《亲和层析的应用》PPT课件
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《亲和层析》PPT课件
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5. 多孔玻璃珠(商品为Bio-Glass)
• 它的化学与物理稳定性较好，机械强度高，不但 能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和 较剧烈的反应条件。
• 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质 有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团 也少。
• 为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass 的商品都已事先连接了氨烷基(烷基胺)。
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OH
O
偶联
OH
活化
gel
+ CNBr
gel
C NH + RNH2
gel
OH
⑤ 载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸
附的大分子自由通过精。选ppt
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（二）常用载体
• 纤维素 • 琼脂糖凝胶 √ • 聚丙烯酰胺凝胶 √ • 葡聚糖凝胶 • 多孔玻璃珠 √
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1. 纤维素
• 它是自然界中数量最大的大分子生物材料， 取材十分方便。
• 但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利 于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非 特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因， 其应用不如凝胶载体广泛。
• 例如，Sepharose 4B的分子量排阻极限达上百 万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团， 非专一性吸附少。
• Sepharose CL是用1,3-二溴丙烷处理的交联琼脂 糖，它的稳定性明显增加，能在pH 3~14中应用。
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24
3. 聚丙烯酰胺凝胶
• 是由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺经催化聚合形成 的人工合成载体，是具有网状三维空间结构的凝 胶型高聚物，商品名为Biogel P。
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
new实验七GST酶亲和层析及SDSPAGE资料PPT课件
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Biochemistry Experiment 7
12.11.2020
二、细分级分离
v 一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部
分被除去。进一步提纯通常使用高分辨率的柱层析及 电泳方法。
v 常用柱层析方法：分子筛层析、离子交换层析、疏水 吸附层析、亲和层析。
v 常用电泳方法：PAGE、等电聚焦电泳(IEF)。 v 另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的
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Biochemistry Experiment 7
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(4)有机溶剂法
与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在 水中的溶解度显著降低。
有机溶剂引起蛋白质变性的原因有二：
➢ 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化 程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。
1．电泳法 2．层析法 3．沉淀法 4．透析、超滤 5、离心 6、结晶
盐析法 聚乙二醇沉淀法
等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 热变性沉淀法
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Biochemistry Experiment 7
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一、粗分级分离
主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂 沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂 蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量 大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质， 但分辨率低。
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Biochemistry Experiment 7
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亲和层析的原理
v 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可 逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。
v 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对 互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制 剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素 和其受体、DNA与结合蛋白等。
实验 亲和层析纯化IgG PPT课件
2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面 中央~2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止 水夹，室温下样品与填料结合15min。
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
2.5ml
2.5ml
2.5 ml
4 ml
2.5ml
3.3 ml
10% SDS 100 μl
100 μl
100 μl
TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
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10% SDS 100 μl
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TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
亲和层析的原理及应用
亲和层析的原理及应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物分子的技术方法。
它基于生物分子之间的特异性相互作用，例如抗原与抗体的结合。
亲和层析通过利用这种特异性相互作用，将目标分子从混合物中有效地分离出来。
亲和层析可以用于纯化蛋白质、分离细胞、筛选药物等多种应用。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子之间的相互作用。
在亲和层析中，通常使用的是一对具有特定相互作用的分子，例如抗原与抗体、配体与受体等。
这对分子中的一个部分被固定在固相介质上，而另一个部分则与目标分子发生特异性相互作用。
亲和层析的步骤包括：•预处理：选择适当的固相介质，并将其与特异性相互作用的分子配对。
固相介质可以是固定在柱子或颗粒上的化学物质。
•样品加载：将待分离的混合物样品加到预处理后的固相介质上。
目标分子与固相介质上的特异性配对分子发生结合。
•洗涤：用缓冲液将非特异性结合的物质洗掉，以减少背景噪音。
•洗脱：用特定的洗脱液冲洗固相介质，破坏特异性相互作用，使目标分子从固相介质上解离出来。
•收集纯化物：通过收集洗脱液中的目标分子来获取纯化物。
3. 亲和层析的应用亲和层析在生物科学研究和工业领域中得到了广泛的应用。
以下是亲和层析的一些常见应用：3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于纯化蛋白质。
通过将特异性配对的分子与待分离蛋白质结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标蛋白质从混合物中高效地纯化出来。
亲和层析在蛋白质研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
3.2 细胞分离亲和层析可以用于分离特定种类的细胞。
通过将细胞与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标细胞从混合物中分离出来。
这在细胞学研究和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。
3.3 药物筛选亲和层析可以用于筛选药物候选物。
通过将潜在药物分子与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以筛选出具有特定相互作用的药物候选物。
这在药物研发过程中有着重要的应用价值。
3.4 DNA/RNA纯化亲和层析也可以用于DNA/RNA的纯化。
亲和层析技术在生物科学中的应用幻灯片
The development of affinity chromatography technique is very fast in recent years，remarkable accomplishments have been achieved in the separation and purification of biomolecules and organisms as well as in studying the interactions between biomolecules．The commonly used different ligand types and recent progress in searching for
1 常规材亲和层析的类型
• 1.1 材生物亲和层析(BAFC)
• 生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特
异性相互作用物质对的亲和层析．通常具有高的 选择性，典型的物质对有酶．底物、酶．抑制剂、 激素．受体等．
• 1.2 免疫亲和层析(IAFC)
•
许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过利用抗
原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的别离
引言
•
亲和层析(affinity chromatography)是利用偶联亲
和配体的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物。它具
有很高的选择和别离性能以及较大的载量，只需要一步处
理即可使某待别离的生物大分子从复杂的混合物中别离出
来，到达千倍以上的纯化，并保持较高的活性，是别离纯
化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。
系统，称免疫亲和层析．免疫亲和层析应用相当 广泛．许多亲和层析纯化蛋白质过程已经使用了 单克隆抗体作为亲和配体．
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
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二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
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例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
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双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
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其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
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其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
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四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
亲和层析优秀课件
亲和层析优秀课件
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
《亲和层析的应用》课件
疾病诊断和治疗
亲和层析在疾病诊断中的应用：通过亲和层析技术，可以快速准确地 检测出疾病标志物，如肿瘤标志物、病毒抗原等。
亲和层析在疾病治疗中的应用：亲和层析技术可以用于分离和纯化 药物，提高药物的疗效和安全性。
亲和层析在药物研发中的应用：亲和层析技术可以用于筛选和优化药 物分子，提高药物研发的效率和成功率。
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亲和层析的应用
汇报人：
目录
01 02 03 04 05 06
添加目录项标题 亲和层析技术概述 亲和层析的实验流程 亲和层析在生物医药领域的应用 亲和层析在环境科学领域的应用 亲和层析在其他领域的应用
01
添加目录项标题
02
亲和层析技术概述
亲和层析技术的定义
亲和层析技术是一种生物化学分离技术 利用生物分子之间的特异性相互作用进行分离 包括亲和吸附、亲和萃取、亲和色谱等方法 广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等生物大分子的分离纯化
农药残留检测： 亲和层析可用 于检测农产品 中的农药残留， 提高食品安全
性
土壤污染物检 测：亲和层析 可用于检测土 壤中的污染物， 如重金属、有
机污染物等
植物基因工程： 亲和层析可用 于植物基因工 程的研究，如 基因克隆、基
因表达等
食品科学领域的应用
蛋白质分离：用于分离不同蛋白质，如乳清蛋白、大豆蛋白等 食品添加剂分离：用于分离食品添加剂，如色素、防腐剂等 食品污染物去除：用于去除食品中的污染物，如重金属、农药残留等 食品品质控制：用于控制食品品质，如糖度、酸度等
ห้องสมุดไป่ตู้
工业生产领域的应用
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 色素等
《亲和层析》课件
固定相可以是蛋白质、核酸、多糖等生物 大分子
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
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亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
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亲和层析的应用
精选ppt
1
亲和层析
➢ 亲和层析（affinity chromatography）是 利用待分离物质和它的特异性配体间具有 特异的亲和力，从而达到分离目的的一类 特殊层析技术。
➢ 亲和层析法具有多方面的应用。
精选ppt
2
核酸的纯化
➢ 因为DNA与RNA之间具有专一性的亲和力， 所以亲和层析可应用于核酸的研究，例如 从大肠杆菌的RNA混合物中分离出专一于 噬菌体T4 的RNA，可将T4的DNA以共价键 结方式接于cellulose材质的管柱中，再将 所要的RNA分离出。
精选ppt
9
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 发酵产物经过盐析操作以后，得到层析用 样品。
➢ 他们利用一种脂溶性凝胶SepherdexLH20 作为胆固醇的载体,其分离的分子量小于 3000。胆固醇也为脂溶性的化合物,与凝胶 LH20有很好的相容性,而酶蛋白不能进入凝 胶。
精选ppt
10
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 他们每次进行实验时加入1~5ml的样品,用 1~5倍体积的缓冲液A洗去杂物,流速为 0.5~2ml/min；然后再用缓冲液B洗脱酶蛋 白,流速为015~2ml/min。
精选ppt
11
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 他们对表面活性剂的浓度和洗脱速度的条 件进行了考察，得到用亲和层析分离纯化 胆固醇氧化酶,酶比活从0.45U/mg提高到 15.5U/mg。亲和层析的适合条件为洗脱液 A的流速是015ml/min,洗脱液B的流速是 210ml/min。
精选ppt
4
抗体与抗原的纯化
➢ 抗体与抗原结合具有高度专一性， Sepharose是这一类亲和层析较佳的载体， 由于抗原-抗体复合物的解离常数很低， 因此抗原在固定化抗体上被吸附后，要尽 快将它洗出，冲洗液的条件通常是控制 pH值至3以下，成份为醋酸、盐酸、TrisHCl缓冲液、20% 甲酸或1mol/L 丙酸， 也有使用尿素这一类的蛋白质变性剂作为 洗出用的溶液。
精选ppt
5
酶和酶的抑制剂纯化
➢ 使用亲和层析法纯化酶，可以得到相当好 的效果。例如，要分离猪和牛的胰蛋白酶， 可以连接鸡卵黏蛋白（胰蛋白酶的抑制剂） 与Sepharose 4B当作层析柱材质，用它纯 化出来的胰蛋白酶相当于5次再结晶的纯度。
➢ 除了使用抑制剂当配体，也可以反过来用 酶作为配体来纯化抑制剂，例如，将胰蛋 白酶接到Sepharose上，能有效分离纯化 大肠杆菌中的胰蛋白抑制剂Ecotin。
➢ 此外，根据核酸与蛋白质之间交互作用的 原理，可以将单股DNA接在Sepharose上， 纯化DNA聚合酶或RNA聚合酶。
精选ppt
3
激素受体的纯化
➢ 激素受体是细胞膜上与特定激素结合的成 份，激素和受体的作用具有特异性，目前 用亲和层析法已经能够将激素与sephrose 的组合，纯化胰岛素、正甲状腺素的受体。
➢ 实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶, 但是从实际操作和经济角度考虑，该法不 适合大规模处理。
精选ppt
12
谢谢大家！
精选ppt
13
精选ppt
6
亲和层析的应用
Chitin
几丁质
Trypsin
胰岛素
CHOM
鸡蛋粘多糖蛋白
精选ppt
7
亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 季文明,陈毅力等 ➢ 江南大学生物工程学院
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8亲和层析法分离胆固醇氧源自酶➢ 胆固醇氧化酶是一种多功能酶。目前,医院 应用胆固醇氧化酶检测血清胆固醇含量。 胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含 量；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是 一种生物杀虫剂；胆固醇的氧化产物胆甾4-烯-3-酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效。
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1
亲和层析
➢ 亲和层析（affinity chromatography）是 利用待分离物质和它的特异性配体间具有 特异的亲和力，从而达到分离目的的一类 特殊层析技术。
➢ 亲和层析法具有多方面的应用。
精选ppt
2
核酸的纯化
➢ 因为DNA与RNA之间具有专一性的亲和力， 所以亲和层析可应用于核酸的研究，例如 从大肠杆菌的RNA混合物中分离出专一于 噬菌体T4 的RNA，可将T4的DNA以共价键 结方式接于cellulose材质的管柱中，再将 所要的RNA分离出。
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亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 发酵产物经过盐析操作以后，得到层析用 样品。
➢ 他们利用一种脂溶性凝胶SepherdexLH20 作为胆固醇的载体,其分离的分子量小于 3000。胆固醇也为脂溶性的化合物,与凝胶 LH20有很好的相容性,而酶蛋白不能进入凝 胶。
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亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 他们每次进行实验时加入1~5ml的样品,用 1~5倍体积的缓冲液A洗去杂物,流速为 0.5~2ml/min；然后再用缓冲液B洗脱酶蛋 白,流速为015~2ml/min。
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亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 他们对表面活性剂的浓度和洗脱速度的条 件进行了考察，得到用亲和层析分离纯化 胆固醇氧化酶,酶比活从0.45U/mg提高到 15.5U/mg。亲和层析的适合条件为洗脱液 A的流速是015ml/min,洗脱液B的流速是 210ml/min。
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抗体与抗原的纯化
➢ 抗体与抗原结合具有高度专一性， Sepharose是这一类亲和层析较佳的载体， 由于抗原-抗体复合物的解离常数很低， 因此抗原在固定化抗体上被吸附后，要尽 快将它洗出，冲洗液的条件通常是控制 pH值至3以下，成份为醋酸、盐酸、TrisHCl缓冲液、20% 甲酸或1mol/L 丙酸， 也有使用尿素这一类的蛋白质变性剂作为 洗出用的溶液。
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酶和酶的抑制剂纯化
➢ 使用亲和层析法纯化酶，可以得到相当好 的效果。例如，要分离猪和牛的胰蛋白酶， 可以连接鸡卵黏蛋白（胰蛋白酶的抑制剂） 与Sepharose 4B当作层析柱材质，用它纯 化出来的胰蛋白酶相当于5次再结晶的纯度。
➢ 除了使用抑制剂当配体，也可以反过来用 酶作为配体来纯化抑制剂，例如，将胰蛋 白酶接到Sepharose上，能有效分离纯化 大肠杆菌中的胰蛋白抑制剂Ecotin。
➢ 此外，根据核酸与蛋白质之间交互作用的 原理，可以将单股DNA接在Sepharose上， 纯化DNA聚合酶或RNA聚合酶。
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激素受体的纯化
➢ 激素受体是细胞膜上与特定激素结合的成 份，激素和受体的作用具有特异性，目前 用亲和层析法已经能够将激素与sephrose 的组合，纯化胰岛素、正甲状腺素的受体。
➢ 实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶, 但是从实际操作和经济角度考虑，该法不 适合大规模处理。
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谢谢大家！
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亲和层析的应用
Chitin
几丁质
Trypsin
胰岛素
CHOM
鸡蛋粘多糖蛋白
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亲和层析法分离胆固醇氧化酶
➢ 季文明,陈毅力等 ➢ 江南大学生物工程学院
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8亲和层析法分离胆固醇氧源自酶➢ 胆固醇氧化酶是一种多功能酶。目前,医院 应用胆固醇氧化酶检测血清胆固醇含量。 胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含 量；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是 一种生物杀虫剂；胆固醇的氧化产物胆甾4-烯-3-酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效。