海带多糖的提取及鉴定

海带多糖的提取及鉴定

1、实验目的及原理

海带是褐藻门植物，海带多糖是海带药用价值的最集中体现，海带多糖的种类很多。本实验的主要目的是掌握海带多糖的提取及测定方法。对海带多糖的提取方法有很多，碱提取法是其中重要的一种。多糖中的己糖能与苯酚硫酸试剂发生显色反应，颜色的深浅与己糖含量成正比。颜色的深浅可通过分光光度计测定，因此，可建立不同浓度的标准己糖与吸光度间的呈线性关系，绘制标准曲线，测定样品的吸光度值，再从表中曲线中查到样品中多糖的含量。

2、实验基本内容和要求

（1）掌握碱提取法提取海带多糖

（2）掌握利用绘制标准曲线方法测定多糖含量

3、实验所用仪器设备和试剂

（1）基本仪器：分光光度计，离心机

（2）实验材料及试剂：干海带1 %碳酸钠溶液：称取15 g无水碳酸钠加入1500 mL蒸馏水，95%乙醇溶液，氯化钙溶液(2g/100mL)

4、实验步骤

4.1 海带多糖的提取

（1）购买海带后，用自来水将其洗净，晒干，研磨，过60目-80目的筛，收集备用。称取制备好的2 g海带粉，置于烧杯中，加入28 mL 刚配好的碳酸钠溶液。

（2）在50℃水浴中水浴，趁热用棉纶网进行吊滤，并不断用热水冲

洗保持温度，获得的吊滤液于5000 r/min 离心15 min，保留上清液。上清液经减压浓缩（40℃）后，加入三倍体积95%乙醇，沉淀过夜。离心后获得海带粗多糖。

二．鉴定

Molisch反应（α-萘酚反应）此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。它的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与α-萘酚作用，形成红紫色复合物。由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。α-萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比较稳定，其灵敏度与α-萘酚一样。除了糖类之外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。

三，硫酸-蒽酮法测定海带多糖含量

1.配制硫酸-蒽酮试剂:取2 g蒽酮溶解于1000 mL浓H2SO4中，当日配制使用。

2.绘制葡萄糖标准曲线:准确量取100g/mL葡萄糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL，注入糖管中，补充纯水至1.00 mL （下表）。并分别加入4.00 mL硫酸-蒽酮试剂，盖塞后立即摇匀，迅速浸入冷水浴中，各管加完后一起置于沸水浴中10 min，，封口防蒸发，取出流水冷却，室温放置10分钟，于620 nm处比色，测定吸光度值。以测得的吸光度为纵坐标，标准葡萄糖含量为横坐标，作出标准曲线。

3．海带多糖含量测定:将海带粗多糖以适量水溶解（约为10-80

μg/mL），并准确量取1.00 mL待测溶液，加入4 mL硫酸-蒽酮试剂，同标准曲线之操作，比色测定。根据标准曲线计算糖含量。

0.2mL—2mL（10倍）。

0.2 mL—2 mL（10倍）

1 mL—

2 mL（20倍）

1 mL—

2 mL（40倍）

二、实验原理

本实验综合利用细胞匀浆和纤维素酶水解，破碎海带细胞壁，释放细胞内容物，包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等；随后通过海藻酸与Ca2+的结合沉淀形成不溶性海藻酸钙，以去除其中的海藻酸；继而通过CTAB与多糖络合后溶解度下降的特性，将多糖与其他成份分离；最后在盐溶液中回溶多糖，并通过乙醇沉淀法获得多糖沉淀，即为海带粗多糖。可采用硫酸－蒽酮法测定多糖的含量。

三、实验材料及试剂

实验材料：干海带

实验试剂：纤维素酶、1 mol/L氯化钙溶液、硫酸、蒽酮、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、葡萄糖等

仪器：组织匀浆机、水浴锅、台式高速离心机，分光光度计

四、实验步骤

1．干海带加水浸泡过夜，充分溶胀后，加入1/3体积的水，放入组织匀浆机中，粉碎成海带浆。取约100 mL海带浆，调PH值为4.5-5.0，加入0.3 g纤维素酶，于50度温浴水解4-6小时，间或搅拌，促进细胞壁水解。

2..在海带浆中加入50 ml水，搅拌均匀，沸水浴5 min，使纤维素酶失活，冷至室温，用6层纱布过滤，收集滤液（注：1.这个时候一定不要混入海带渣，防止对后面测量结果的影响，2.过滤过程中可戴手套挤纱布，但是不要太用力使海带渣意外流出）。

3．向滤液中加入1/4体积1 mol/L氯化钙溶液，搅拌均匀后，4层纱布过滤，去除海藻酸钙（这个时候过滤比较简单，因为海藻酸钙是絮状沉淀，易过滤）。

4．于滤液中加入1/5体积的2%CTAB与海带多糖结合沉淀，12000 rpm 离心5 min收集CTAB-多糖沉淀物（1.要经过离心的两个管一定要配平，平行操作2.两个管相对放置3.离心参数设置4.记忆）。

5．在CTAB-多糖络合沉淀物中加入0.5 mL 2 mol/L氯化钾溶液，通过盐解作用，溶解释放海带多糖，然后加入2倍体积无水乙醇沉淀多糖，12000 rpm离心5 min。