《实用内科学》限制性核酸内切酶

《实用内科学》限制性核酸内切酶

1953年Watson 和Crick 发现了DNA 双螺旋结构，并揭示了DNA 自我复制的机制，为分子生物学树立了里程碑，使人们开始用分子生物学的语言来解释人类的遗传现象。1961年Mar mur 和Doty 发现了DNA 分子的复性规律并建立了核酸分子杂交技术；1966年Nirenberg，Crick 和Ochoa 等破译了人类的遗传密码，并提出了遗传信息的中心法则；1968年Arber 等发现了DNA 限制性内切酶；1972年Boyer，Cohen 和Berg 成功地建立了DNA 无性繁殖技术；1975年Sanger 和Gilbert 建立了DNA 分子中核苷酸顺序分析法。在上述基础理论和基本技术的基础上建立的重组DNA‐基因工程技术，已成为分子生物学的核心技术，并已渗透到生命科学的各个领域，在医学领域尤为突出，不仅研制了多种多样的疫苗、药物和诊断试剂用于防病治病，而且揭示了许多疾病的发病机制都与特定基因的结构和功能、基因表达及其调控有关。而今，RNA 干涉和表观遗传学的发现，使现代分子生物学深刻地促进着医学的发展。

重组DNA 技术

重组DNA 技术（recombinant DNA technology）主要包括：限制性核酸内切酶等工具酶的应用、基因的无性繁殖、核酸分子杂交和DNA 分子的核苷酸序列分析。

限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶多数从大肠杆菌中制备，能识别DNA 分子内部特异的对称顺序［通常为4～8个碱基对（base pair，bp；千碱基对kbp，简写kb）］，对称部位的一条链旋转180°，则两条链顺序完全相同。限制性核酸内切酶水解切断每条链的一个3′，5′‐磷酸二酯键，形成5′‐PO4末端和3′‐OH 末端。有的限制性核酸内切酶在不同的平面上切割DNA 的两条单链，其切割点在旋转对称轴上，切割后两条单链末端不在同一平面上，使每条链上都留下一段（约2～6个核苷酸）伸出来的单链，这段单链的顺序很有规律，不论哪一条，从5′→3′端读去，结构相同，因为DNA 是逆行排列碱基互补的双链，所以这两段单链的碱基彼此互补，可再次形成氢键，使DNA 重新环化。这种限制性核酸内切酶切下的末端称为黏性末端。有的限制性核酸内切酶在同一平面上切割DNA 的双链，切割后，两条单链的末端在同一平面上，称钝性末端（或平头末端）（表2‐1‐1）。钝性末端不能自行环化。无论黏性末端或钝性末端均必须在连接酶催化下才能在两个末端之间再次形成磷酸二酯键，使DNA 片段真正稳定地连接起来（图2‐1‐1）。

表2‐1‐1 限制性核酸内切酶切点及切割后末端结构

图2‐1‐1 重组DNA 分子的形成

质粒DNA 经限制性核酸内切酶切割，形成含有黏性末端的线性DNA，具有同样黏性末端的DNA 片段通过碱基互补，形成环状DNA，在DNA 连接酶催化下产生很稳定的重组DNA 分子

至今已分离到的限制性核酸内切酶有数百种以上，常用的有数十种。各种内切酶都有最适的作用条件。

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