004破骨细胞培养及鉴定
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破骨细胞培养与鉴定
破骨细胞(Osteoclast)是骨组织中的多 核巨细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前 一般认为破骨细胞来源于骨骼外的造血系统， 其前体可能属造血干细胞的前单核细胞，由 于破骨细胞是一种终末细胞，不能增殖和传 代，只能进行原代培养，且存活时间较短， 故分离细胞培养法难以获得大量的破骨细胞，
1．主要实验材料 (1)实验动物 大鼠、兔、人等。 (2)培养液 M199培养基、RPMI 1640培 养基或MEM培养基，配制时须加20％的小牛血 清、HEPES 25mmol/L，粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因子100ng／m1。 (3)淋巴细胞分离液 密度为1.077g／m1。
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 同成熟破骨细胞 分离细胞培养法中的薄骨片制备。 (2)骨髓单核细胞分离及培养 所有 取材、分离细胞及培养过程均须在无菌 条件下进行。
不易满足研究的需要。
体外获得破骨细胞的方法：
一、机械分离骨组织中的成熟破骨细胞 二、骨髓单核细胞诱导分化培养 三、血液单核细胞诱导分化培养 四、脾干细胞诱导培养法
1．主要实验材料 (1)细胞来源 新生大鼠或兔， 妊娠6个月以内的引产胎儿等。 (2)细胞支持物 薄骨片，盖玻 片。 (3)培养液 M199培养基、MEM或 DMEM培养基均可，加10％－15％胎牛 血清。
⑵单个核细胞分离：采用密度梯度离心法，向 采集的血样标本内加入等量的PBS，取6支10ml离心 管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再小心
缓缓地向各离心管内加入上述含PBS的血样各2.5ml，
然后以2000rpm,水平离心20min，取出后在絮状层
面小心吸取单个核细胞，分别收集到2支离心管中，
③将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清 洗后，置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术 刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内 表面，同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液， 冲洗骨内表面多次，直至骨内表面变白为止。 ④用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培 养液2－5min，使附着于碎骨片上的破骨细胞分离 脱落于培养液中。静置1－2min后，待碎骨片沉降， 收集细胞悬液。
②骨磨片的处理：将制成的骨磨片用清水漂洗，
再用双蒸水在超声清洗器中清洗3次，每次5min，
晾干。75％酒精浸泡2h，置灭菌培养皿中超净台内
紫外线正、反面各照1h，加入含1000u/ml青链霉素
的PBS液浸泡过夜，使用前用α-MEM培养液浸泡1h。
⑷细胞的诱导与培养：将分离纯化的大鼠周围
血单个核细胞，用含10％胎牛血清、50ng/ml RANKL、 20ng/ml M-CSF、100u/ml 青霉素、100u/ml 链霉素 的α-MEM培养液重悬，调整细胞密度为1×105/ml。 再将配制好的细胞悬液接种到培养皿与培养板中。 置于CO2培养箱内。在37℃、5％CO2、饱和湿度下进 行连续培养。并用上述含RANKL、M-CSF的α-MEM培 养液换液，3天1次。
胞之间的反复融合，形成巨大的多核细胞。
4．破骨细胞的鉴定
⑴细胞形态观察
⑵抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
⑶噬骨试验与扫描电镜观察
⑷降钙素受体（CTR）染色 ⑸降钙素反应（应答）
(1)细胞形态观察
破骨细胞胞体大，形态不规则，有短突起，细
胞内有多个核。破骨细胞具噬骨现象。在培养24h以
后，相差显微镜下观察可见破骨细胞侵蚀骨片，在
骨片上形成骨吸收陷窝，陷窝呈圆形、椭圆形或不
规则形。
(2)吉姆萨或HE染色：
光镜下可见多源自文库核的破骨细胞，细胞核圆形
或椭圆形，染色浅，胞质有许多伪足样突起。 (3)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 显微镜下观察可见破骨细胞胞浆呈红色阳性 反应，胞核呈阴性。
(4)噬骨试验与扫描电镜观察
PBS清洗2次，备作重悬培养。
⑶骨磨片的制备与处理： ①骨磨片的制备：取新鲜牛胫骨，剔除软组织 与骨膜，选择骨皮质最厚部位，用钻铣床将表面铣 平，再用Φ20mm环钻，钻取圆柱状骨块，在精密切 割机上，切取0.1mm厚的圆形薄片，用精细水磨砂在 电动磨抛机上将骨片的细胞培养面打磨光洁，微钻 打孔标记正反面。在制作骨磨片时，应用清水持续 灌洗，以免温度过高。
弃上清液。
④加入培养液，制成细胞密度为5×105 个／ml的悬液。将细胞悬液接种到预先置有 薄骨片或盖玻片的24孔培养板中。 ⑤将培养板置于37℃、C02培养箱中培养。 培养5d后换液。换液时，轻轻晃动培养板， 再吸去培养液，这样可除去末贴壁的细胞， 然后加入新鲜的培养液继续培养。以后每周 换液1次。培养时间为3-4周。
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 取新鲜牛股骨干的密度骨部
分，沿骨纵轴用骨锯切割成大小约0.5cm×0.5cm、厚
为0.1cm的小块，再用金刚砂轮磨成厚约10-50µ m(以 便在相差显微镜下观察)的薄骨片。使用前超声洗涤3 次，每次约10min。然后依次浸泡在3个盛有含青霉素 (1000U／m1)、链霉素(1000µ g／m1)、两性霉素B(3µ g
／m1)的抗生素溶液的小容器中，每次10-20min。最
后可浸在盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃(短 期)或-20℃(较长期)冰箱内保存备用。
(2)破骨细胞的分离和培养 所有取材、 分离与培养过程须在无菌条件下进行。 ①取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后置 于盛有75％酒精的容器中，消毒3-5min后取 出放入培养皿中。 ②用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取 股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿 中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨。
3．培养结果 培养l周以后，可有多核细胞形成。 随培养时间延长，此类细胞数量逐渐
增多。
用淋巴细胞分离液进行离心分离，所
获得的中间乳白色细胞层包含全部的白细 胞成分。在吸取这层细胞时动作要准确、 轻柔，以防混入其他层细胞(尤其是骨髓内 结缔组织细胞) 。
（三）血液单核细胞诱导分化培养
1．主要实验材料 ⑴实验动物 成年SPF级纯种雄性SD大鼠1只。 ⑵主要试剂 化因子配体 重组大鼠可溶性核因子кB受体活 (Recombinant Rat soluble RANK
①动物的处理和长骨取材同成熟破骨细 胞分离细胞培养法步骤①、②。 ②用手术剪纵行剖开长骨骨干，用尖吸 管取培养液冲洗骨髓腔。将含骨髓的培养液 缓慢加入有淋巴细胞分离液的离心管内， 1000r／min下离心10min。 ③用吸管吸取中间乳白色细胞层。用培 养液洗2次，分别以1000r／min离心10min，
3．培养结果 细胞接种培养后前3天，倒置相差显微镜观察， 外形呈小圆形或椭圆形颗粒状，部分细胞开始贴壁。 第4～6天，可见一些细胞体积变大，颜色变深，少 量单核细胞开始融合，镜下可见多核细胞形成。其 后2～3周，多核细胞数量不断增加，体积变大，外 形呈圆形、梭形、扇形、椭圆形及不规则突起状。
多核细胞可不断融合周围的单核细胞或发生多核细
Ligang) ， 重 组 大 鼠 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (Recombinant Rat M-CSF)，α-MEM培养基，胎牛血 清（FBS），大鼠淋巴细胞分离液，抗酒石酸酸性磷
酸酶染色试剂盒。
2．培养方法 ⑴标本采集：取清洁级纯种成年SD 大鼠1只，3％戊巴比妥钠，按体重 0.15ml/100g，腹腔注射麻醉。无菌操作 下腹主动脉采血8ml，注入灭菌肝素抗凝 瓶中。
⑤将细胞悬液加入到预置有薄骨片或 盖玻片的24孔培养板中，在37℃、5％C02 培养箱中培养。 ⑥培养30～60min左右，取出薄骨片 或盖玻片用培养液冲洗以除去未附着的骨 髓造血细胞。冲洗后，将薄骨片或盖玻片 移入另一培养板中继续培养。
3．培养结果 培养30min，破骨细胞即已贴壁，胞质逐 渐伸展；培养2h后，细胞铺展，形态不规则， 有伪足，细胞内可见多个细胞核；培养10h后， 即可见薄骨片上出现小的凹陷；24h后凹陷明 显增大。
破骨细胞(Osteoclast)是骨组织中的多 核巨细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前 一般认为破骨细胞来源于骨骼外的造血系统， 其前体可能属造血干细胞的前单核细胞，由 于破骨细胞是一种终末细胞，不能增殖和传 代，只能进行原代培养，且存活时间较短， 故分离细胞培养法难以获得大量的破骨细胞，
1．主要实验材料 (1)实验动物 大鼠、兔、人等。 (2)培养液 M199培养基、RPMI 1640培 养基或MEM培养基，配制时须加20％的小牛血 清、HEPES 25mmol/L，粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因子100ng／m1。 (3)淋巴细胞分离液 密度为1.077g／m1。
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 同成熟破骨细胞 分离细胞培养法中的薄骨片制备。 (2)骨髓单核细胞分离及培养 所有 取材、分离细胞及培养过程均须在无菌 条件下进行。
不易满足研究的需要。
体外获得破骨细胞的方法：
一、机械分离骨组织中的成熟破骨细胞 二、骨髓单核细胞诱导分化培养 三、血液单核细胞诱导分化培养 四、脾干细胞诱导培养法
1．主要实验材料 (1)细胞来源 新生大鼠或兔， 妊娠6个月以内的引产胎儿等。 (2)细胞支持物 薄骨片，盖玻 片。 (3)培养液 M199培养基、MEM或 DMEM培养基均可，加10％－15％胎牛 血清。
⑵单个核细胞分离：采用密度梯度离心法，向 采集的血样标本内加入等量的PBS，取6支10ml离心 管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再小心
缓缓地向各离心管内加入上述含PBS的血样各2.5ml，
然后以2000rpm,水平离心20min，取出后在絮状层
面小心吸取单个核细胞，分别收集到2支离心管中，
③将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清 洗后，置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术 刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内 表面，同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液， 冲洗骨内表面多次，直至骨内表面变白为止。 ④用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培 养液2－5min，使附着于碎骨片上的破骨细胞分离 脱落于培养液中。静置1－2min后，待碎骨片沉降， 收集细胞悬液。
②骨磨片的处理：将制成的骨磨片用清水漂洗，
再用双蒸水在超声清洗器中清洗3次，每次5min，
晾干。75％酒精浸泡2h，置灭菌培养皿中超净台内
紫外线正、反面各照1h，加入含1000u/ml青链霉素
的PBS液浸泡过夜，使用前用α-MEM培养液浸泡1h。
⑷细胞的诱导与培养：将分离纯化的大鼠周围
血单个核细胞，用含10％胎牛血清、50ng/ml RANKL、 20ng/ml M-CSF、100u/ml 青霉素、100u/ml 链霉素 的α-MEM培养液重悬，调整细胞密度为1×105/ml。 再将配制好的细胞悬液接种到培养皿与培养板中。 置于CO2培养箱内。在37℃、5％CO2、饱和湿度下进 行连续培养。并用上述含RANKL、M-CSF的α-MEM培 养液换液，3天1次。
胞之间的反复融合，形成巨大的多核细胞。
4．破骨细胞的鉴定
⑴细胞形态观察
⑵抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
⑶噬骨试验与扫描电镜观察
⑷降钙素受体（CTR）染色 ⑸降钙素反应（应答）
(1)细胞形态观察
破骨细胞胞体大，形态不规则，有短突起，细
胞内有多个核。破骨细胞具噬骨现象。在培养24h以
后，相差显微镜下观察可见破骨细胞侵蚀骨片，在
骨片上形成骨吸收陷窝，陷窝呈圆形、椭圆形或不
规则形。
(2)吉姆萨或HE染色：
光镜下可见多源自文库核的破骨细胞，细胞核圆形
或椭圆形，染色浅，胞质有许多伪足样突起。 (3)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 显微镜下观察可见破骨细胞胞浆呈红色阳性 反应，胞核呈阴性。
(4)噬骨试验与扫描电镜观察
PBS清洗2次，备作重悬培养。
⑶骨磨片的制备与处理： ①骨磨片的制备：取新鲜牛胫骨，剔除软组织 与骨膜，选择骨皮质最厚部位，用钻铣床将表面铣 平，再用Φ20mm环钻，钻取圆柱状骨块，在精密切 割机上，切取0.1mm厚的圆形薄片，用精细水磨砂在 电动磨抛机上将骨片的细胞培养面打磨光洁，微钻 打孔标记正反面。在制作骨磨片时，应用清水持续 灌洗，以免温度过高。
弃上清液。
④加入培养液，制成细胞密度为5×105 个／ml的悬液。将细胞悬液接种到预先置有 薄骨片或盖玻片的24孔培养板中。 ⑤将培养板置于37℃、C02培养箱中培养。 培养5d后换液。换液时，轻轻晃动培养板， 再吸去培养液，这样可除去末贴壁的细胞， 然后加入新鲜的培养液继续培养。以后每周 换液1次。培养时间为3-4周。
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 取新鲜牛股骨干的密度骨部
分，沿骨纵轴用骨锯切割成大小约0.5cm×0.5cm、厚
为0.1cm的小块，再用金刚砂轮磨成厚约10-50µ m(以 便在相差显微镜下观察)的薄骨片。使用前超声洗涤3 次，每次约10min。然后依次浸泡在3个盛有含青霉素 (1000U／m1)、链霉素(1000µ g／m1)、两性霉素B(3µ g
／m1)的抗生素溶液的小容器中，每次10-20min。最
后可浸在盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃(短 期)或-20℃(较长期)冰箱内保存备用。
(2)破骨细胞的分离和培养 所有取材、 分离与培养过程须在无菌条件下进行。 ①取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后置 于盛有75％酒精的容器中，消毒3-5min后取 出放入培养皿中。 ②用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取 股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿 中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨。
3．培养结果 培养l周以后，可有多核细胞形成。 随培养时间延长，此类细胞数量逐渐
增多。
用淋巴细胞分离液进行离心分离，所
获得的中间乳白色细胞层包含全部的白细 胞成分。在吸取这层细胞时动作要准确、 轻柔，以防混入其他层细胞(尤其是骨髓内 结缔组织细胞) 。
（三）血液单核细胞诱导分化培养
1．主要实验材料 ⑴实验动物 成年SPF级纯种雄性SD大鼠1只。 ⑵主要试剂 化因子配体 重组大鼠可溶性核因子кB受体活 (Recombinant Rat soluble RANK
①动物的处理和长骨取材同成熟破骨细 胞分离细胞培养法步骤①、②。 ②用手术剪纵行剖开长骨骨干，用尖吸 管取培养液冲洗骨髓腔。将含骨髓的培养液 缓慢加入有淋巴细胞分离液的离心管内， 1000r／min下离心10min。 ③用吸管吸取中间乳白色细胞层。用培 养液洗2次，分别以1000r／min离心10min，
3．培养结果 细胞接种培养后前3天，倒置相差显微镜观察， 外形呈小圆形或椭圆形颗粒状，部分细胞开始贴壁。 第4～6天，可见一些细胞体积变大，颜色变深，少 量单核细胞开始融合，镜下可见多核细胞形成。其 后2～3周，多核细胞数量不断增加，体积变大，外 形呈圆形、梭形、扇形、椭圆形及不规则突起状。
多核细胞可不断融合周围的单核细胞或发生多核细
Ligang) ， 重 组 大 鼠 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (Recombinant Rat M-CSF)，α-MEM培养基，胎牛血 清（FBS），大鼠淋巴细胞分离液，抗酒石酸酸性磷
酸酶染色试剂盒。
2．培养方法 ⑴标本采集：取清洁级纯种成年SD 大鼠1只，3％戊巴比妥钠，按体重 0.15ml/100g，腹腔注射麻醉。无菌操作 下腹主动脉采血8ml，注入灭菌肝素抗凝 瓶中。
⑤将细胞悬液加入到预置有薄骨片或 盖玻片的24孔培养板中，在37℃、5％C02 培养箱中培养。 ⑥培养30～60min左右，取出薄骨片 或盖玻片用培养液冲洗以除去未附着的骨 髓造血细胞。冲洗后，将薄骨片或盖玻片 移入另一培养板中继续培养。
3．培养结果 培养30min，破骨细胞即已贴壁，胞质逐 渐伸展；培养2h后，细胞铺展，形态不规则， 有伪足，细胞内可见多个细胞核；培养10h后， 即可见薄骨片上出现小的凹陷；24h后凹陷明 显增大。