过氧化物酶溶液：0.010g 辣根过氧化物酶溶于10ml 水中，4℃冰箱保存一周。
（8）酶溶液：取100ml乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1ml，混匀。
4℃冰箱可保存七周。
（9）酶空白液：取100ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1ml，混匀。
4℃冰箱保存一周。
（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）（10）葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品（纯度大于99%）于80℃干燥至恒量。
精确称取0.050g，用水移入100ml 容量瓶中，定容至刻度线。
相当于浓度为0.5mg/ml。
4.操作步骤之样品的处理：（1）固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，/加入50ml水后沸水浴15min。
冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。
反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒说明书
货号：QS1403 规格：50管/48样葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：GOD（EC 1.1.3.4）广泛存在于动物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生H 2O2，是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。
测定原理：GOD催化产生H2O2，过氧化物酶在有氧存在时催化H2O2分解产生的氧又将邻联茴香胺氧化生成有色物质，颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水试剂的组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体40 mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体8 mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体2 mL×1支，4℃保存；样品测定的准备：组织处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至500nm，蒸馏水调零。
2、GOD检测工作液的配制：用时将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混匀，待用；用不完的试剂4℃可保存一周；3、测定前将GOD检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
4、在1mL玻璃比色皿中加入40μL样本和960μL工作液，立即混匀并计时，记录500nm下20s吸光值A1和1min20s后的吸光值A2。
计算ΔA＝A2-A1。
GOD活力单位的计算：1、血清（浆）GOD活力的计算单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
GOD（nmol/min/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=3333×ΔA2、动物组织GOD活力的计算（1）按蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
实验血糖测定葡萄糖氧化酶法
实验血糖测定（葡萄糖氧化酶法）【目的】体外测定血清或血浆中葡萄糖含量。
【临床意义】葡萄糖的正确测定对于诊断高血糖症是十分重要的。
平时在查找这些病症的来由时，还将各种耐量试验和控制试验与葡萄糖测定一同进行。
葡萄糖含量增高见于：糖尿病、葡萄糖摄入过分、柯兴氏综合症、脑血管不测。
葡萄糖含量减少见于：胰岛瘤、胰岛素过分、先天性碳水化合物代谢阻挡。
【原理】样本中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将还原性 4- 氨基安替比林与酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。
【器材】紫外分光光度计，恒温水浴箱，移液器（枪），枪头，试管【药品】葡萄糖测定试剂盒，试剂盒主要成分与浓度：试剂主要成分实验浓度R1葡萄糖氧化酶（ GOD）≥ 13000U/L过氧化物酶（ POD）≥ 900U/LR2磷酸缓冲液（）100mmol/L酚11mmol/L4- 氨基安替吡啉L葡萄糖标准液L(100mg/dl)【样本】新鲜无溶血血清。
【步骤】将10ml R1与90ml R2混杂均匀，即为工作液。
空白管校准管样品管工作液ml ml ml蒸馏水ml————校准液——ml——样品————ml 分别混杂均匀， 37℃水浴 10～15分钟（防备太阳光直射），用波长505nm、比色杯光径，用空白管调“零”点测定各管的吸光度（A）值。
【计算】【参照值】血清 / 血浆：— mmol/L (70 —110 mg/dl) 。
此范围仅供参照，各实验室须建立本室的参照值范围。
【参照文件】1．全国临床检验操作规程（第二版），主编：叶应妩，王敏三， 1997，P616.2．Trinder P. Ann Clin Biochem，1969，6: 24-27.血糖测定实验所需器材：1.紫外分光光度计（比色杯光径），2.恒温水浴箱（能调温度的， 37℃），3.移液器（枪）（规格 6 个， 20μl 6 个），枪头各 100个4.试管 50支， 6个试管架5.烧杯 100ml一个， 50ml（或 25ml） 6个6.记号笔 6支7.蒸馏水 1瓶。
一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法
一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法任婷月;周万里;张利群;毕春元;李敬龙【摘要】采用SBA-40C型生物传感分析仪建立了一种葡萄糖氧化酶活力的快速测定方法.利用生物传感分析仪检测葡萄糖质量浓度的工作原理,葡萄糖氧化酶专一性地与β-D-葡萄糖反应,产生的过氧化氢在过氧化氢电极表面上发生电子转移,内置电子元件将电信号转变为数字信号,用已知活性单位的葡萄糖氧化酶作为测定标准定标后,即可在仪器上直接测出待测样品的葡萄糖氧化酶活性单位.结果表明:利用生物传感分析仪测定葡萄糖氧化酶活力时,缓冲液最佳pH为6.5,测定时间20 s,操作周期小于60 s,连续10次测定RSD值为0.63％,0 ～ 100 U/mL的范围内线性良好,r=0.999 1.该方法专一性高、简便、快速、准确、重复性好,适用于样品数目较多的葡萄糖氧化酶活力的快速测定.%The purpose of our work was to establish a method for determination of glucose oxidase activity using SBA-40C biosensor analyzer.This novel method was based on the working principle of the SBA-40C biosensor analyzer to detect the contents of glucose.That is,glucose oxidase specifically reacted withβ-D-glucose and produced hydrogen peroxide,then electron transfer occurred on the surface of Peroxide hydrogen electrode,after that the built-in electronic components turned electrical signals into digital signals.A known unit of glucose oxidase was used as measurement standard,the glucose oxidase activity of the tested sample can be detected on the SBA-40C biosensor analyzer directly.Results showed that optimum reaction pH was 6.5,measurement time was 20s,and the operation period was less than 60 s.The RSD value of 10 consecutive was 0.63％,and 0 ～ 100 U/mL was within the scope oflinear good,r =0.9991.The method is special,simple,rapid,accurate,and reproducible,which was suitable for determination of glucose oxidase activity with numerous samples.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2015(041)001【总页数】4页(P212-215)【关键词】葡萄糖氧化酶;生物传感分析仪;过氧化氢电极【作者】任婷月;周万里;张利群;毕春元;李敬龙【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院,山东济南,250353;山东省科学院生物研究所山东省生物传感器重点实验室,山东济南,250014;山东省科学院生物研究所山东省生物传感器重点实验室,山东济南,250014;山东省科学院生物研究所山东省生物传感器重点实验室,山东济南,250014;齐鲁工业大学生物工程学院,山东济南,250353【正文语种】中文葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种氧化还原酶，在O2充足条件下，它能够快速专一地催化β-D-葡萄糖为β-D-葡萄糖酸和 H2O2［1］。
血糖的定量测定(葡萄糖氧化酶法)
实验目的及要求
掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理 和方法。
学会取液器及自外可见分光光度计的使用
实验原理
D-葡糖糖
GOD
D-葡萄糖酸
+ H2O2
H2O2+4-AAP+苯酚POD红色醌化物+H2O
实验仪器及试剂
试管 移液管 UNICO-2000型分光光度计 恒 温水浴锅
3 样本在4℃-8℃可稳定24h,样本放置时间过 长会使结果偏低。
—— 1.50 1.50
测定管 ——
1.50 1.50
混匀，37℃保温15min，以空白管调零， 505nm波长处测定各管吸光度值。
计算 血糖含量=A样/A标×标准溶液浓度
[实验注意事项]
1 分离血清要求使用未溶血样品，否则测定 结果偏大。
2要求在30 min内分离血清，糖酵解在全血 中以7%/h进行。
酶试剂：葡萄糖氧化酶（GOD）过氧化物 酶（POD） 4-氨基安替吡啉（4-AAP）
酚试剂：苯酚 标准葡萄糖溶液：100 mg/dL (5.55 mmol/L)
实验步骤
按下表加入各反应物：
加入物 （ml）
空白管
葡萄糖标准
酚试剂
1.50
标准管
0.020
葡萄糖氧化酶法
葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶法是指将葡萄糖（Glc）作为底物，由某种特殊酶（G6Pase）催化氧化而产生氢氧化物（H2O2），该反应又称为微量氢氧化物（MDA）生成反应。
由于葡萄糖氧化酶法具有灵敏度高、反应时间短、反应简便、检测量程广等特点，近些年来在生物医药领域的研究应用越来越广泛，因此对于葡萄糖氧化酶法的介绍显得尤为重要。
一、葡萄糖氧化酶法的原理葡萄糖氧化酶法是通过由某种特殊酶（G6Pase）催化葡萄糖氧化而产生氢氧化物（H2O2），再由过氧化氢酶（H2O2ase）催化H2O2反应，最后将H2O2转化为电荷被电极检测，测定其等效电导率，来判断溶液中glc浓度。
该过程简称为G6Pase-H2O2ase流程。
二、葡萄糖氧化酶法的性能特点①灵敏度高。
以G6Pase酶为催化剂利用葡萄糖氧化酶法检测浓度非常低的葡萄糖，其灵敏度可达1μM。
②反应时间短。
由于采用了G6Pase酶催化葡萄糖氧化，所以在H2O2ase催化下，在室温下其反应时间仅为几分钟。
③反应简便。
葡萄糖氧化酶法的解决方案简单，只需要简单的试剂和仪器，实验过程也很简单，不用配制和稳定各种溶液，只需几步就可完成检测。
④检测量程广。
葡萄糖氧化酶法可从0.5μM到10.0mM范围内检测葡萄糖浓度。
三、葡萄糖氧化酶法的实际应用葡萄糖氧化酶法广泛应用于药物研发、疾病检测以及抗病毒活性等领域，由于其具有灵敏度高、反应时间短、反应简便以及检测量程广等特点，受到了广大科研人员的关注。
（1）药物研发。
葡萄糖氧化酶法可以方便快捷地检测药物活性，从而为药物研发提供重要依据。
（2）疾病检测。
葡萄糖氧化酶法可用于检测血液中的葡萄糖浓度，可以快速有效地诊断糖尿病。
（3）抗病毒活性的检测。
葡萄糖氧化酶法可用于检测抗病毒药物的活性，以便快速有效地诊断抗病毒药物的抗病毒活性。
综上所述，葡萄糖氧化酶法的发展为广大科研人员提供了一种新的检测技术，在药物研发、疾病检测以及抗病毒活性等领域均有着重要的应用价值。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
葡萄糖氧化酶活力测定（分光度法）
1.原理
（1）葡萄糖氧化酶的催化特性：葡萄糖氧化酶的每个酶分子中含有两单位FAD （黄素腺嘌呤二核苷酸），作为受氢体催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生过氧化氢。
C6H12O6+O2=氧化酶C6H12O7+H2O2
在一定时间内葡萄糖经氧化酶催化发生反应后，测定其反应液的过氧化氢浓度即可算出葡萄糖氧化酶的活力。
（2）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢在一定pH值的缓冲溶液中和加热条件下能使靛蓝胭脂红发生褪色反应，并且其反应速度在一定范围内和过氧化氢浓度成正比，据此测定出产生的过氧化氢的量，进而计算出葡萄糖氧化酶活力。
（3）首先利用一系列浓度的过氧化氢标准溶液与靛蓝胭脂红反应，在615nm波长处测定吸光度，建立标准曲线。
然后，作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应，再取其反应液与一定浓度的靛蓝胭脂红溶液反应随后测定其在615nm波长处测定吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程后可推算出氧化酶活力。
2药品
（1）0.2mol/L葡萄糖溶液:称取3.96g一水葡萄糖定容于100.00mL冷藏3小时备用，2天内有效。
（2）1．0×10-3mol/L靛蓝胭脂红溶液：称取0.466g靛蓝胭脂红定容于1000mL。
（2）0.2M醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=5.2)：称取16.16g三水醋酸钠及2.48g冰醋酸定容至1000mL
（4）12mg/L过氧化氢标准溶液：准确称取0.040g 30%的过氧化氢溶液（过氧化氢需事先标定取实际值）定容于1000mL。
3实验方法
（1）标准曲线的绘制
准确吸取0、1、2、3、4、5、6mL过氧化氢标准溶液(12mg/L)，分别置于
25mL比色管中，加人1.3mL靛蓝胭脂红溶液(1．0×10-3mol/L)和3．0mL乙酸一乙酸钠缓冲液，再加人蒸馏水稀释至25mL配成含有过氧化氢0.00mg/L、0.48 mg/L、0.96 mg/L、1.44 mg/L、1.92 mg/L、2.40 mg/L、2.88 mg/L的溶液，于沸水浴中加热13min后，用流水冷却比色管5min。
用1cm比色皿，以蒸馏水作参比，在波长615nm处测定其吸光度，以吸光度对过氧化氢浓度作图（分光度作横坐标，过氧化氢浓度为丛坐标）得标准曲线方程。
（2）按酶活大小称取适量葡萄糖氧化酶以醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至约6U/mL 的浓度，某些酶产品水溶性很差，加稀释液混均定容好后需过滤取滤清夜测定。
（3）将稀释好的酶液置于37℃水浴中计时保温5分钟。
（4）吸取2.00mL葡萄糖溶液置于比色管中，将其放入37℃水浴中计时保温5分钟。
（5）保温时间到后吸取2.00mL酶稀释液加入上述预放有2.00mL葡萄糖溶液的比色管中混匀，保温反应10分钟。
（6）取出比色管转置于冰浴中，同时取一25mL具塞比色管中，分别加入乙酸一乙酸钠缓冲溶液3．0 mL和1.3mL的靛红溶液，再加入1mL的上述反应液，稀释至刻度，于沸水浴中加热13min后，取出用流水冷却5min，终止反应。
（7）用1cm比色皿，在波长615nm处，以蒸馏水作参比，测定其吸光度A0。
（8）空白样测定时，先加三氯醋酸后加酶稀释液，其余各步凑相同。
4计算
葡萄糖氧化酶活力定义为：37℃条件下，1min内催化葡萄糖反应产生1μg过氧化氢（H2O2）所需的酶量为1U。
X0=（(A-A0)*K+C0）*25*10-3*103*（4/1）*（1/2）/10
＝（(A-A0)*K+C0）*5
X= X0*N/m
X0：酶稀释液的酶浓度，U/mL
A：样液的吸光度值
A0：样液的吸光度值
K：标准曲线的斜率
C0：标准曲线的截距
25：反应液稀释25倍
10-3：单位换算，毫升转为升
103：单位换算，毫克转为微克
4/1：从4毫升反应液中吸取1毫升用于分光度测定1/2：取2毫升酶稀释液用于测定
10：反应时间，分钟
X：葡萄糖氧化酶样品的酶活，U/g
N：酶粉的稀释倍数
m：称取的酶粉重量，g。