ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
生物素、亲和素标记技术
适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA
三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
1 概念： 亲和素(avidin)：是动物微生物中提 取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。 链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养 液中提取的一种蛋白质 2 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD
3 结构特点： 每分子由四个亚基组成
4 溶解特性：溶于水，C=5mg/ml 5 等电点： A: PH=10.5 SA: PH= 6.0 6 比活性： A≥12u/mgP SA ≥14u/mgP
四、亲和素的活性及其测定 1 亲和素的活性：是表示亲和素结合生物 素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。
2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
(在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸 ）
标记特点: (同BNHS) BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的 适用：(同BNHS) 标记Ab、酶、中性或偏碱 性的Ag、DNA
3 生物素酰肼(BHZ)：
制备：生物素 +水合肼 标记特点： BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布 的一种小分子生长因子，又名辅酶R或 维生素H。 2 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触， 将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
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17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
07 生物素-亲和素
特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子 可结合4个生物素分子。 亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应， 但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于 多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响， 故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
Ag+B· Ab Ag-Ab· B
亲合素(A)
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
底物
酶标生物素
生物素化的抗体
+A
+A
BA法（标记亲和素-生物素法）
亲和素和生物素系统
链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60000，且不含糖链。 此方法与ABC 法相比，不需A、B 两液提前混合，操作者容易掌握，稳定性高，由于采用了低等电点的链霉亲和素，其内源性生物素 干扰要低于ABC 法。 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可结合多个HRP
链霉亲和素结合位点，可以和各种生物素标记抗体结合。
生物素（biotin ），也称维生素H，是一种分子质量为244Da 的小分子维生素。
避免了组织中的非特异性染色。 标记链霉亲和素-生物素法（Labelled streptavidin biotin ，LSAB）
同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 亲和细胞化学不同于免疫细胞化学，亲和细胞化学是利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一种碱性糖蛋白。亲和素具有 与其他示综物质，如，荧光素、酶、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
蛋白质浓度测定的方法及原理
蛋白质浓度是指在给定体积的溶液中所含有的蛋白质的量。
常用的蛋白质浓度测定方法包括比色法、生物素-亲和法和BCA法等。
1.比色法:
●原理：利用蛋白质与某种化学试剂发生反应后产生颜色，并通过测量溶液的吸光度
来推算蛋白质浓度。
常用的试剂有布拉德福德试剂、劳氏试剂和二酰肼试剂等。
●步骤：将待测样品与试剂混合后，在特定波长下测量吸光度，然后通过标准曲线或
计算公式来确定蛋白质浓度。
2.生物素-亲和法:
●原理：利用生物素-亲和素相互作用原理，通过检测生物素与亲和素的结合程度来
测定蛋白质浓度。
生物素可以与亲和素（如珠蛋白素）非常稳定地结合，并且该结
合可以被检测方法所测量。
●步骤：将待测样品中的蛋白质与生物素标记的亲和素结合，经过洗涤去除未结合物
质后，使用特定方法（如酶联免疫吸附法）测量结合的生物素含量，并通过标准曲
线或计算公式来确定蛋白质浓度。
3.BCA法（双硫键还原法）:
●原理：利用蛋白质中的还原性氨基酸（如半胱氨酸）与BCA试剂发生反应，在碱
性条件下生成紫色络合物，可以通过测量溶液的吸光度来推算蛋白质浓度。
●步骤：将待测样品与BCA试剂混合后，在适当温度下反应一段时间，然后通过测
量吸光度来确定蛋白质浓度，一般使用分光光度计进行测量。
这些方法都有其优缺点和适用范围，在选择蛋白质浓度测定方法时应根据实验目的和条件综合考虑。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
abc elisa原理
abc elisa原理ABC ELISA原理ABC ELISA（Avidin-Biotin Complex Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
该方法利用亲合性较高的生物素与亲合性较高的亲和素（例如抗体）结合，形成稳定的复合物，从而实现对目标分子的检测。
ABC ELISA的原理是基于酶标记的间接免疫法。
在实验中，首先将待测样品加入到酶标板孔中，使目标抗原或抗体与酶标抗体结合。
然后，通过一系列洗涤步骤去除未结合的物质，以减少背景信号的干扰。
接下来，加入生物素标记的二抗（biotinylated secondary antibody）。
生物素与亲和素（例如亲和素化酶标抗体）结合，形成稳定的复合物。
这样，目标分子就被生物素标记，便于后续的检测。
随后，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（例如辣根过氧化物酶标记的亲和素化酶标抗体）。
辣根过氧化物酶（HRP）能够与生物素结合，在酶标抗体的作用下，HRP会与基质反应产生显色产物。
加入底物溶液，通过底物与HRP的反应，产生可见的颜色变化。
根据颜色的强度可以判断样品中目标抗原或抗体的含量或活性。
ABC ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较低的背景信号，被广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
它可以用于检测血清中的抗体水平、病毒或细菌感染的诊断以及药物研发等。
然而，ABC ELISA方法也存在一些限制。
首先，该方法需要多个步骤和试剂，操作较为繁琐，需要一定的实验技术。
其次，由于标记物的加入，可能会影响目标分子的结构和活性，造成检测结果的偏差。
此外，该方法对样品的处理和存储条件要求较高，以避免样品中其他物质的干扰。
ABC ELISA是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，通过亲合素的结合和酶标记的作用，实现对特定抗原或抗体的检测。
该方法具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
生物素-亲和素系统elisa法
生物素-亲和素系统ELISA法是一种基于生物素和亲和素之间高度特异性和高亲和力的免疫检测方法。
这种方法利用生物素和亲和素之间的结合反应，将抗原或抗体与生物素结合，再通过亲和素与生物素之间的结合反应，将抗原或抗体固定在固相载体上。
在ELISA中，生物素-亲和素系统可以用于提高检测的灵敏度和特异性。
首先，亲和素与生物素之间的结合反应非常稳定，可以减少非特异性结合，提高检测的特异性。
其次，每个亲和素可以结合4个生物素，使得反应信号放大，提高检测的灵敏度。
生物素-亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，包括用于固相化抗体或抗原的制备、用于ELISA终反应的放大等。
在固相化抗体或抗原的制备中，先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。
在ELISA终反应的放大中，用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。
总之，生物素-亲和素系统ELISA法是一种灵敏度高、特异性好的免疫检测方法，可以用于各种抗原或抗体的检测。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡
2.上样
3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。 2.生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，再和生物素 衍生物结合，将信号多级放大，能保持大分子物质的原有生 物活性。 3.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度 专一性，不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂浓度高低 受影响。 4.酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响亲和素与生物素的结 合力。裴仁军等试验结果表明，链霉亲和素与生物素能够在 结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。 5.BAS不仅能与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合， 还可制成亲和介质，用于分离提纯。 6.BAS操作方便，反应结果可用肉眼观察，实验成本低。
亲和素与生物素系统的基本原理
亲和素与生物素系统的基本原理1979年，Guesdon及其同事首先将生物素—亲和素应用于免疫组化技术中，并成功地建立了标记亲和素—生物素技术(LAB)和桥亲和素—生物素技术(BAB)。
1981年，Hsu在LAB法和BAB法的基础上，先后建立了生物素—亲和素间接法及ABC法。
近年来，由于双重免疫组化标记技术的发展，除ABC-HRP试剂外，还制成了ABC-AKP和ABC-GOD试剂，进而发展了ABC-AKP等技术。
同时人们又对ABC法进行改进，相继出现了快速ABC法、二步ABC法、PAP和ABC连用等技术。
随着链霉亲和素(streptavidin)的应用又出现了LSAB、S-P、SABC等方法。
1．标记亲和素—生物素法(1abeledavidinbiotin，LAB)将亲和素与标记酶(HRP)结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体(一抗或二抗)结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。
细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
2．桥接亲和素—生物素法(bridgedavidinbiotin，BAB)先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”物素连接，也可达到多层放大效果。
将生物素化抗体与酶标记生3．亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC)此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合，形成亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC复合物)。
抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物(此ABC复合物不能饱和，即亲和素上的4个结合位点最多允许3个位点与生物素化酶结合，留1～2个位点与生物素化二抗结合)结合，最终形成巨大复合体。
因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
细胞贴片免疫组化染色步骤
葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A，SPA）
一、特性：
1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定 ； 2、 能与某些哺乳动物IgG的Fc段特异性结合； 3、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物 。
二、应用
SPA主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物
种属限制。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹 配的溶液中不应含有叠氮钠； ⑨ 检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性 树胶，荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。
（二）信号弱
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了上述因素外，还有： 1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高； 2. 抗原修复方式不当 ； 3. 抗原位于细胞内，未使用穿孔剂 如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗 体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc受体； 4. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确 ；
（三）着色部位改变
1. 间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非 特异性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙； 抗体不纯或被污染；
2. 细胞浆着色 ：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白；
3. 细胞核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、 缓冲液中浸泡时间过长、组织变干、修复液pH值和修复时间不当、组织没有 浸没在修复液中等。
2.封闭液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清 ；
3.所选择的抗体是否符合试验要求 ，主要是抗体纯度； 4.一抗的使用浓度是否过高 ； 5.清洗是否充分 ，DBA的使用是否正确 ，边缘效应； 6.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 ； 7.组织抗原弥散等。
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
临床医学检验：免疫标记技术学习资料(强化练习)
临床医学检验：免疫标记技术学习资料（强化练习）1、填空题经典的三大标记技术是指______________、_______________和_________________。
正确答案：荧光抗体技术；酶免疫技术；放射免疫（江南博哥）技术2、填空题目前RIA常用的分离方法有_____________、____________、_______________、________________。
正确答案：第二抗体沉淀法；PEG沉淀法；PR试剂法；活性炭吸附法3、单选用免疫荧光技术间接法检测组织中的抗体，应将荧光素标记() A．抗原B．相应抗体C．抗免疫球蛋白抗体D．抗原-抗体复合物E．抗C3抗体正确答案：A4、单选与双抗体夹心法相比，ELISA间接法的主要优点是()A．有较大的放大作用B．减少了操作步骤C．减少了冲洗次数D．可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体E．缩短反应时间正确答案：D5、名词解释PCR-ELISA正确答案：用ELISA方法来定量检测免疫-PCR扩增产物称为PCR-ELISA。
6、单选使用荧光显微镜检测时应注意的是()A．使用前应预热15minB．标本可以长时间照射C．应用发荧光的镜油封片D．调整激发光源波长与荧光物质发射波长一致E．染色后标本应放置一段时间再镜检正确答案：A7、单选为避免放射免疫分析所使用的计数器受到外来放射性物质的污染而影响所分析的结果，所以每日应执行下列哪项工作()A．检测计数器的背景值B．检测器的保养擦拭C．校正计数器计数效率D．对计数器执行擦拭实验E．对作业环境进行辐射侦测正确答案：A8、多选用125I标记抗原，直接标记法最常用于以下哪些物质的碘化标记() A．肽类B．蛋白质C．酶D．环核苷酸E．甾体类化合物正确答案：A, B, C9、多选免疫放射发析与放射免疫分析的不同是()A．IRMA的反应速度更快B．采用固相分离法C．反应属于非竞争性结合，使IRMA灵敏度更高D．可以测定大分子和小分子抗原E．抗体用量大，但对K值要求不高正确答案：A, B, C, D, E10、多选用活化生物素标记核酸的方法有()A．放射免疫法B．缺口移位法C．光化学法D．化学偶联法E．末端标记法正确答案：B, C, D, E11、名词解释免疫放射分析(IRMA)正确答案：是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争方法。
生物素-亲和素放大技术
生物素-亲和素放大技术生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性。
生物素的理化性质与标记亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记生物素-亲和素系统的特点生物素-亲和素系统的应用生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，使之容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
包括能标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸的活化生物素。
常用于标记核酸分子的活化生物素有以下几种：1.光敏生物素它是一种化学合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ 二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
而且一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，从而使其具有较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多价。
生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质基础。
生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记注意事项1.选择正确的活化生物素和反应条件；2.应有适当的比例，以免影响被标志物的活性；3.可在生物素与被标志物间加入交联臂样结构；4.不影响被标记物的免疫活性。
亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物亲和素的天然特异性结合物。
而且，二者均为大分子蛋白，几乎所有用于标记的物质均可以与之结合。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
直接法：
+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法 间接法
（3）标记生物素-抗生物素法
标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
wb abc法
**WB ABC法（Western Blot with Avidin-Biotin Complex）是一种利用亲和素-生物素复合物（ABC）系统来增强免疫检测信号的方法**。
Western Blot（WB）是一种常用的蛋白质分析技术，它可以将蛋白质样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，并转移到杂交膜上，之后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测。
WB实验的详细流程包括样品裂解、样品制备、上样和电泳、将蛋白质从凝胶转移到膜上以及抗体染色等步骤。
在WB中，ABC法是一种信号放大策略，它利用了亲和素（Avidin）和生物素（Biotin）之间的高亲和力相互作用。
这种方法通常涉及使用生物素标记的二抗来识别一抗结合的靶蛋白，然后加入亲和素-酶复合物（如HRP标记的亲和素），由于亲和素有多个生物素结合位点，可以进一步结合多个生物素标记的二抗，从而放大检测信号。
ABC-ELISA材料和方法
ABC-ELISA材料和方法BAS酶联免疫吸附试验材料和方法(以筛选抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体为例)1 材料(1) 空肠弯曲菌共同抗原提取物，自制。
(2) 生物素化羊抗鼠IgG(AMG)，卫生部上海生物制品所。
(3) ABC试剂，卫生部上海生物制品所。
如ABC试剂需自己配制，可按说明要求，将亲和素与酶标生物素按一定比例混合，置37℃孵育30min后使用。
(4) 被检杂交瘤培养物上清液。
(5) 其他试剂及器材同常规ELISA法。
2 方法ABCELISA间接法程序(1) 用包被液对空肠弯曲菌共同抗原提取物作适当稀释(1∶16)，加入反应孔中，每孔01ml，置4℃包被过夜或37℃1～2h。
(2) 用洗涤液洗涤2次，每次1min，沥干。
(3) 加入杂交瘤培养物上清液，每孔01ml。
同时作BALB/C小鼠免疫血清(阳性)及正常血清和培养液(阴性)对照，置37℃1～2h。
(4) 洗涤3次，方法同上。
(5) 用保温液对生物素化羊抗鼠IgG作适当稀释(1∶400～1∶1000)，加入反应孔中，每孔01ml。
置37℃孵育1h。
(6) 洗涤3次，方法同上。
(7) 用ABC稀释液或保温液对ABC试剂作适当稀释(1∶100)，加入反应孔中，每孔01 ml。
置37℃孵育30min。
(8) 洗涤3次，方法同上。
(9) 加入邻苯二胺底物溶液，每孔01ml，置暗盒内室温显色适当时间(30min)。
(10) 加入2mol/L H2SO4，每孔005ml，终止反应。
用酶联检测仪检测结果，并记录其OD值。
3 结果判定以P/N≥2为阳性，或根据自定标准判定。
4 注意事项1 ABCELISA中各要素的最佳反应条件需经筛选后确定，不能照搬常规ELISA的反应条件。
2 ABCELISA对抗原和抗体(或免疫血清)的质量要求高，否则可造成较高的本底或背景显色。
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ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法是许世明于1981年在BAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
ABC法与LAB法、BAB法不同的是第一抗体不为生物素所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。
复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素—过氧化物酶连接物与过量的亲和素反应而制备的。
ABC法与LAB法、BAB法相比较具有敏感性高、特异性强、背景染色淡等优点。
ABC法染色流程如下。
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3min。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)，PBS洗3X3min。
(3)3％过氧化氢孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(4)PBS洗3X3min。
(5)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
(6)滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60min或4℃过夜。
(7)PBS洗3X3min。
(8)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60min。
(9)PBS洗3X3min。
(10)滴加ABC复合物(提前30min，A液与B液等量混合)，37℃孵育30～60min。
(11)PBS洗3X3min。
(12)0．04％DAB(含0．03％H：02)显色5～10min。
(13)复染，脱水，常规树胶封固和结果观察。