葡萄糖氧化酶活力测定(分光度法)
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葡萄糖氧化酶活力测定(分光度法)
1.原理
(1)葡萄糖氧化酶的催化特性:葡萄糖氧化酶的每个酶分子中含有两单位FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸),作为受氢体催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并产生过氧化氢。
C6H12O6+O2=氧化酶C6H12O7+H2O2
在一定时间内葡萄糖经氧化酶催化发生反应后,测定其反应液的过氧化氢浓度即可算出葡萄糖氧化酶的活力。
(2)葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢在一定pH值的缓冲溶液中和加热条件下能使靛蓝胭脂红发生褪色反应,并且其反应速度在一定范围内和过氧化氢浓度成正比,据此测定出产生的过氧化氢的量,进而计算出葡萄糖氧化酶活力。
(3)首先利用一系列浓度的过氧化氢标准溶液与靛蓝胭脂红反应,在615nm波长处测定吸光度,建立标准曲线。然后,作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应,再取其反应液与一定浓度的靛蓝胭脂红溶液反应随后测定其在615nm波长处测定吸光度,将吸光度值代入标准曲线方程后可推算出氧化酶活力。
2药品
(1)0.2mol/L葡萄糖溶液:称取3.96g一水葡萄糖定容于100.00mL冷藏3小时备用,2天内有效。
(2)1.0×10-3mol/L靛蓝胭脂红溶液:称取0.466g靛蓝胭脂红定容于1000mL。(2)0.2M醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=5.2):称取16.16g三水醋酸钠及2.48g冰醋酸定容至1000mL
(4)12mg/L过氧化氢标准溶液:准确称取0.040g 30%的过氧化氢溶液(过氧化氢需事先标定取实际值)定容于1000mL。
3实验方法
(1)标准曲线的绘制
准确吸取0、1、2、3、4、5、6mL过氧化氢标准溶液(12mg/L),分别置于
25mL比色管中,加人1.3mL靛蓝胭脂红溶液(1.0×10-3mol/L)和3.0mL乙酸一乙酸钠缓冲液,再加人蒸馏水稀释至25mL配成含有过氧化氢0.00mg/L、0.48 mg/L、0.96 mg/L、1.44 mg/L、1.92 mg/L、2.40 mg/L、2.88 mg/L的溶液,于沸水浴中加热13min后,用流水冷却比色管5min。
用1cm比色皿,以蒸馏水作参比,在波长615nm处测定其吸光度,以吸光度对过氧化氢浓度作图(分光度作横坐标,过氧化氢浓度为丛坐标)得标准曲线方程。
(2)按酶活大小称取适量葡萄糖氧化酶以醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至约6U/mL 的浓度,某些酶产品水溶性很差,加稀释液混均定容好后需过滤取滤清夜测定。(3)将稀释好的酶液置于37℃水浴中计时保温5分钟。
(4)吸取2.00mL葡萄糖溶液置于比色管中,将其放入37℃水浴中计时保温5分钟。
(5)保温时间到后吸取2.00mL酶稀释液加入上述预放有2.00mL葡萄糖溶液的比色管中混匀,保温反应10分钟。
(6)取出比色管转置于冰浴中,同时取一25mL具塞比色管中,分别加入乙酸一乙酸钠缓冲溶液3.0 mL和1.3mL的靛红溶液,再加入1mL的上述反应液,稀释至刻度,于沸水浴中加热13min后,取出用流水冷却5min,终止反应。(7)用1cm比色皿,在波长615nm处,以蒸馏水作参比,测定其吸光度A0。(8)空白样测定时,先加三氯醋酸后加酶稀释液,其余各步凑相同。
4计算
葡萄糖氧化酶活力定义为:37℃条件下,1min内催化葡萄糖反应产生1μg过氧化氢(H2O2)所需的酶量为1U。
X0=((A-A0)*K+C0)*25*10-3*103*(4/1)*(1/2)/10
=((A-A0)*K+C0)*5
X= X0*N/m
X0:酶稀释液的酶浓度,U/mL
A:样液的吸光度值
A0:样液的吸光度值
K:标准曲线的斜率
C0:标准曲线的截距
25:反应液稀释25倍
10-3:单位换算,毫升转为升
103:单位换算,毫克转为微克
4/1:从4毫升反应液中吸取1毫升用于分光度测定1/2:取2毫升酶稀释液用于测定
10:反应时间,分钟
X:葡萄糖氧化酶样品的酶活,U/g
N:酶粉的稀释倍数
m:称取的酶粉重量,g