004破骨细胞培养及鉴定
骨质疏松实验室检查与鉴别诊断
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骨质疏松症 实验室指标与鉴别诊断
一.实验室指标 二.鉴别诊断
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鉴别诊断
❖ （一）骨质疏松症的诊断标准
❖ 根据 WHO 建议的诊断标准， 与同性别、同种族的健康成人 骨峰值比较，如果骨密度下降在一个标准差以内，为正常骨 量，下降在一个标准差到 2.5 个标准差以内诊断为骨量低下， 下降大于 2.5 个标准差诊断为骨质疏松，如果骨密度下降符 合骨质疏松症的诊断标准，同时又有一处或多处的骨折，就 可以诊断严重骨质疏松。
它的检测是受到影响的。
❖ （ 3 ）检测误差：不同实验室的不同检测方法也为检测带来一定的误差。 ❖ （ 4 ）标本保存变异：在标本采集的过程中，储存方法不得当也会使检验产生
一些误差。因此，我们一般采用清晨空腹采血，避免采血前剧烈运动，冷藏储存 血，在采血后 4 小时内离心，这样就便于我们减少误差。在检验结果的分析当 中，我们要注意考虑到年龄和性别的因素，同样还要考虑到伴随疾病、用药情况、 以及最小有益变化值，从而对疗效的监测得出合理的解释。
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实验室检查指标
❖ 5. 1 型胶原的吡啶交联物 ❖ 1 型胶原的吡啶交联物，吡啶啉和脱氧吡啶啉是在胶原分子降解过程中
形成的，如果胶原分子降解与羟赖氨酸残基形成交联物，就产生了吡啶 啉。如果它与赖氨酸残基形成交联物，就叫做脱氧吡啶啉。两者在组织 中的分布是不同的，脱氧吡啶啉主要存在于骨和牙齿当中，而且是以骨 骼为主，因此它的骨特异性更高，在骨的异性胶原中脱氧吡啶啉与吡啶 啉的比例大约为 1：3.5 ，脱氧吡啶啉就比吡啶啉更为特异。 ❖ 6. 抗酒石酸酸性磷酸酶 5b ❖ 血中酸性磷酸酶来源于多种组织，它有 6 种同功酶，其中第 5 种同功酶 也就是 TRACP5 ，它有 2 个亚型， 5a 亚型和 5b 亚型。其中 5b 亚型 主要由人的破骨细胞分泌，也是目前反映破骨细胞活性的惟一指标，是 一个反映骨吸收的指标。但这个指标目前在临床应用的并不是特别广泛， 被广泛应用于一些科研研究。
破骨细胞凋亡调节
破骨细胞凋亡与骨代谢医生在线网2007-03-05 来源：医生在线破骨细胞凋亡与骨代谢中华老年医学杂志2000年第19卷第4期李凌波 王洪复关键词：破骨细胞；骨；细胞凋亡细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是机体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡。
随着细胞生物学、遗传学、分子生物学的发展，发现细胞凋亡与多细胞有机体的个体发育、调控、正常生理活动的维持、某些疾病的发生及其细胞恶变均有密切关系〔1〕。
近年研究表明，破骨细胞凋亡在骨代谢调控和绝经后骨质疏松症等骨代谢疾病的发生、发展过程中具有重要意义。
一、破骨细胞凋亡表现骨的新陈代谢表现为旧骨不断被吸收，新骨随之持续形成，即骨重建。
承担骨重建的基本多细胞单位(basic multicellular unit, BMU)由破骨细胞、成骨细胞、骨细胞和衬细胞等构成，其中破骨细胞和衬细胞主要与骨重建启动有关。
一个BMU 可以持续作用几个月，而破骨细胞寿命仅在半个月左右，表明在BMU 中存在破骨细胞的不断更新。
近年研究表明，BMU 中破骨细胞的消失不是由于继续分化、迁移或再循环，而是由于凋亡。
Hughes 等〔2〕在骨吸收和骨形成交替的逆转部位和高转换型小鼠骨组织中见到破骨细胞凋亡，与小鼠骨缺血部位出现的破骨细胞坏死明显不同。
体外培养破骨细胞也可观察到近70%～80%的破骨细胞呈现凋亡，借助荧光染色方法（细胞接种于玻片、2%戊二醛固定、吖啶橙染色、荧光显微镜观察）能鉴别3种状态的破骨细胞：正常细胞体积大，多核，发绿色荧光；凋亡细胞体积缩小，核固缩，发橙红色荧光；坏死细胞肿胀，发均匀淡红色荧光〔3〕。
破骨细胞凋亡对于维持破骨细胞群的大小从而影响BMU 侧面骨吸收范围的大小以及BMU 行进的速度和时限至关重要。
二、破骨细胞凋亡的调节因子破骨细胞的分化、形成及发挥骨吸收功能涉及成骨细胞、基质细胞等相互作用及其旁分泌和自分泌的细胞因子的影响。
破骨细胞虽为分化末端细胞，但其生存受多种细胞因子、激素和维生素的调节，如单核集落刺激因子（M-CSF ）、白介素-1（IL-1）维持破骨细胞生存，抑制其凋亡，而转化生长因子β（TGF-β）促进破骨细胞凋亡，雌激素和维生素K(Vit k)等与破骨细胞凋亡的调节有关。
骨科外泌体研究套路：破骨细胞对成骨细胞的影响
骨科外泌体研究套路：破骨细胞对成骨细胞的影响作者：酸菜（转载请注：解螺旋·医生科研助手）经过了几个月的闭关，全新升级版的文献精读班在今春又开班啦。
本课程涵盖多个医学生物领域，通过文献精讲传授课题选择、设计方案、开展课题的套路和实用精华技巧，学以致用，帮助大家发表高质量的文章。
今天分享的是上周六酸菜主讲的“开箱课程”核心内容。
讲述了破骨细胞外泌体中miRNA对于成骨细胞的影响。
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这篇Cell Discovery上的骨科文章，Cell Discovery是2014年自然出版集团（NPG）与中科院上海生命科学研究院合作的新期刊，今年影响因子估计在7、8分左右。
首先来看下今天的文章题目：其中有四个关键字：成骨细胞、破骨细胞、外泌体、miRNA，四部分连起来这篇文章也就是研究源自破骨细胞的外泌体中miRNA能够抑制成骨细胞的活性，来看看具体是怎么做的。
一、实验假说科学研究第一步就是提出假说，然后再开始证明，这也是核心的科学思想。
本文的假说如下图所示：这里面有三个核心内容，支撑起这篇文章：1、从破骨细胞来源外泌体能够被成骨细胞摄取并影响其成骨功能——阐释模型2、进一步研究发现，在破骨细胞外泌体高表达miR-214，能够负调节ATF4，抑制成骨效应——提出分子3、破骨细胞外泌体依赖于ephrinA2- EphA2信号途径影响下游效应——解释机制研究的逻辑链就是：二、结果解读本文用七张大图来呈现研究的数据，可以分为四部分：1、Fig1交代了分子的来源，并进行了对miRNA的筛选，选择了此次研究的对象miR-214；2、Fig2-Fig4是通过了离体实验验证了外泌体以及ephrinA2-EphA2信号的生物学功能；3、Fig5-Fig7是在动物模型中对外泌体miR-214做了功能鉴定，尤其是Fig7是对于治疗策略进一步深入的研究。
Fig1作者是要鉴定破骨细胞来源外泌体及miRNA，那首先就要做一个破骨细胞的模型。
破骨细胞及其骨吸收调控研究进展.
破骨细胞及其骨吸收调控研究进展一、概述破骨细胞是一个高度分化的多核巨细胞，直接参与骨吸收，是骨组织吸收的主要功能细胞。
破骨细胞的来源：由于长期以来对于破骨细胞(Osteoclast,OC)的来源问题一直不清楚，给研究工作带来许多困难，因而对临床各种骨疾患的诊断及其防治水平，也不可能进一步深入和提高。
对于破骨细胞来源的认识，在本世纪40～70年代，普遍应用的经典理论为多潜能的骨源细胞学说，认为破骨细胞是由骨源细胞融合而成。
直至70年代中期还认为OC与成骨细胞(OB)为共同的祖代来源。
这种观点多年来一直是疑问，不能被证实，现已被否定。
自80年代初开始，提出了OC来源于骨外生血系统，自此又出现了3种不同观点：(1)OC源于单核吞噬细胞系统，即由单核细胞融合而成，这一观点现已被否定。
(2)OC与单核吞噬细胞共同来源于骨髓生血系统的同一前身细胞，之后各自向不同方向分化。
这一假说也被实验研究所推翻。
研究表明，由骨髓而来的单核细胞经培养之后，可以分化为破骨细胞，但是末梢血中的单核细胞与腹腔中的单核巨噬细胞，经培养后并不能形成破骨细胞，而且前者与破骨细胞的细胞膜上有不同的表面抗原，这提示了破骨细胞与单核巨噬细胞两者不是来自共同的祖代。
(3)OC来源于单核吞噬细胞系统之外的骨髓生血细胞系统，为独立于骨髓干细胞系统的一个细胞系。
Walker曾采用患有硬化病的小鼠及正常小鼠进行了血循联体实验，结果患硬化病的小鼠恢复了正常。
研究表明，破骨细胞浆中碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)基因突变可以引起骨硬化病的发生。
由此表明，破骨细胞是来源于正常鼠的骨髓生血系统。
此外，在临床上通过对患石骨症的患者移植整个胸腺、骨髓等，也取得了良好的疗效。
由此说明，破骨细胞的形成取决于血循中的细胞。
OC在胚胎早期就已到达骨膜，再逐渐分化、融合为破骨细胞，也就是说OC的前驱细胞是前破骨细胞(Proosteoclast)，它在胚胎期间已存在于骨的微环境中，到达骨膜后，由前破骨细胞分化、融合为破骨细胞。
小鼠破骨细胞分离培养及鉴定
小鼠破骨细胞分离培养及鉴定摘要选择小鼠为试验对象，观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。
采用小鼠共培养试验，结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。
结果表明：利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞，TRAP染色阳性，能在骨片表面形成吸收陷窝。
提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。
关键词破骨细胞；TRAP染色；骨吸收陷窝；小鼠骨疾病的发生与骨形成、骨吸收失衡有关，骨吸收大于骨形成导致骨量减少，而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关[1]。
从破骨细胞着手揭示骨吸收机制，为许多由破骨细胞引起的疾病如绝经后的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶解以及矫形外科中的植入体的丢失等提供防治依据。
与此相关，分离成熟的破骨细胞对于研究破骨细胞的特征、功能和调节来说显然是一种必不可缺少的工具。
该研究以小鼠为试验对象，建立小鼠共培养试验培养破骨细胞的方法，来获得具有特征性的破骨细胞。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物。
1日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。
1.1.2 主要试剂及仪器。
α-MEM，胎牛血清，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒、1，25-（OH）2D3，甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片。
YJ2875B型医用净化工作台，PS29000705超纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱，超声清洗仪，XSZ-D2倒置显微镜，XL30-ESEM环境扫描电子显微镜[2-3]。
1.2 试验方法1.2.1 成骨细胞分离培养。
将1日龄的小鼠浸入75%酒精浸泡3～5 min。
无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL离心管，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃气浴摇床消化20 min，80 r/min，弃胰酶。
用PBS冲洗并尽量吹打以除去成纤维细胞。
骨细胞的体外分离培养及鉴定_孙联文
·论著·基金项目:国家自然科学基金(10872024)作者单位:100191 北京,北京航空航天大学生物与医学工程学院通讯作者:樊瑜波,Email :yubofan @buaa .edu .cn骨细胞的体外分离培养及鉴定孙联文 杨肖 张恺 樊瑜波中图分类号:Q2-33 文献标识码:A 文章编号:1006-7108(2009)09-0629-03摘要:目的 建立较稳定的实验室骨细胞分离培养方法。
方法 采用序列酶消化法,从3d 龄Sprague -Dawley 乳鼠颅骨中分离骨细胞,通过形态学、改良钙钴法碱性磷酸酶(ALP )染色和免疫细胞化学法骨钙素(BGP )染色来鉴定骨细胞。
结果 细胞形态呈星状、有树状突起,ALP 染色阴性,BGP 染色阳性,说明分离出的细胞为骨细胞。
结论 本实验结果为在体外深入研究骨细胞的功能提供实验手段。
关键词:骨细胞;序列酶消化;分离;鉴定DOI :10.3969 j .issn .1006-7108.2009.09.001Isolation and identification of osteocytes in rats SUN Lianwen ,YANG Xiao ,ZHA NG Kai ,et al .School of Biological Science and M edical Engineering Beihang University ,Beijing 100191,ChinaA bstract :Osetocytes are the most abundant cell type in bone .However ,the function and the role in the mechanism of osteoporosis ,especially of spaceflight -induced osteopenia ,are unclear .This is impeded by the difficult accessibility of osteocytes in vitr o .Therefore ,it plays a key role in investigating osteocyte functions to isolate and culture osteocytes in vitr o .Osteocytes were isolated from the calvaria tissue of 3-day -old rats using sequential collagenase digestion .The cells were identified as osteocytes through cell morphology ,alkaline phosphatase (ALP )staining by Gomori and osteocalcin (B GP )staining by immunocytochemitry .The results showed that the cells appeared stellate with lon g protrusions .As expected ,they are pos itive for B GP whereas negative for ALP .These characteristics are cons istent with osteocytes and can be used to do further research .Key words :Osteocytes ;Sequential collagen digestion ;Isolation ;Identification 骨细胞是骨组织中数目最多的细胞,是早期感受力学刺激变化的敏感细胞之一[1,2]。
人破骨细胞分化因子（ODF）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
人破骨细胞分化因子（ODF）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织等样本中破骨细胞分化因子（ODF）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人破骨细胞分化因子（ODF）水平。
用纯化的人破骨细胞分化因子（ODF）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入人破骨细胞分化因子（ODF），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人破骨细胞分化因子（ODF）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人破骨细胞分化因子（ODF）含量。
注：标准品浓度依次为：8、4、2、1、0.5、0 ng/mL.样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
体外诱导培养鸡胚破骨细胞及钙、磷对其活性的影响的开题报告
体外诱导培养鸡胚破骨细胞及钙、磷对其活性的影
响的开题报告
题目：体外诱导培养鸡胚破骨细胞及钙、磷对其活性的影响
背景：
破骨细胞是一种多核细胞，主要功能为吸收骨组织，维护骨骼的生长、修复和重建。
骨组织是人体内最重要的钙储存器，同时也是维持人
体钙平衡的重要组成部分。
钙和磷是破骨细胞活动的重要物质基础。
破骨细胞分离方法：
1. 采用鸡胚隆突法。
从10日龄的鸡胚中取出下盘肢骨、尾椎及颈椎，去除软骨和血管。
将骨骼切成1mm×1mm的小块，放入PBS（磷酸盐缓冲液）中振荡10min，去除上清液，加入0.25%胰酶、0.2%胆汁酸和
0.3%牛血清分解，放置30min。
将上清一一收集放入离心管中，离心1000r/min（不得超过2min），沉淀即为破骨细胞。
2. 采用颈椎隆突法。
方法与鸡胚隆突法相似，只是取颈椎制备骨髓
细胞，骨髓细胞在牛血清培养基上24h后即分离出破骨细胞。
破骨细胞活性测定：
采用碱性磷酸酶染色法（ALP）和酸性磷酸酶染色法（TRAP）。
研究内容：
1. 以颈椎隆突法分离破骨细胞，培养7天后使用ALP和TRAP染色
法检测破骨细胞的活性。
2. 将不同浓度的钙、磷加入破骨细胞的培养基中，观察破骨细胞活
性的变化，探究钙、磷对破骨细胞的影响。
意义：
1. 通过体外诱导培养破骨细胞，可以更好地探究破骨细胞的特性和功能。
2. 探究钙、磷对破骨细胞活性的影响，有助于了解骨组织的生长、修复和重建机制，预防和治疗骨质疏松症等疾病。
破骨细胞
破骨细胞在骨吸收部位，与骨接触后，由基质产生的信号向胞内分泌囊泡含H-ATP酶，向微环境释放蛋白水解酶。
其中，无机钙及磷酸盐的降解是通过A TP酶介导的质子分泌。
在吸收陷窝处产生一个酸性环境，而有机基质，主要由胶原和弹性蛋白组成，由半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶降解，其中组织水解酶K起主要作用。
DC分泌IL1/6、TNFα。
增加破骨细胞释放TRAP和组织水解酶K，还可以促进破骨细胞生成通过刺激T 细胞表达RANKL。
未成熟的DC可发育为破骨细胞样的细胞，巨噬细胞在炎症中融合主要依赖IL4RANKL-induced differentiation of osteoclasts in vitro was performed asdescribed previously (12). In brief, primary osteoclast precursors (nonad-herent mouse bone marrow cells, splenocytes, and RAW 264.7) were sus-pended in -MEM supplemented with 10% FBS and cultured in a 24-wellculture plate at 1 106cells per well. After 48 h, the culture medium wasreplaced with fresh culture medium with or without 100 ng/ml mouse re-combinant soluble RANKL (Wako Pure Chemical). After 4 days, cellswere dehydrated with ethanol-acetone (1:1) for 1 min, dried, and stained atroom temperature with TRAP staining solution. TRAP-positive cells ap-peared dark red. We counted TRAP-positive multinucleated cells contain-ing three or more nuclei as osteoclasts.常用的评价方法有生化指标的测量、骨密度测量、骨组织计量学观察、骨生物力学指标检测等。
细胞鉴定
成骨细胞鉴定：1. Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。
待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
2. 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。
阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。
3. 钙化结节染色(茜素红法)：细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，体积分数95%乙醇固定30 min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红[茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，37 ℃，30 min，蒸馏水冲洗。
低倍镜视野(×40)下进行矿化结节观察。
4. V on Kossa’s矿化结节染色法：细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛固定标本，5%硫代硫酸钠孵育30 min，蒸馏水冲洗，然后用1%硝酸银溶液紫外线下染色30 min，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续用5%硫代硫酸钠染色2 min，1%中性红复染10 min，蒸馏水漂洗后观察。
5. 成骨细胞扫描电镜表面形态观察：培养24 h后取出预先置培养板内的圆盖玻片( 直径9 mm)，用PBS冲洗3次，加入3%戊二醛固定2 h；用PBS冲洗3次，45 min/次。
加入1%锇酸，固定2 h。
体积分数为50%，70%，80%，90%，95%的乙醇逐级脱水，各15 min；体积分数100%乙醇脱水2次(15 min/次)。
醋酸异戊酯15 min。
CO2临界点干燥，黏附于载物台上真空镀膜仪镀金，扫描电镜观察并摄片。
6. 成骨细胞透射电镜超微结构观察：消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min弃上清；前固定：加入预冷的固定液3%戊二醛固定2 h。
破骨细胞骨吸收功能的检测方法
破骨细胞骨吸收功能的检测方法李鹏辉;田宗成;商澎【摘要】Osteoclast, which is multinucleated bone tissue cell, plays a significant role in the process of bone resorption. The dysfunction of bone resorption of osteoclast could result in a series of clinical diseases, such as osteoporosis, prosthesis loose after joint replacement, osteosclerosis and periodontal disease, etc. Further research on bone resorption function of osteoclast is essential for the prevention and cure of bone diseases. The detection method of bone resorption function of osteoclast is considered to be a limiting factor for the research on osteoclast. For this reason, this paper reviewed the detection methods of bone resorption function of osteoclast.%破骨细胞是一种多核的,具有骨吸收功能的骨组织细胞,在骨吸收过程中起着至关重要的作用.破骨细胞骨吸收功能的异常会引发一系列的临床病症,如骨质疏松症、关节置换术后假体松动、骨硬化症和牙周病变等.破骨细胞骨吸收功能的进一步研究对于各类骨疾病的防治具有重要的意义.然而破骨细胞骨吸收功能的检测方法一直以来是制约破骨细胞研究的瓶颈之一.为此,围绕破骨细胞骨吸收功能的检测方法做一综述.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)004【总页数】4页(P74-77)【关键词】破骨细胞;骨吸收;检测方法【作者】李鹏辉;田宗成;商澎【作者单位】西北工业大学生命学院,西北工业大学特殊环境生物物理学研究所空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室,西安,710072;西北工业大学生命学院,西北工业大学特殊环境生物物理学研究所空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室,西安,710072;西北工业大学生命学院,西北工业大学特殊环境生物物理学研究所空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室,西安,710072【正文语种】中文【中图分类】R329.2一直以来，由老龄化、妇女绝经、过量服用糖皮质激素等多种因素导致的骨质疏松症，已经成为威胁人类健康的一大疾病；同时空间飞行引起的失重性骨丢失，也越来越多的受到骨研究工作者的关注。
小鼠破骨细胞分离培养及鉴定
小鼠破骨细胞分离培养及鉴定小鼠破骨细胞分离培养及鉴定摘要选择小鼠为试验对象，观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。
采用小鼠共培养试验，结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。
结果表明：利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞，TRAP染色阳性，能在骨片表面形成吸收陷窝。
提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。
关键词破骨细胞；TRAP染色；骨吸收陷窝；小鼠骨疾病的发生与骨形成、骨吸收失衡有关，骨吸收大于骨形成导致骨量减少，而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关[1]。
从破骨细胞着手揭示骨吸收机制，为许多由破骨细胞引起的疾病如绝经后的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶解以及矫形外科中的植入体的丢失等提供防治依据。
与此相关，分离成熟的破骨细胞对于研究破骨细胞的特征、功能和调节来说显然是一种必不可缺少的工具。
该研究以小鼠为试验对象，建立小鼠共培养试验培养破骨细胞的方法，来获得具有特征性的破骨细胞。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物。
1日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。
1.1.2 主要试剂及仪器。
α-MEM，胎牛血清，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒、1，25-（OH）2D3，甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片。
YJ2875B型医用净化工作台，PS29000705超纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱，超声清洗仪，XSZ-D2倒置显微镜，XL30-ESEM环境扫描电子显微镜[2-3]。
1.2 试验方法1.2.1 成骨细胞分离培养。
将1日龄的小鼠浸入75%酒精浸泡3～5 min。
无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL离心管，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃气浴摇床消化20 min，80 r/min，弃胰酶。
用PBS冲洗并尽量吹打以除去成纤维细胞。
004破骨细胞培养及鉴定
⑶骨磨片的制备与处理： ①骨磨片的制备：取新鲜牛胫骨，剔除软组织 与骨膜，选择骨皮质最厚部位，用钻铣床将表面铣 平，再用Φ20mm环钻，钻取圆柱状骨块，在精密切 割机上，切取0.1mm厚的圆形薄片，用精细水磨砂在 电动磨抛机上将骨片的细胞培养面打磨光洁，微钻 打孔标记正反面。在制作骨磨片时，应用清水持续 灌洗，以免温度过高。
骨片上形成骨吸收陷窝，陷窝呈圆形、椭圆形或不
规则形。
(2)吉姆萨或HE染色：
光镜下可见多个核的破骨细胞，细胞核圆形
或椭圆形，染色浅，胞质有许多伪足样突起。 (3)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 显微镜下观察可见破骨细胞胞浆呈红色阳性 反应，胞核呈阴性。
(4)噬骨试验与扫描电镜观察
破骨细胞培养与鉴定
破骨细胞(Osteoclast)是骨组织中的多 核巨细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前 一般认为破骨细胞来源于骨骼外的造血系统， 其前体可能属造血干细胞的前单核细胞，由 于破骨细胞是一种终末细胞，不能增殖和传 代，只能进行原代培养，且存活时间较短， 故分离细胞培养法难以获得大量的破骨细胞，
／m1)的抗生素溶液的小容器中，每次10-20min。最
后可浸在盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃(短 期)或-20℃(较长期)冰箱内保存备用。
(2)破骨细胞的分离和培养 所有取材、 分离与培养过程须在无菌条件下进行。 ①取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后置 于盛有75％酒精的容器中，消毒3-5min后取 出放入培养皿中。 ②用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取 股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿 中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨。
胞之间的反复融合，形成巨大的多核细胞。
4．破骨细胞的鉴定
⑴细胞形态观察
破骨细胞的分离培养技术及其鉴定
破骨细胞的分离培养技术及其鉴定
汪韬;张柳;程爱国
【期刊名称】《河北联合大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2001(003)002
【摘要】骨质疏松症的发生与骨形成、骨吸收两者失平衡有关，其发病机制是由于骨质吸收的速度超过骨质形成所致，而前者又与破骨细胞的数量和功能有关。
从破骨细胞人手，探讨其结构和生物学功能和特性，是揭示骨吸收机制的重要环节，为骨质疏松症等由于破骨细胞活性增强而引起的诸多疾病提供防治依据。
【总页数】2页(P165-166)
【作者】汪韬;张柳;程爱国
【作者单位】华北煤炭医学院附属医院骨外科,河北唐山,063000;华北煤炭医学院附属医院骨外科,河北唐山,063000;华北煤炭医学院附属医院骨外科,河北唐
山,063000
【正文语种】中文
【中图分类】Q2-033
【相关文献】
1.小鼠破骨细胞分离培养及鉴定 [J], 王玉瑾;李永勖
2.MALDI SepsityperTM Kit和血清分离胶促凝管法两种前处理方法在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术直接鉴定阳性血培养病原菌的应用评估 [J], 秦娟秀;黄芊;高倩倩;谢乙慧;李敏;张灏旻
3.新生兔破骨细胞的体外分离培养与功能鉴定 [J], 任媛媛;张健
4.鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定 [J], 姚静;钱存忠;张皎;张建峰;侯加法
5.应用体外分离培养破骨细胞的技术评价人工骨 [J], 林建琛;林焱斌;陈桦;黄斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人破骨细胞的体外培养及鉴定
人破骨细胞的体外培养及鉴定刘水涛;雷鸣;安佰京;杨军;张鹏礼;邢更彦【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2011(22)5【摘要】Objective To establish an in vitro method of culture and identification of human osteoclasts, and to provide a large number of highly - active osteoclasts for experimental researches.Methods Mononuclear cells were obtained from bone marrow.The osteoclasts were cultured in different media, by different inducers and at different concentrations.Morphological characteristics of cells were identified by TRAP staining, and specific proteins by ELISA.The ability of resorption was analysed by scanning electron microscopy.Results In group C and D, the a -MEM was used as culture medium and 1 , 25(OH)2VD3( 10-7 mmol/L) or RANKL (50 ng/ml) and M - CSF (30 ng/ml) as inducers.The osteoclasts were multinuclear and highly - active.Conculsions A method has been found to cultivate numerous highly - active human osteoclasts in vitro.%目的:探索人破骨细胞的体外培养及鉴定方法,为各类试验研究提供大量高活性破骨细胞.方法:分离骨髓血得到单个核细胞,用不同培养液、诱导剂在不同浓度下培养破骨细胞,通过TRAP染色鉴定破骨细胞形态,ELISA法检测特异性蛋白表达水平,扫描电镜分析骨片骨陷窝面积.结果:用α-MEM培养液,10(-7)mmol/L浓度的1,25(OH)2VD3或50ng/ml浓度的RANKL和30ng/ml的M-CSF作为诱导剂,所培养的破骨细胞多核、特异性蛋白表达水平高、蚀骨能力强.结论:用DMEM培养液和α-MEM培养液培养均是一种能在体外诱导生成大量人破骨细胞的方法.同时,建议采用1,25(OH)2VD3作为诱导剂.【总页数】4页(P381-384)【作者】刘水涛;雷鸣;安佰京;杨军;张鹏礼;邢更彦【作者单位】100039,北京,武警总医院骨科;071000,石家庄,河北大学附属医院;100039,北京,武警总医院骨科;100039,北京,武警总医院骨科;100039,北京,武警总医院骨科;100039,北京,武警总医院骨科【正文语种】中文【中图分类】R494.26【相关文献】1.体外培养人牙囊细胞表达的OPG和RANKL对破骨细胞表型分化的影响 [J], 孙海燕;金作霖;张永宽;林珠2.巨噬细胞集落刺激因子对体外培养人牙囊细胞破骨细胞分化因子表达的影响 [J], 孙海燕;林珠;金作林;张永宽3.人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定 [J], 梅红;李一雷;王心蕊;张丽红;刘巍;王建民;李玉林4.成人破骨细胞的体外培养 [J], 欧阳桂林;杨庆铭;邓廉夫;许福萍;朱雅萍5.持续压力对体外培养的人破骨细胞形态和基质金属蛋白酶9、抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响 [J], 许海燕;周洪;饶国洲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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1．主要实验材料 (1)实验动物 大鼠、兔、人等。 (2)培养液 M199培养基、RPMI 1640培 养基或MEM培养基，配制时须加20％的小牛血 清、HEPES 25mmol/L，粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因子100ng／m1。 (3)淋巴细胞分离液 密度为1.077g／m1。
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 同成熟破骨细胞 分离细胞培养法中的薄骨片制备。 (2)骨髓单核细胞分离及培养 所有 取材、分离细胞及培养过程均须在无菌 条件下进行。
／m1)的抗生素溶液的小容器中，每次10-20min。最
后可浸在盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃(短 期)或-20℃(较长期)冰箱内保存备用。
(2)破骨细胞的分离和培养 所有取材、 分离与培养过程须在无菌条件下进行。 ①取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后置 于盛有75％酒精的容器中，消毒3-5min后取 出放入培养皿中。 ②用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取 股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿 中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨。
③将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清 洗后，置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术 刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内 表面，同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液， 冲洗骨内表面多次，直至骨内表面变白为止。 ④用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培 养液2－5min，使附着于碎骨片上的破骨细胞分离 脱落于培养液中。静置1－2min后，待碎骨片沉降， 收集细胞悬液。
⑵单个核细胞分离：采用密度梯度离心法，向 采集的血样标本内加入等量的PBS，取6支10ml离心 管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再小心
缓缓地向各离心管内加入上述含PBS的血样各2.5ml，
然后以2000rpm,水平离心20min，取出后在絮状层
面小心吸取单个核细胞，分别收集到2支离心管中，
弃上清液。
④加入培养液，制成细胞密度为5×105 个／ml的悬液。将细胞悬液接种到预先置有 薄骨片或盖玻片的24孔培养板中。 ⑤将培养板置于37℃、C02培养箱中培养。 培养5d后换液。换液时，轻轻晃动培养板， 再吸去培养液，这样可除去末贴壁的细胞， 然后加入新鲜的培养液继续培养。以后每周 换液1次。培养时间为3-4周。
PBS清洗2次，备作重悬培养。
⑶骨磨片的制备与处理： ①骨磨片的制备：取新鲜牛胫骨，剔除软组织 与骨膜，选择骨皮质最厚部位，用钻铣床将表面铣 平，再用Φ20mm环钻，钻取圆柱状骨块，在精密切 割机上，切取0.1mm厚的圆形薄片，用精细水磨砂在 电动磨抛机上将骨片的细胞培养面打磨光洁，微钻 打孔标记正反面。在制作骨磨片时，应用清水持续 灌洗，以免温度过高。
骨片上形成骨吸收陷窝，陷窝呈圆形、椭圆形或不
规则形。
(2)吉姆萨或HE染色：
光镜下可见多个核的破骨细胞，细胞核圆形
或椭圆形，染色浅，胞质有许多伪足样突起。 (3)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 显微镜下观察可见破骨细胞胞浆呈红色阳性 反应，胞核呈阴性。
(4)噬骨试验与扫描电镜观察
破骨细胞培养与鉴定
破骨细胞(Osteoclast)是骨组织中的多 核巨细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前 一般认为破骨细胞来源于骨骼外的造血系统， 其前体可能属造血干细胞的前单核细胞，由 于破骨细胞是一种终末细胞，不能增殖和传 代，只能进行原代培养，且存活时间较短， 故分离细胞培养法难以获得大量的破骨细胞，
3．培养结果 细胞接种培养后前3天，倒置相差显微镜观察， 外形呈小圆形或椭圆形颗粒状，部分细胞开始贴壁。 第4～6天，可见一些细胞体积变大，颜色变深，少 量单核细胞开始融合，镜下可见多核细胞形成。其 后2～3周，多核细胞数量不断增加，体积变大，外 形呈圆形、梭形、扇形、椭圆形及不规则突起状。
多核细胞可不断融合周围的单核细胞或发生多核细
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 取新鲜牛股骨干的密度骨部
分，沿骨纵轴用骨锯切割成大小约0.5cm×0.5cm、厚
为0.1cm的小块，再用金刚砂轮磨成厚约10-50µ m(以 便在相差显微镜下观察)的薄骨片。使用前超声洗涤3 次，每次约10min。然后依次浸泡在3个盛有含青霉素 (1000U／m1)、链霉素(1000µ g／m1)、两性霉素B(3µ g
②骨磨片的处理：将制成的骨磨片用清水漂洗，
再用双蒸水在超声清洗器中清洗3次，每次5min，
晾干。75％酒精浸泡2h，置灭菌培养皿中超净台内
紫外线正、反面各照1h，加入含1000u/ml青链霉素
的PBS液浸泡过夜，使用前用α-MEM培养液浸泡1h。
⑷细胞的诱导与培养：将分离纯化的大鼠周围
血单个核细胞，用含10％胎牛血清、50ng/ml RANKL、 20ng/ml M-CSF、100u/ml 青霉素、100u/ml 链霉素 的α-MEM培养液重悬，调整细胞密度为1×105/ml。 再将配制好的细胞悬液接种到培养皿与培养板中。 置于CO2培养箱内。在37℃、5％CO2、饱和湿度下进 行连续培养。并用上述含RANKL、M-CSF的α-MEM培 养液换液，3天1次。
胞之间的反复融合，形成巨大的多核细胞。
4．破骨细胞的鉴定
⑴细胞形态观察
⑵抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
⑶噬骨试验与扫描电镜观察
⑷降钙素受体（CTR）染色 ⑸降钙素反应（应答）
(1)细胞形态观察
破骨细胞胞体大，形态不规则，有短突起，细
胞内有多个核。破骨细胞具噬骨现象。在培养24h以
后，相差显微镜下观察可见破骨细胞侵蚀骨片，在
Ligang) ， 重 组 大 鼠 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (Recombinant Rat M-CSF)，α-MEM培养基，胎牛血 清（FBS），大鼠淋巴细胞分离液，抗酒石酸酸性磷
酸酶染色试剂盒。
2．培养方法 ⑴标本采集：取清洁级纯种成年SD 大鼠1只，3％戊巴比妥钠，按体重 0.15ml/100g，腹腔注射麻醉。无菌操作 下腹主动脉采血8ml，注入灭菌肝素抗凝 瓶中。
①动物的处理和长骨取材同成熟破骨细 胞分离细胞培养法步骤①、②。 ②用手术剪纵行剖开长骨骨干，用尖吸 管取培养液冲洗骨髓腔。将含骨髓的培养液 缓慢加入有淋巴细胞分离液的离心管内， 1000r／min下离心10min。 ③用吸管吸取中间乳白色细胞层。用培 养液洗2次，分别以1000r／min离心10min，
⑤将细胞悬液加入到预置有薄骨片或 盖玻片的24孔培养板中，在37℃、5％C02 培养箱中培养。 ⑥培养30～60min左右，取出薄骨片 或盖玻片用培养液冲洗以除去未附着的骨 髓造血细胞。冲洗后，将薄骨片或盖玻片 移入另一培养板中继续培养。
3．培养结果 培养30min，破骨细胞即已贴壁，胞质逐 渐伸展；培养2h后，细胞铺展，形态不规则， 有伪足，细胞内可见多个细胞核；培养10h后， 即可见薄骨片上出现小的凹陷；24h后凹陷明细胞的方法：
一、机械分离骨组织中的成熟破骨细胞 二、骨髓单核细胞诱导分化培养 三、血液单核细胞诱导分化培养 四、脾干细胞诱导培养法
1．主要实验材料 (1)细胞来源 新生大鼠或兔， 妊娠6个月以内的引产胎儿等。 (2)细胞支持物 薄骨片，盖玻 片。 (3)培养液 M199培养基、MEM或 DMEM培养基均可，加10％－15％胎牛 血清。
3．培养结果 培养l周以后，可有多核细胞形成。 随培养时间延长，此类细胞数量逐渐
增多。
用淋巴细胞分离液进行离心分离，所
获得的中间乳白色细胞层包含全部的白细 胞成分。在吸取这层细胞时动作要准确、 轻柔，以防混入其他层细胞(尤其是骨髓内 结缔组织细胞) 。
（三）血液单核细胞诱导分化培养
1．主要实验材料 ⑴实验动物 成年SPF级纯种雄性SD大鼠1只。 ⑵主要试剂 化因子配体 重组大鼠可溶性核因子кB受体活 (Recombinant Rat soluble RANK