11遗传性疾病的分子诊断

（3）等位基因特异性PCR（ASPCR）:
突变引物
突变
TTTATTT AAATAAAGGC
PCR
产物
杂合子
AAAAAAAGGC TTTTTTT
正常引物
PCR
产物
无突变
（4）芯片技术 多采用PCR体外扩增结合DNA芯片反向点 杂交检测技术，可快速准确检测人临床全 血样本中β珠蛋白基因上多个基因位点的
该病常见于非洲和美洲黑人，因为杂
合基因型细胞贫血症状轻微，但红血球内
的轻微缺氧对寄生在红血球里的疟原虫却
是致死的，有利于防止疟疾的流行。
1.镰状细胞贫血的分子机理 由于β珠蛋白基因中第6个密码子的序 列由原来的GAG改变成GTG，导致β珠蛋白 肽链的第6位氨基酸残基由原来的谷氨酸改 变成缬氨酸，改变后的血红蛋白称谓镰状 血红蛋白（HbS）。该血红蛋白四聚体在脱 氧时，聚集成阵列，几乎变为结晶体，使 红细胞发生镰变（sickling）,弹性几乎丧 失，无法通过直径比红细胞小的毛细血管。
血红蛋白HbA基因
（一）α 珠蛋白基因
16p13.3
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（二）β 珠蛋白基因
11p15.5
不同阶段的血红蛋白基因表达 和血红蛋白组成
（二）镰状细胞贫血
镰刀型贫血症是一种遗传性贫血症，
属隐性遗传性疾病。患者的红细胞缺氧时
变成镰刀形，失去输氧的功能，破裂造成
严重贫血。
PND和PGD的适应症
PND：通过对绒毛组织或羊水细胞的基因分 析，可诊断100多种单基因遗传病。 PGD：采用极体分析法对30多种遗传病进行 诊断。

PND和PGD的适应症
A．有可能孕育出严重遗传性疾病和先天性畸形胎儿 的孕妇。 B．夫妇一方有某种遗传病或曾生出过某种遗传病患 儿，或孕妇有X伴性隐性遗传病家族史。 C．夫妇任何一方为染色体异常、染色体平衡移位和 倒位携带者。 D．早孕阶段曾服用过致畸药物或曾有病毒感染史等 致畸情况。 E．羊水过多或过少。 F．原因不明的多次流产、死胎、死产的孕妇。 G．胎儿发育迟缓。 H．未触到正常的胎儿。 I．年龄超过35岁的孕妇等等。
控制疾病的染色体和基因性质的不同，可 以将人类单基因病分为：
常染色体遗传 单基因病 X连锁遗传
线粒体遗传
遗传学的诊断方法可以简单的分为 以下的四类：
1.染色体水平的诊断：采用细胞遗传学技术进行染色体 核型分析，比如荧光原位杂交法（FISH）。 2.基因水平的诊断：包括限制性片段长度多态性的酶切 分析、基因型和单体型的连锁和关联分析、基因的 序列分析。 3.蛋白质水平的诊断：采用分子生物学技术分析异常表 达的蛋白质或代谢产物，如蛋白质芯片等。 4.疾病动物模型的辅助诊断：建立相应的转基因疾病动 物模型，辅助诊断或判定人类疾病的致病基因。
βA βS βC βA βS βC
基因序列 密码子 5 6 7 …CCTGAGGAG… …CCTGTGGAG… …CCTAAGGAG… 对应氨基酸 …Pro Glu Glu… …Pro Val Glu… …Pro Lys Glu…
2.镰状细胞贫血的分子诊断方法
限制性内切酶MstⅡ识别序列为CCTNAGG， N为任意核苷酸。 因此β 珠蛋白基因的第5、6、7密码子中有 该内切酶的识别位点。发生镰状突变后该酶 切位点消失。
（2）PCR-ASO法：
当基因的突变情况完全明了时，可以合 成等位基因特异的寡核苷酸探针（allelespecific oligonucleotide,ASO），长度通常为 20bp左右。一种探针与正常基因杂交，另一 种探针与突变基因杂交，即将突变的基因区 别开来.
PCR先将含有突变点的基因进行扩增， 然后再与ASO探针作点杂交。优点是灵敏、难 确，缺点是一次杂交只能检测一种突变。
地中海贫血（thalassemia）是由于 珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见 的单基因遗传性、溶血性疾病 。
血红蛋白H
α 地中海贫血
1. α 地中海贫血遗传特征 （1）由于基因缺失导致的α地中海贫血基因型 表 型 基因型
正常人
α地中海贫血Ⅱ（静止型）
αα/αα
α -/αα
α地中海贫血Ⅰ（标准型）

第一节
遗传性疾病的
分子诊断策略和方法
遗传性疾病主要分为两大类： 符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病 不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传 病（又称多因素性疾病）
单基因遗传病的特点是病种多、在特定家系
中发病率高、对群体的影响小； 而多基因遗传病是以病种相对较少、不仅在 特定家系中发病率高、而且对群体的影响 大为其特征。
β 地中海贫血
1.遗传特征：突变是β地中海贫血的主要 发病原因。如果突变发生在β基因的启动 子区域则转录的β链mRNA水平下降；如果 突变发生在剪接信号附近则导致异常的剪
接；如果在结构基因中发生突变，导致β
珠蛋白链的合成量减少、根本没有或产生
异常的β珠蛋白链。
（1）重型β珠蛋白生成障碍性贫血，又称为
密码子 5 6 7
… CCT · GAG · GAG…
… CCT · GTG · GAG…
βA βC
正常
βS 镰状突变
… CCT · AAG · GAG…
… CCT · NAG · … G
限制性内切酶识别序列
RFLP / MstII test for Sickle-Cell Anemia
（二）地中海贫血
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多态性在人群中出现的频率应大于1%（如小 于1% 常认为是异常突变）。 在生物进化过程中形成的，它本身并不致病 或于遗传病有直接联系，故称为“中性突 变”。 人类的23对染色体中，每一条上都带有许多 遗传多态性位点，其中一些位点在染色体上 的位置与致病基因靠的很近，甚至连锁在一 起遗传，并且呈孟德尔式遗传。因此，可利 用这一多态性位点作为遗传指示标记。

（二）片段性突变的检测
片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱
基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增 和重组。 对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检 测点突变的方法； 而对于大的片段突变，则使用Southern印 迹技术和多重PCR技术。
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二、间接诊断策略和方法
断的前提是被测基因已经克隆，其核酸序列
和结构已被阐明。直接诊断策略主要涉及以 下几个方面。
（一）点突变的诊断
点突变即DNA分子中的一个碱基被另一
个碱基所替换，其后果取决于替换的性质
和位置。
对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可 以采取直接检测基因点突变的方法如等位 基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）、等位基 因特异性扩增（ASA）、PCR－RFLP、连接 酶链反应(LCR)、基因芯片技术进行诊断； 对于一些基因背景未知的点突变，可以采 用单链构象多态性（PCR-SSCP）、变性梯 度凝胶电泳（DEEG）、异源双链分析 （HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等方 法。
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第十五章 遗传性疾病分子诊断
生物化学与分子生物学学科 2011.4
Molecular diagnosis of genetic disease
遗传疾病分子诊断是指通过分析患者遗传物 质结构或表达水平的变化，对人体健康状态 和疾病做出或辅助诊断的方法。 评估基因的存在和缺陷---DNA 评估基因的表达量---RNA、蛋白质
β0珠蛋白生成障碍性贫血，基因型为纯合子
β地/β地，两个β基因都发生突变，使其不
能合成正常的β珠蛋白，没有血红蛋白A的合
成，患者几乎靠输血维持生命。
（2）β珠蛋白生成障碍性贫血，又称为β+ 珠 蛋白生成障碍性贫血，其基因型为杂合子 β地/β，其中一个基因正常，贫血症状较轻。
β 地中海贫血常见突变位点
2．分子诊断方法
PCR和基因点突变检测技术是β地中海贫 血基因诊断的主要手段，常用的方法有： （1）PCR-RDB法(反向斑点杂交)：
先将探针固定在尼龙膜上，再将待测的 DNA样本(一般是经PCR扩增的产物)与之杂 交，一次就可以判断某一基因的各种突变 情况。
扩增的引物为： Bio-C1：5′-GTACGGCTGTCATCACTTAGACTTCA-3′
所有遗传性疾病都与某种或多种基因的
突变有关，对这类疾病进行分子诊断有两
种策略可供选择：
1. 直接诊断策略；
2. 间接诊断策略；
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一、直接诊断策略和方法
遗传性疾病分子诊断的直接策略就是通
过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性
疾病的各种基因突变，如基因的缺失、插入、
倍增或者是点突变等遗传缺陷。因此直接诊
间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志
三代遗传标志：
1.RFLP 2.STR(short tandem repeats), VNTR(variable number of tandem repeats) 3. SNP(single nucleotide polymorphism)
三代分子标记进行家系、群体等连锁分析， 找出致病基因。 基因芯片、快速测序等高通量分析手段。
目前大多数遗传性疾病的致病基因尚未被定 位和阐明，因此无法进行直接诊断，还有一些 基因长度数百到数千碱基，突变种类多且分布 广泛，这种情况下突变检测便十分复杂和困难， 此时要用间接诊断策略进行诊断 采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因 缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍 体型等，并判定被检者是否有这条存在基因缺 陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体 型等。
突变。
第三节 产前遗传缺陷的分子诊断
产前诊断 PND Prenatal diagnosis

植入前遗传学诊断 PGD Preimplantation genetic diagnosis

诊断主要分二个层次
一、染色体水平的诊断 主要技术：FISH 染色体数目异常：非整倍体 染色体结构异常：染色体易位、带型改变 二、基因水平的诊断 采用的方法受样本量少限制 巢氏PCR

第二节 遗传病的分子诊断
一、血红蛋白病 hemoglobinopathy 血红蛋白由两条α 珠蛋白肽链和两条其 他珠蛋白肽链组成的四聚体。
血红蛋白病可以分为二类：
①由于珠蛋白一级结构的变化所导 致的异常血红蛋白病； ②由于珠蛋白多肽链的合成速率不 平衡所导致的地中海贫血。
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六种正常血红蛋白的肽链组成和正常人血中的浓度 血红蛋白种类 肽链组成 (分子式) 正常成人血中 的浓度（%）
HbA(A1)
HbA2 HbF Gower1 Gower2 Portland
α2 β2
α2 δ2 α2 γ2 ζ2 ε2 α2 ε2 ζ2 γ2
95～98
2～3 ～1(胎儿期) 无（胎儿期早期） 无（胎儿期早期） 无（胎儿期早期）
Bio-C2：5′-TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT-3′
Bio-C3：5′-GTGTACACATATTGACCAAA-3′
402bp
Bio-C4：5′-AGCACACAGACCAGCACGTT-3′
423bp
中国人中已发现有21种β珠蛋白基因的 突变型，使用固化在膜上的11种探针可以检 测出98%以上的中国人β地中海贫血突变基因 型。
Hb H病（β4） Hb Bart’s（胎儿水肿综合症，γ 4）
- -/αα
α- / - - -/ - -
（2）由于以下基因突变导致α地中海贫血 ①点突变
②移码突变
③无义突变 ④mRNA加尾信号突变 ⑤终止密码子突变
2.分子诊断方法
（1）PCR法
扩增产物194bp：Bart’s水肿胎儿； 扩增产物194bp和287bp：HbH病或α地中海贫血Ⅰ； 扩增产物287bp：正常人或α地中海贫血Ⅱ 。
（2）Southern印迹法Βιβλιοθήκη Baidu
α地中海贫血的基因簇限制性酶切片段长度 α基因探针 δ 基因探针 Bam HⅠ Eco RⅠ Hind Ⅲ EcoRⅠ aa/aa 14 23 16.5，13 23，5 --/-20，13 17，5 -a3.7/aa 10.3 19.3 ND ND -a4.2/aa 9.8 18.8 ND ND
The PGD process. In some laboratories, the embryo is allowed to grow for up to
five days so that cells are removed from the blastocyst, rather than the blasomere.