灭菌、无菌操作技术

成绩：日期：2015年12月18日南京林业大学实验报告

专业学号姓名

实验二、灭菌、无菌操作技术

一．实验目的：

1、了解并掌握植物材料的准备、消毒。

2、培养基配制及器皿高温灭菌。

3、无菌操作及接种的原理和技术。

二、实验原理

植物组织培养必须在无菌环境中进行，因此外植体、器皿及作为外植体生长介质的培养基的灭菌操作非常重要，一旦污染，就会造成组织培养的失败。野外植物材料都有各种菌类，进行离体培养前需经过表面消毒灭菌；培养基封装封口后应立即灭菌，至少应在24小时内完成灭菌程序。

三、材料与仪器

1、材料：喜树带芽茎段

2、仪器设备：高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室镊子、记号笔、橡皮筋、玻璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。

四、实验步骤

1）培养基的消毒将分装好的培养基放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右，灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

2）高压蒸汽灭菌锅的使用方法

（1）高压锅放水至平把架；（2）把包扎好的培养基装入高压锅；（3）盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；（4）然后接通电源；（5）压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)；（6）排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟；（7）灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出；（8）经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。

3）植物材料表面

清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗→→自来水冲洗

4）喜树外植体的接种

1、准备打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照20min 后关闭紫外灯，同时将豌豆种子用自来水冲20min关闭紫外灯后在台上点燃 2 个酒精灯，用棉球将镊子烧4次，超净作台少2次。将喜树、大烧杯等放入超净工作台。

2、接种将所要用的三角瓶用75％的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入超净工作台。接着将灭菌处理好的喜树在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入向下倾斜的锥形瓶杯中，直到接种完毕盖上棉塞，贴上标签，放入培养室。

3、完毕后清理干净工作台，紫外光灭菌30min.

5）观察

五、结果

经过一系列的实验操作后成功将所有的试管接种了外植体并将其封口，做好标记最后放入了无菌培养室中。经过一段时间的培养后再次观察发现有被污染的也有没被污染的。

六、注意事项

1.在灭菌之前一定要检查锅中的水位，严禁干烧，以免造成事故。

2.灭菌前还需检查排气阀是否关上。

3.只有当锅中压力为零时才能打开锅盖否则会有危险。

4.锅内应留有空隙，不能太满。

5.灭菌时间不宜过长，也不可以超过灭菌锅规定的压力范围。

6.严格按照规范进行操作。

七、思考与反思

1.整个实验都必须在无菌的环境下进行，所以我们在进行接种前需要将自己的双手用酒精消毒确保无菌污染。

2．在接种时试管和双手都要靠近酒精灯的火焰旁，这是确保实验成功的一个条件。

3.在将外植体放入试管中时要确保其形态学上端朝上。