关于生物制药组实训实习报告及心得体会

取灭好菌的营养琼脂培养基，在超净工作台里倒入平板中，大约15ml/个。供后续检测活菌数使用。
图三5
图三6
注意事项：在配制营养琼脂培养基时，要先加少量水进行溶解搅拌，再加热水进行充分溶解，最后煮沸使琼脂全部溶解，否则琼脂没有溶解就分装，灭菌后就出现上图现象，有的培养基太硬，有的太软。
实验内容及操作
接种培养
250ml锥形瓶+150ml蒸馏水5瓶
将配好的营养琼脂培养基分装于规格为250ml锥形瓶，2瓶
置于高压蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌
图三1
图三2
取23号菌种在超净工作台内进行接种，100ul/瓶，共3瓶，供后续实验菌种的来源。置于摇床中培养30℃，100rmp/min。
图三3
图三4
固体平板培养基的制备
未检测
表四1
图四2
图四3
图四4
图四5（为6h失败平板）
注意事项:菌液稀释倍数要合理，在进行用涂布棒涂布的时候，涂布棒在酒精灯上灼烧后一定要冷却，否则会烫死菌种。涂布要均匀，多来回涂几次，否则就成上图6h失败平板
酶活检测
计算公式：酶活力（U）={[（A-空白）-（B-空白）-（对照-空白）]×V标/t反应}×D（倍数值）×103
2ml
8
DNS溶液
2ml
9
100℃加热显色
6-8min
10
冰水冷却
3min
11
补水定容
12
540nm检测
表四2
根据上表进行操作得到以下数据
酶活力随培养时间变化
培养时间（h）
A值（平均值）
B值
空白
对照
酶活力
3
6
150
204
12
212
16
182
18
21
24
27
未检测
30
未检测
表四3
图四6
图四7
图四8
图四9
0
108
1
1×108
3
107
0
9×106
106
9
6
108
2
2×108
106
7
×106
107
1
12
106
24
×108
107
9
108
53
16
107
127
×1010
108
230
109
133
18
109
33
×1010
108
73
21
109
106
×1010
108
210
24
108
23
×1010
109
30
27
未检测
30
（4℃）（30℃）
8:00
16
下午16:30—17:00
8:00
18
下午16:30—17:00
11:00
21
下午16:30—17:00
14:00
24
9:00
9:00
27
9:00
12:00
30
9:00
15:00
表格1
注：红色标记为未检测项目。
试剂的配制、培养基的配制
试剂的配制
所配的试剂名称
所需试剂的质量或体积
3.滴加碘液覆盖菌膜，维持1min，用蒸馏水洗去，将载玻片上的积水甩干。
4.加95%酒精加于载玻片上脱色，左右摇动使其脱色均匀，脱色时间约为30s，脱色后立即用蒸馏水冲洗干净。
5.滴加稀释复红染液于菌膜上，覆盖住菌膜，染色1min。用蒸馏水冲洗去染液，甩去载玻片上积水。
试剂
所需（ml）/（g）
所得终浓度
1%磷酸二氢钾
15ml
%磷酸二氢钾
1%七水硫酸亚铁
%七水硫酸亚铁
%氯化钙
%氯化钙
%七水硫酸镁
15ml
%七水硫酸镁
1%硫酸铵
15ml
%硫酸铵
可溶性淀粉
%
蛋白胨
1%
氯化钠
%
牛肉膏
%
最终培养基pH值为
表格3
营养琼脂培养基的配制
试剂
所需质量
营养琼脂培养基
16g
称取营养琼脂培养基，加水定容至500ml，煮沸溶解
醋酸钠母液200ml
醋酸母液200ml
2mol/L氢氧化钠溶液500ml
4Leabharlann Baidug
1%磷酸二氢钾母液250ml
1%七水硫酸亚铁母液250ml
1%硫酸铵母液250ml
%氯化钙母液250ml
%七水硫酸镁母液250ml
表格2
由于这些母液上个班配的还没用完，所以也就没再配。
培养基的配制
组3发酵培养基的配制（V总）150ml
根据时间表进行接种培养，100ul/瓶，置于摇床30℃，100rmp/min培养。
图四1
活菌数检测
根据时间表进行操作，取菌液100ul+900ul无菌水于EP管中进行连续梯度稀释，然后取100ul在平板培养基上进行涂布。放于培养箱中培养，得下表数据。
活菌数随培养时间变化表
时间（hr）
稀释倍数
菌数
平均值
根据时间表进行对应的时间段酶活的检测，,按照下表进行操作
步骤
试剂
空白
对照
A
B
1
发酵液上清
0ml
0ml
100ul
100ul
2
H2O
100ul
100ul
0ml
0ml
3
醋酸钠-醋酸缓冲液
400ul
4
H2O
1ml
0ml
0ml
1ml
5
1%可溶性淀粉溶液
0ml
1ml
1ml
0ml
6
室温放置反应5min
5min
7
立即加2MNaOH
表格4
醋酸钠
pH
醋酸钠
醋酸
表格5
1%
称取可溶性淀粉，用约15ml冷的蒸馏水充分溶解混匀，取约70ml沸腾的蒸馏水，将已经混匀的淀粉悬浮液倒入沸水中，边倒边用玻璃棒搅拌，使淀粉溶解。冷却后，用冷的蒸馏水定容到100ml，备用。
实验前的准备
灭菌
将配好的发酵培养基分装于15个规格为100ml锥形瓶，9ml/瓶
菌液浊度检测
培养时间（hr）
菌液稀释倍数
吸光度值
菌液浊度
3
10
6
10
10
12
50
16
50
19
18
50
21
50
24
50
27
未检测
30
未检测
表四4
图四10
酶蛋白的提取
取培养菌液于离心管中，进行5000rmp，10min离心。取上清，加入50ml冰的无水乙醇，放入4℃冰箱1h。5000rmp，20min离心。弃上清，加入1ml蒸馏水，混匀溶解。改变醋酸钠-醋酸缓冲液pH进行酶活力检测，得以下数据
关于生物制药组实训实习报告及心得体会
实训主要内容：
活菌数的检测、酶活检测、菌液浊度的检测、酶蛋白的提取
组3组员
1
2
表1
根据实训时间，列出下列表格，以便后续的实验
培养时间（h）
接种时间
取样时间
3
8:30—9:00
12:00
6
8:30—9:00
15:00
8:30—9:00
16:30
12
下午16:30（20:00）
注意事项：在使用仪器时，样品室使用完都要清洗，样品室的石英窗应保持清洁，样品室石英窗不应有污染。
菌液浊度检测
按照培养时间的不同对菌液稀释10倍操作是取菌液+水，共3只，所测结果取平均值。对菌液稀释50倍操作是取1ml菌液+4ml水，再从中取出+水，即得稀释50倍，共3只，所测结果取平均值。下表为所得数据
蛋白提取酶活力表
pH值
空白
对照
A
B
酶活力
59
214
286
表四5
图四11
注意事项：加入的无水乙醇一定是要冰的，不然容易使酶失活。
细菌的染色和镜检
1.滴加少量种子液于干净载玻片上，用镊子置于酒精灯上端干燥。
2.待到种子液干燥后，滴加结晶紫染液于细菌涂抹处，使其布满菌膜，染色1min，用蒸馏水洗去多余染液，甩干载玻片上的积水。