原核表达详细步骤

原核表达详细步骤

PartⅠ选择表达的目的基因

一、基因序列

1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:

①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA

的ORF中找到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：

①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA

②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测

1、原理：

蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则：

（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：

（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。在线网站预测

（ and ）

（2）选定：接近N、C端；选取在此区间内，（Antigenic Index）Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。

注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域

（3）NCBI（BlastP）比对：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！！！（4）抗原合成：

①原核表达：

②化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。多肽的纯度越纯越好，一般> 80%就完全可以了。合成5-10 mg就可以了。

PartⅡ选择表达系统

一、选择表达载体

1、选择表达载体的原则

（1）蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是否加标签或以融合蛋白的形式表达。

（2）蛋白需求量：根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。

（3）蛋白质是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的不溶的蛋白（包涵体蛋白）

2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：

（1）选择标志的编码序列：用于筛选重组子，有抗生素抗性基因、报告基因（GFP等）

（2）可控转录的启动子：

启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。

原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A 和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。

（3）转录终止子：

在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA 的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA 聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T

的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。

（4）核糖体结合位点（SD序列）：

1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。

（5）多克隆位点（MCS）：选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密码子。

（6）复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子（复制起始部位）的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性