细菌的染色及观察精品PPT课件
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微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色(共7张PPT)
微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色
二、实验原理
1、细菌的简染色原理
①细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力， 从而更清楚地观察到其形态和结构。 ②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染 色局部带正电荷〔酸性染料的染色局部带负电荷〕，因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌 体着色。
2、细菌革兰氏染色的原理
G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保存初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫 色。 G-菌细胞壁的外膜层富含类脂，而且其肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被 溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出，而使菌体变成无色，再经番红 复染就成为红色。
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二、实验原理
1、细菌的简染色原理
①细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力， 从而更清楚地观察到其形态和结构。 ②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染 色局部带正电荷〔酸性染料的染色局部带负电荷〕，因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌 体着色。
2、细菌革兰氏染色的原理
G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保存初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫 色。 G-菌细胞壁的外膜层富含类脂，而且其肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被 溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出，而使菌体变成无色，再经番红 复染就成为红色。
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细菌染色和涂片观察方法
→ （脱色）→（复染）
细菌染色和涂片观察方法
1、 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可 直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液 体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培 养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻 片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研 磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2 份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火 焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤 干。
细菌染色和涂片观察方法
常用染色法
细菌的常用染色法有：单染色法、复染色 法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光 染色法等。
细菌染色和涂片观察方法
（一）、单染色法：
单染色法是指用一种染料进行染色的方法 。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种 细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只 能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别 价值不大。
细菌染色和涂片观察方法
（1）、革兰氏染色的方法：
细菌染色和涂片观察方法
固定—→初染—→媒染—→脱色
（结晶紫或龙胆紫）
（ 卢戈氏碘液）
（95%酒精）
—→复 染 （稀释复红）
细菌染色和涂片观察方法
固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP”
（Gram’s Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G¯”或“GN”（
细菌染色和涂片观察方法
2、 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目 的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化 高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。
细菌染色和涂片观察方法
1、 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可 直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液 体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培 养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻 片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研 磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2 份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火 焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤 干。
细菌染色和涂片观察方法
常用染色法
细菌的常用染色法有：单染色法、复染色 法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光 染色法等。
细菌染色和涂片观察方法
（一）、单染色法：
单染色法是指用一种染料进行染色的方法 。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种 细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只 能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别 价值不大。
细菌染色和涂片观察方法
（1）、革兰氏染色的方法：
细菌染色和涂片观察方法
固定—→初染—→媒染—→脱色
（结晶紫或龙胆紫）
（ 卢戈氏碘液）
（95%酒精）
—→复 染 （稀释复红）
细菌染色和涂片观察方法
固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP”
（Gram’s Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G¯”或“GN”（
细菌染色和涂片观察方法
2、 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目 的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化 高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。
04-细菌的革兰氏染色观察
一、实验目的：
1、学习微生物涂片、染色的操作技 术，掌握细菌单染色法、革兰氏染色的 方法；
2、学习并掌握油镜的原理和使用方 法。
二、原理：
（一）油镜： 显微镜的分辨力是指显 微镜能够辨别两点之间最 小距离的能力。 显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示： 能辨别两点之间最小距离D=λ/（2NA） 式中 λ=光波波长 NA=物镜的数值孔径 物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的 分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区 别出。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55µm。
细胞壁 厚度与强度 肽聚糖数量、含量
脂类含量 磷壁酸（垣酸） 脂多糖、磷脂、脂蛋白
革兰氏阳性菌 (G+)
革兰氏阴性菌 (G-)
厚、致密、坚韧
薄、疏松
多层、含量高、占细胞 干重40—90%
少、占细胞干重1-4%
单层、含量低、占细胞 干重5—10%
多、占细胞干重11-22%
+
-
-
+
磷壁酸 肽聚糖 脂蛋白
2、革兰氏染色：涂片 → 干燥 、固定→ 结晶紫染色2分钟→细水冲洗→碘液媒染1 分钟 →细水冲洗→95%酒精脱色 15秒→ 水 洗 →蕃红溶液复染 1-2分钟 → 水洗 →干 燥→镜检。
染色操作步骤—涂片固定
取菌液一环
涂片
干燥 干燥
滴生理盐水
挑取菌苔一环
涂片
热固定
取菌涂片的无菌操作图解
细水冲洗
此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别 细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。
（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用
至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。
实验 细菌的染色.ppt
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有：
革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 荚膜染色法等。
2019-9-15
感谢你的欣赏
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革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细 菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+） 和革兰氏阳性（G-）
2) 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净， 否则可能损害镜头
3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去 镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二 甲苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用 一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
2019-9-15
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2、革兰氏染色
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
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思考题
简单染色:
(1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节? (2) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、
时间太长，又会怎样呢？
革兰氏染色: (1) 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节
是什么? (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆茵的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰
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2、干燥 室温自然干燥
操作步骤（continued）
3、固定
固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。
固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态
2019-9-15
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微生物学实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
• 染色原理是利用细菌的细胞壁成分和结构的不同
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁的比较
细胞壁 质地 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 外膜
G+菌 坚韧 20-80nm 15-50 50-80%（干重） 约45% 1-4%
+ —
G-菌 疏松 10-15nm 1-2 5-20%（干重） 15-20% 11-22%
实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞 形态图。如果染色结果不理想，请分析原因。 （2） 思考: 进行革兰氏染色的意义?
细菌的基本结构
一、细胞壁 二、细胞膜 三、细胞质 四、核质
细菌的特殊形态结构
• 芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
• 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 • 鞭毛：运动，菌落形态。
实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法
• 了解细菌的特殊形态结构： 荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢
• 了解细菌在环境(空气、污水),人体(皮肤、 口咽腔)中的分布
革兰氏染色法基本原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有 的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏 阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。 G+ -紫色 G- - 红色
细菌荚膜的观察
主要成分是多糖、 多肽或蛋白质， 尤以多糖居多。
荚膜
细菌鞭毛的观察
菌毛
芽胞
肉毒梭菌
破伤风芽孢杆菌
了解细菌在环境中的分布 空 气: 每组一个琼脂培养皿 污 水: 每组一个琼脂培养皿
了解细菌在人体中的分布 皮 肤: 2人一个琼脂培养皿红 1min——水洗
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁的比较
细胞壁 质地 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 外膜
G+菌 坚韧 20-80nm 15-50 50-80%（干重） 约45% 1-4%
+ —
G-菌 疏松 10-15nm 1-2 5-20%（干重） 15-20% 11-22%
实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞 形态图。如果染色结果不理想，请分析原因。 （2） 思考: 进行革兰氏染色的意义?
细菌的基本结构
一、细胞壁 二、细胞膜 三、细胞质 四、核质
细菌的特殊形态结构
• 芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
• 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 • 鞭毛：运动，菌落形态。
实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法
• 了解细菌的特殊形态结构： 荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢
• 了解细菌在环境(空气、污水),人体(皮肤、 口咽腔)中的分布
革兰氏染色法基本原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有 的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏 阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。 G+ -紫色 G- - 红色
细菌荚膜的观察
主要成分是多糖、 多肽或蛋白质， 尤以多糖居多。
荚膜
细菌鞭毛的观察
菌毛
芽胞
肉毒梭菌
破伤风芽孢杆菌
了解细菌在环境中的分布 空 气: 每组一个琼脂培养皿 污 水: 每组一个琼脂培养皿
了解细菌在人体中的分布 皮 肤: 2人一个琼脂培养皿红 1min——水洗
微生物的染色及观察
实验二微生物的染色及观察一、细菌的简单染色法1 实验目的1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。
1.2 掌握细菌的简单染色法。
1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。
2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。
其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3 材料3.1 菌种枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、面包酵母琼脂斜面培养物。
实验教师可根据具体情况提供合适的菌种。
3.2 染色剂吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。
3.3 仪器或其他用具显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。
4 流程涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
5 步骤5.1 涂片取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
细菌革兰氏染色PPT课件
细菌革兰氏染色ppt课件
目录
• 引言 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的应用和限制 • 结论
01 引言
目的和背景
目的
介绍革兰氏染色的原理、方法及应用，帮助学习者更好地了解和掌握这一基本 染色技术。
背景
革兰氏染色是细菌学中最经典、最常用的染色方法之一，通过对细菌的染色， 可以将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于临床诊断和治疗具有 重要的指导意义。
结合其他技术
将革兰氏染色与其他技术如分子生 物学、免疫学等相结合，实现更精 确的细菌分类和鉴别。06Βιβλιοθήκη 结论总结革兰氏染色的重要性
临床诊断的关键工具
革兰氏染色是临床微生物实验室的基 本技术，用于快速识别细菌种类，对 准确诊断感染和选择合适的治疗方案 至关重要。
指导抗生素选择
科研的基础
在科研领域，革兰氏染色是研究细菌 种群结构、进化、生态和致病性的重 要手段。
染色
染色
用革兰氏染色液对固定后的涂片进行 染色，分别使用结晶紫、碘液和脱色 液进行初染、媒染和脱色处理。
染色注意事项
染色时应按照规定的步骤进行，避免 染色过度或不足，同时要确保染色液 的新鲜度和浓度适宜。
脱色
脱色
用脱色液对染色后的涂片进行脱色处理，以 去除菌体表面的结晶紫和碘液。
脱色注意事项
脱色时应控制脱色时间和脱色液的用量，避 免脱色过度或不足，影响染色效果。
革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色利用了细菌细胞壁的成分 和结构对染料亲和性的差异，通过结 晶紫初染和碘液媒染后，由于细胞壁 组成成分对革兰氏染料的吸附能力不 同，酒精脱色时，细胞壁对染料的吸 附能力不同，从而导致被脱色的程度 不同，最终影响了复染后细菌的着色。
目录
• 引言 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的应用和限制 • 结论
01 引言
目的和背景
目的
介绍革兰氏染色的原理、方法及应用，帮助学习者更好地了解和掌握这一基本 染色技术。
背景
革兰氏染色是细菌学中最经典、最常用的染色方法之一，通过对细菌的染色， 可以将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于临床诊断和治疗具有 重要的指导意义。
结合其他技术
将革兰氏染色与其他技术如分子生 物学、免疫学等相结合，实现更精 确的细菌分类和鉴别。06Βιβλιοθήκη 结论总结革兰氏染色的重要性
临床诊断的关键工具
革兰氏染色是临床微生物实验室的基 本技术，用于快速识别细菌种类，对 准确诊断感染和选择合适的治疗方案 至关重要。
指导抗生素选择
科研的基础
在科研领域，革兰氏染色是研究细菌 种群结构、进化、生态和致病性的重 要手段。
染色
染色
用革兰氏染色液对固定后的涂片进行 染色，分别使用结晶紫、碘液和脱色 液进行初染、媒染和脱色处理。
染色注意事项
染色时应按照规定的步骤进行，避免 染色过度或不足，同时要确保染色液 的新鲜度和浓度适宜。
脱色
脱色
用脱色液对染色后的涂片进行脱色处理，以 去除菌体表面的结晶紫和碘液。
脱色注意事项
脱色时应控制脱色时间和脱色液的用量，避 免脱色过度或不足，影响染色效果。
革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色利用了细菌细胞壁的成分 和结构对染料亲和性的差异，通过结 晶紫初染和碘液媒染后，由于细胞壁 组成成分对革兰氏染料的吸附能力不 同，酒精脱色时，细胞壁对染料的吸 附能力不同，从而导致被脱色的程度 不同，最终影响了复染后细菌的着色。
《细菌染色技术》课件
常用的脱色液有乙醇、丙酮等，脱色时间需要根据染色液和染色方法而定。
复染的目的是使染色后的细菌更加清晰可见，常用的复染液有稀释复红、稀释结晶 紫等。
干燥与镜检
干燥与镜检是细菌染色技术的最 后步骤，需要将染色完成的载玻 片干燥后进行显微镜检查，以便
观察染色效果和细菌形态。
干燥过程中需要注意避免过度加 热或干燥，以免影响染色效果。
01
02
03
04
简单染色法
利用单一染料对细菌进行染色 。
复染色法
利用两种或多种染料对细菌进 行染色，以便区分不同的细胞
结构。
荧光染色法
利用荧光染料对细菌进行染色 ，通过荧光显微镜观察。
特殊染色法
针对某些特殊性质或结构的细 菌，采用特殊的染色方法。
染色过程中的物理和化学变化
物理变化
染色过程中染料分子与细菌细胞 之间的相互作用，如吸附、渗透 等。
勤洗手
操作后应立即用肥皂和水彻底 清洗双手，确保个人卫生。
废弃物处理
使用过的培养物、染料和其他 废弃物应按照实验室规定进行
安全处理。
染色技术的优缺点和未来发展方向
优点
细菌染色技术是一种简单、快速、有效的细菌检测方法，能够直观地观察细菌的形态和结 构，有助于初步鉴定细菌种类。
缺点
染色技术需要人工操作，容易受到操作者主观因素的影响，且无法对细菌进行深入的分子 生物学鉴定。
《细菌染色技术》 ppt课件
REPORTING
目录
• 引言 • 细菌染色技术的基本原理 • 细菌染色技术的操作步骤 • 细菌染色技术的结果分析 • 细菌染色技术的注意事项和问题解决
PART 01
引言
REPORTING
复染的目的是使染色后的细菌更加清晰可见，常用的复染液有稀释复红、稀释结晶 紫等。
干燥与镜检
干燥与镜检是细菌染色技术的最 后步骤，需要将染色完成的载玻 片干燥后进行显微镜检查，以便
观察染色效果和细菌形态。
干燥过程中需要注意避免过度加 热或干燥，以免影响染色效果。
01
02
03
04
简单染色法
利用单一染料对细菌进行染色 。
复染色法
利用两种或多种染料对细菌进 行染色，以便区分不同的细胞
结构。
荧光染色法
利用荧光染料对细菌进行染色 ，通过荧光显微镜观察。
特殊染色法
针对某些特殊性质或结构的细 菌，采用特殊的染色方法。
染色过程中的物理和化学变化
物理变化
染色过程中染料分子与细菌细胞 之间的相互作用，如吸附、渗透 等。
勤洗手
操作后应立即用肥皂和水彻底 清洗双手，确保个人卫生。
废弃物处理
使用过的培养物、染料和其他 废弃物应按照实验室规定进行
安全处理。
染色技术的优缺点和未来发展方向
优点
细菌染色技术是一种简单、快速、有效的细菌检测方法，能够直观地观察细菌的形态和结 构，有助于初步鉴定细菌种类。
缺点
染色技术需要人工操作，容易受到操作者主观因素的影响，且无法对细菌进行深入的分子 生物学鉴定。
《细菌染色技术》 ppt课件
REPORTING
目录
• 引言 • 细菌染色技术的基本原理 • 细菌染色技术的操作步骤 • 细菌染色技术的结果分析 • 细菌染色技术的注意事项和问题解决
PART 01
引言
REPORTING
-细菌的革兰氏染色观察ppt课件
结晶紫初染2min
碘液媒染1min
细水冲洗
细水冲洗 蕃红复染 1~2min
95%酒精脱色 20s
油镜操作规程
1. 先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到 视野中央。 2. 在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。 3. 使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切 记不能使用粗调，以免压碎载玻片。 4. 用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方 向。 5. 观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦 去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦1～2次，把大部分油去 掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。 擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细 心，动作要轻 。
（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用
至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。
染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发 生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细 胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇 处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细 胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将 结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红 色。
微生物学基础实验
细菌的染色观察
微生物(Microorganism) 形体微小、结构简
单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观
察。
病毒(包括噬菌体)； →非细胞型微生物
细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣
1、细菌的形态结构观察和染色
奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 电源 载物台 视场光阑 载物台调节钮
光强调节钮 粗调节器 细调节器 镜座 孔径光阑
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
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10. 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 11. 用低倍物镜，旋转粗调和微调 来进行对焦。 12. 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 13.
实验一 结束
请交报告！
实 验 一
细菌的形态结构观察和染色
目的要求
观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理 及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽 孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。
安全事项
微生物 酒精灯
灭菌锅
玻璃器皿
超净台（紫外线）
电器（电炉、微波炉…） ……
实验材料 Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1. 2.
简单染色：草酸铵结晶紫染液。 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 95％乙醇、蕃红染液。
实验材料 Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。 肉膏蛋白胨培养基平板。
实验内容
（了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿 饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿 使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin， 水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈 现红色。
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染色剂和染色原理Ⅱ
微生物染色常用染料如下表：
实验材料
• 涂片染色用的细菌培养物
１.大肠杆菌（Escherichia coli) 24h的斜面培养物。 ２.枯草杆菌（Bacillus subtilis) 12—16h的斜面培养物。
• 载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、 无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。
• 染色技术的一般过程
涂
片 干燥 固定 染色 媒染 脱色 复染
水洗 干燥 镜检
实验程序Ⅱ
（简单染色的方法和步骤）
• 简单染色法（一般染色法） １.菌种：牙垢细菌 ２.涂片 ３.干燥：自然气干或酒精灯 高处微微加热。 ４ 固定 ５.染色：在整个涂面上滴加 齐氏石炭酸复红，染色１分 钟。 ６.水洗：倾去染液，用自来 水细流冲洗至流下的水中无 染料颜色为止。
实验 二
细菌的染色和细菌细胞 构造的观察
细菌的染色和细菌细胞构 造的观察
• 目的要求 • 染色剂和染色的原理 • 实验材料 • 实验程序 • 思考题
目的要求
• 学习微生物涂片 • 掌握细菌的一般染色发和革兰氏染色 • 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 • 观察和识别细菌细胞的XXXXXX XX年XX月XX日
录像演示
思考题
• 简单染色法中各步骤的注意事项是什么？ • 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意
哪些操作？关键在哪几步？为什么？
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
14
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
• 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。 物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。 化学因素如：正负离子之间的相互吸引等
• 染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶 紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染 料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物， 不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。
７干燥：空气中自然干燥。 ８ 镜检：在油镜下观察牙垢 中的各种细菌形态并绘图。
实验程序Ⅲ
（革兰氏染色的方法和步骤）
• 革兰氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加 草酸铵结晶紫染液，染1分钟， 倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘 液冲去残水，而后用其覆盖涂 面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加 95%酒精进行脱色约30秒，后 立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1 分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
实验程序Ⅳ
（荚膜染色的方法和步骤）
• 荚膜染色法（示范）：荚膜薄，易变形， 因此在涂片过程中不能用加热固定。 1. 取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂 片，自然干燥，自然固定。 2. 染色：在已自然晾干的涂面上，滴加 1%结晶紫染色液染色2min，以20%硫酸 铜冲洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。 3. 镜检：油镜观察示范片并绘图（菌体 红色，荚膜无色）。
• 染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。
1. 先用刚过滤的鞭毛染色液A染7.5—8min左右。 2. 倾去A液，再加鞭毛染色液B液染3—5min，水洗，自然干 燥。 ３.用Ｃ液石炭酸复红复染２min，水洗、晾干、镜检。
• 油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图 （菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）。
• 显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。 • 示范片
１.苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的芽孢； ２.胶质芽孢杆菌（Bacillus mucillaginosus）的荚膜； ３.枯草芽孢杆菌的鞭毛。
实验程序Ⅰ
（细菌染色的方法和步骤）
• 细菌染色的方法:
• １.单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察 微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴 别微生物以及它的特殊构造等。 ２.复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色， 有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常 用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。
实验程序Ⅴ
（鞭毛染色的方法和步骤）
• 菌液的制备及涂片：菌种应预先连续传代5—6代。 1. 接种：先在斜面底部加入0.5—1mL无菌水，取活化的枯草 杆菌1—2环菌苔，接种于无菌水中，300C 培养15—18h。 2. 制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与 菌种同温的无菌水中，在280C温箱中保温10min。 3. 鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即 可涂片。涂片后自然干燥、固定。