化学发光免疫分析技术原理及优势

化学发光免疫测定是目前世界公认先进的标记免疫测定 技术，化学发光免疫分析技术具有高度的准确性和特异性 ，成为检验方法中最为重要的技术之一。化学发光免疫分 析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功 能、传染性疾病、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲 状腺功能等方面的体外诊断实验中。
化学发光免疫分析的优势
Φ CL =Φ CE·Φ EM (1)
式中,Φ CL为化学发光效率,Φ CE为生成激发态的效率, Φ EM为激发态的发光效率。Φ CE和Φ EM分别定义为：
Φ CE = 生成激发态的分子数/ 参加反应的分子数 (2)
Φ EM = 发光的分子数/ 生成激发态的分子数
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(3)
从(1) 、(2) 、(3) 式得化学发光的效率Φ CL等价于生 成荧光和磷光的量子效率。即:
2.2 化学发光原理
化学发光(Chemiluminescence, CL)是化学物质在特定 化学反应中产生的光辐射。通过高能中间体的分解在化学 反应中激发单态分子形成,分子被激发后是不稳定的,它要 释放出多余的能量而回到基态,其中部分的能量以发光形式 释放出来。因此,任何一个化学发光反应包括两个过程:激 发和发光过程。一些激发态分子能量也会通过系间串跃和 系内串跃而消失。因此,化学发光反应的效率是:
• 灵敏度高
• 灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度可 达 10-22 mol/L （ RIA 为 10 -12 mol/L ）。化学发光 免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无 法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。
• 宽的线性动力学范围
• 发光强度在 4 ～ 6 个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与 显色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）为 2.0 的范围相比，优势明显。 虽然 RIA 也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。
• 光信号持续时间长
• 辉光型的 CLIA 产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了 实验操作及测量。
• 分析方法简便快速
• 绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。
• 结果稳定、误差小
• 样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光 散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。
Φ CL = 发光的分子数/ 参加反应的分子数 (4)
2.3 化学发光免疫分析的原理
化学发光免疫分析法是化学发光和免疫分析结合的产物 。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选 择性。化学发光免疫分析是用化学发光反应的试剂标记抗 原或抗体, 标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免 疫反应和理化步骤,最后以测定发光强度形式测定待测物的 含量。
由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生 的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从 标准曲线上计算出待测抗原的含量。
直接化学发光的机理
--- 夹心法
+ + 磁微粒 抗体
被测抗原
带吖啶酯 标记物抗
体
（1） 加入H2O2 （pH<10）
冲洗后
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
磁微粒技术
2.1 免疫分析原理
免疫分析是利用抗原与抗体特异性结合形成抗原2抗体复合 物而建立起来的一种高选择性的分析方法, 根据其检测方法可 分为非标记免疫分析和标记免疫分析。非标记免疫分析是利用 抗原与抗体结合形成抗原2抗体复合物后, 其理化性质发生改变 ,出现肉眼可见的沉淀、凝集等现象,利用这些现象来检测待检 物。标记免疫分析是在不影响抗原、抗体生物活性的基础上将 标记物质标记在抗原或抗体上, 然后进行免疫反应形成抗原2抗 体复合物, 再对标记质进行检测, 从而间接检测待检物的方法 。目前常用的标记物有放射性的125 I, 非放射性的碱性磷酸酶 、辣根过氧化物酶, 镧系稀土元素等。
• 安全性好及使用期长
• 免除了使用放射性物质。到目前为止，还未发现其危害性；试剂稳定，保存期可达一 年。
二、化学发光免疫分析基本原理
化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化 学发光分析系统。免疫反应系统是将标记物质标记在抗原 或抗体上, 经过特异性免疫反应后,形成抗原2抗体复合物 。然后进行对标记物进行检测, 来测定待检物。化学发光 分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的 氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回 到稳定的基态时, 同时发射出光子, 利用发光信号测量仪 器光量子产率。
三、化学发光免疫分析的类型
化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大 类,即化直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电 化学发光免疫分析法。
3.1 直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相 应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗 体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加 入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在 不需要催化剂的情况下分解、发光 。
化学发光免疫分析
一、化学发光免疫技术的概念 二、化学发光免疫分析基本原理 三、化学发光免疫分析的类型 四、临床应用 五、发展与展望
一、化学发光免疫技术的概念
化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光 的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光 系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与 待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入 化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或 定性检测。
磁微粒模式图
特点 – 抗原和抗体结合与未结合 部分的易分离
Y
3.2、化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗 体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成 固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入 底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接 收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们 传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。