体内药物分析总结 药物分析专业专用

首过效应：药物经肠道吸收首次进入肝脏时，有些药物可被肠液或肠道上的肠菌酶破坏，或在肝内受到微粒体混合功能氧化酶代谢，使进入体循环的药量减少。

肠肝循环：药物经胃肠吸收，经胆汁分泌进入小肠或药物经吸收后在肝转化为代谢物，经胆汁分泌排入小肠，在小肠处重吸收的过程。特征为“双吸收峰”。

平衡透析法：将含药物的血浆与透析液放置于半透膜两侧，在一定温度下搅拌使其平衡。半透膜能阻挡血浆蛋白和结合药物的血浆蛋白，而游离药物自由通过半透膜并达平衡。优点：平衡状态下，结果真实可靠缺点：受稀释作用影响，费时

超滤法：利用离心力迫使药物通过半透膜，同时血浆中水分也不断被滤除，使样品管内血浆样品不断浓缩，打破了药物与血浆蛋白结合的动态平衡。优点：设备简单，时间短，收集到足够的超滤液可直接进样缺点：非平衡状态下测定。

液液萃取法：基于被测组分在不混溶的两种溶剂中的分配系数不同而得到分离。

固相萃取：SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。

萃取方法选择：1较亲脂药物最好用烷基硅胶键合相省时，碱性药物用大孔树脂为佳。 2较亲水且具有酸碱性，可电离，采用离子交换树脂；3较亲水但不能解离，不易萃取，沉淀蛋白后直接进样

柱切换技术：指由阀来改变流动相走向与流动相系统,从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。

衍生化技术：在色谱过程中用特殊的化学试剂，借助化学反应给样品化合物接上某个特殊基因，使其转变为相应衍生物之后进行检测的方法。目的：1使极性药物变成非极性易挥发药物，使其具有能被分离的性质。2增加药物的稳定性。3提高对光学异构体的分离能力。

顶空气相色谱法：在封闭恒温系统中气相和凝聚相（液相或固相）存在着分配平衡，因此气相的组成能反应凝聚相的组成，用GC法来分析平衡体系中气体的方法。分为静态顶空气相色谱法和动态顶空气相色谱法。

微透析技术：实质是一种膜分离技术，利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的采样和色谱样品制备技术。

电渗流：在pH>3时，毛细管壁上的硅羟基负离子使毛细管壁内表面带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成双电层。在高电压作用下，双电层中水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动，该现象叫电渗流。具平面流型。

毛细管电泳免疫分析法(CEIA)：利用抗原抗体复合物与游离的抗原抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为分离分析的手段，分为竞争性CEIA和非竞争性CEIA。

P450酶的生物学特性：1.P450酶是一个多功能的酶系.2.P450酶对底物的结构特异性3.P450酶存在有明显的种属、性别和年龄的差异.4.P450酶具有多型性和多态性.5.P450酶具有可诱导和可抑制性.

肝微粒体体外温孵法：用制备的肝微粒体辅以氧化还原辅酶（NADPH再生系统），在模拟生理条件下进行代谢反应，经一段反应时间后，采用HPLC、LC-MS和LC-MS/MS等方法对待测物进行初步分析和鉴定。

一、选择哪一种离子源？

1.电喷雾离子化（ESI）原理：通过电场使雾滴带电，然后通过离子蒸发等机制生成气相离子，再送入MS的过程。将离子由液相转至气相为强吸热过程，能量大于C-C键断裂能。但ESI可在相对低温下，逐步去溶剂化，是最软的质谱离子化方式。三个步骤：静电喷雾；去溶剂；离子蒸发。

2.大气压化学离子化（APCI原理：大气压条件下采用电晕放电使流动相离子化，然后流动相作为气相试剂使样品离子化的技术。离子化可通过质子化或电荷转移，去质子, 电子捕获及形成加合物等方式实现。

3.大气压光离子化（APPI）

ESI：通过喷口与毛细管间高压离子化，适于中、强极性化合物，特别是在溶液中能预先形成离子化合物和可以获得多个质子的大分子，对流动相组成有要求。

APCI：通过电晕针放电离子化，流动相作为化学离子化反应气，适于非极性、中等极性小分子。不适于热不稳定、难于气化的极性和大分子化合物。离子化过程对流动相组成依赖小。

APPI: 通过吸收光子而离子化，适用于有共轭基团的非极性或弱极性物质。介质效应小，对磷酸盐有很好的耐受，较ESI有较小的离子抑制。

二、待测物什么情况下需要采用衍生化, 如何选择合适的衍生化试剂？

优点：1增强离子化效率；2改变分子碎裂类型；3改善分离效果；4优化色谱行为。

1. 小分子非极性化合物：小分子醛、酮类化合物. 对于这类化合物较难质子化。使用最多的衍生化试剂是硝基苯肼类化合物，通过引入易质子化的含氮基团和能促进雾化的疏水芳香基团来提高离子化效率。

2.小分子极性化合物：极性基团虽够有效促进待测物解离, 但是疏水结构特征对于一个待测物在离子源中的有效雾化也极其重要，并且可以使待测物在常用的反相色谱柱上得到适当保留，因此,往往需要通过衍生化的方法引入一些疏水基团以提高待测成分的离子化效率并且增加色谱保留。

a.氨基酸类:同时具有易质子化的基团(氨基)和易去质子化的基团(羧基), 在离子化过程中易发生反荷离子效应进而导致该类化合物的质谱响应极弱, 甚至没有质谱响应。

对策：通过简单的衍生化反应掩蔽羧基或氨基

b.羧酸类：一些结构较小并且极性较大的羧酸，质谱响应和色谱保留行为均不理想。

对策：使用衍生化掩蔽羧基同时引入一些离子化能力较强的基团.

c.嘌呤嘧啶拮抗物：极性很强, 且缺乏合适的离子化官能团。

常用衍生化试剂：丹酰氯重氮甲烷对溴苯甲酰甲基溴（具体例子见笔记）

3.痕量待测物：如激素类药物的检测, 衍生化也可以作为一种提高灵敏度的重要手段。

4. 蛋白质以及多肽：

5. 不稳定化合物：如易氧化化合物

五、如何正确地认识并且科学地评价残留效应？

残留效应(carry-over effect，COE) ：指在高浓度的样品进样分析后, 在进样系统中残留了一定量的待测物, 从而影响了下一次进样时低浓度样品测定结果的准确度。

产生原因：清洗自动进样针的溶剂选择不当、洗针和进样程序设计不合理或者是进样针座吸附了待测物. 对策：1.采用甲醇-水(50:50)组成的洗针液能有效清除进样针上的残留待测物。但对疏水性极强的化合物, 采用更高比例的甲醇能更有效地消除残留效应。2. 在自动进样器中产生残留的主要部位是进样阀,通过改变进样模式消除。评价方法：观察连续分析高浓度样品后空白溶剂或空白样品的待测物位处有无信号。若无响应信号，则判为无残留效应。若有信号且大于10%LLOQ的响应，则判断为有残留效应干扰，需改进方法；若小于10%LLOQ的响应，则判断为残留效应可忽略。

六、如何正确处理高通量分析和专属性之间的关系？

高通量LC-MS 分析有时会导致假阳性结果, 进而降低测定结果的可靠性。

原因1：二相代谢物容易在离子源内发生中性丢失反应形成与母体药物相同的离子, 从而影响对后者的准确定量。对策：调节色谱保留使其在LC中分开后再进入MS。

原因2：质谱的专属性有时还受到其自身分辨力的限制, 尤其单个离子或是伪离子对检测时。对策：在选择检测离子/离子对时, 不仅要考虑检测对象在质谱中的绝对响应, 还应注意选择受生物基质干扰较少的监测离子或离子对,如一些小分子的中性丢失反应(如脱水反应)就不适合作为监测对象

二、何为LC-MS的介质效应？建立生物样品中药物的LC-MS测定方法时如何进行介质效应的考察？其评判标准是什么？

介质效应（ME）是指样品基质中其他成分对待测物响应值的影响。

对策：a优化改进样品提取制备方法；b优化色谱条件；调节色谱保留；改善峰形；梯度洗脱；加入添加剂c减少进样体积；d根据被测药物离子化机理选择合适的质谱接口，并优化质谱分析条件；抗基质干扰能力依次为: APPI＞APCI＞ESI；e选择合适的内标

考察：标准曲线法：本法需配制2组不同的标准曲线，每组包括5条标准曲线。第1组用流动相配制，制成含系列浓度待测组分的标准曲线。第2组标准曲线是将5种不同来源的空白生物样品(如：血浆)经提取后分别加入与第1组相同系列浓度的待测组分后制得。通过比较两组标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。分别求得第1组和第2组标准曲线斜率的平均值：S1和S2。

ME＝│S1－S2│/S1×100％若ME≤15％，则表示无介质效应或介质效应可以忽略。

ME＝S2/ S1×100%，若85%≤ME≤115％，则表示无介质效应或可以忽略。

⑴特异性：考察来自6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质或其他代谢物及替他药物不得干扰对样品的测定。

⑵标准曲线和定量范围：配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，至少用6 个浓度建立标准曲线。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。标