海带多糖的提取及鉴定
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海带多糖的提取及鉴定
1、实验目的及原理
海带是褐藻门植物,海带多糖是海带药用价值的最集中体现,海带多糖的种类很多。
本实验的主要目的是掌握海带多糖的提取及测定方法。
对海带多糖的提取方法有很多,碱提取法是其中重要的一种。
多糖中的己糖能与苯酚硫酸试剂发生显色反应,颜色的深浅与己糖含量成正比。
颜色的深浅可通过分光光度计测定,因此,可建立不同浓度的标准己糖与吸光度间的呈线性关系,绘制标准曲线,测定样品的吸光度值,再从表中曲线中查到样品中多糖的含量。
2、实验基本内容和要求
(1)掌握碱提取法提取海带多糖
(2)掌握利用绘制标准曲线方法测定多糖含量
3、实验所用仪器设备和试剂
(1)基本仪器:分光光度计,离心机
(2)实验材料及试剂:干海带1 %碳酸钠溶液:称取15 g无水碳酸钠加入1500 mL蒸馏水,95%乙醇溶液,氯化钙溶液(2g/100mL)
4、实验步骤
4.1 海带多糖的提取
(1)购买海带后,用自来水将其洗净,晒干,研磨,过60目-80目的筛,收集备用。
称取制备好的2 g海带粉,置于烧杯中,加入28 mL 刚配好的碳酸钠溶液。
(2)在50℃水浴中水浴,趁热用棉纶网进行吊滤,并不断用热水冲
洗保持温度,获得的吊滤液于5000 r/min 离心15 min,保留上清液。
上清液经减压浓缩(40℃)后,加入三倍体积95%乙醇,沉淀过夜。
离心后获得海带粗多糖。
二.鉴定
Molisch反应(α-萘酚反应)此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。
它的原理是:糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与α-萘酚作用,形成红紫色复合物。
由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环,因此又称紫环反应。
α-萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替,麝香草酚溶液比较稳定,其灵敏度与α-萘酚一样。
除了糖类之外,各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。
三,硫酸-蒽酮法测定海带多糖含量
1.配制硫酸-蒽酮试剂:取2 g蒽酮溶解于1000 mL浓H2SO4中,当日配制使用。
2.绘制葡萄糖标准曲线:准确量取100g/mL葡萄糖标准溶液0,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL,注入糖管中,补充纯水至1.00 mL (下表)。
并分别加入4.00 mL硫酸-蒽酮试剂,盖塞后立即摇匀,迅速浸入冷水浴中,各管加完后一起置于沸水浴中10 min,,封口防蒸发,取出流水冷却,室温放置10分钟,于620 nm处比色,测定吸光度值。
以测得的吸光度为纵坐标,标准葡萄糖含量为横坐标,作出标准曲线。
3.海带多糖含量测定:将海带粗多糖以适量水溶解(约为10-80
μg/mL),并准确量取1.00 mL待测溶液,加入4 mL硫酸-蒽酮试剂,同标准曲线之操作,比色测定。
根据标准曲线计算糖含量。
0.2mL—2mL(10倍)。
0.2 mL—2 mL(10倍)
1 mL—
2 mL(20倍)
1 mL—
2 mL(40倍)
二、实验原理
本实验综合利用细胞匀浆和纤维素酶水解,破碎海带细胞壁,释放细胞内容物,包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等;随后通过海藻酸与Ca2+的结合沉淀形成不溶性海藻酸钙,以去除其中的海藻酸;继而通过CTAB与多糖络合后溶解度下降的特性,将多糖与其他成份分离;最后在盐溶液中回溶多糖,并通过乙醇沉淀法获得多糖沉淀,即为海带粗多糖。
可采用硫酸-蒽酮法测定多糖的含量。
三、实验材料及试剂
实验材料:干海带
实验试剂:纤维素酶、1 mol/L氯化钙溶液、硫酸、蒽酮、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、葡萄糖等
仪器:组织匀浆机、水浴锅、台式高速离心机,分光光度计
四、实验步骤
1.干海带加水浸泡过夜,充分溶胀后,加入1/3体积的水,放入组织匀浆机中,粉碎成海带浆。
取约100 mL海带浆,调PH值为4.5-5.0,加入0.3 g纤维素酶,于50度温浴水解4-6小时,间或搅拌,促进细胞壁水解。
2..在海带浆中加入50 ml水,搅拌均匀,沸水浴5 min,使纤维素酶失活,冷至室温,用6层纱布过滤,收集滤液(注:1.这个时候一定不要混入海带渣,防止对后面测量结果的影响,2.过滤过程中可戴手套挤纱布,但是不要太用力使海带渣意外流出)。
3.向滤液中加入1/4体积1 mol/L氯化钙溶液,搅拌均匀后,4层纱布过滤,去除海藻酸钙(这个时候过滤比较简单,因为海藻酸钙是絮状沉淀,易过滤)。
4.于滤液中加入1/5体积的2%CTAB与海带多糖结合沉淀,12000 rpm 离心5 min收集CTAB-多糖沉淀物(1.要经过离心的两个管一定要配平,平行操作2.两个管相对放置3.离心参数设置4.记忆)。
5.在CTAB-多糖络合沉淀物中加入0.5 mL 2 mol/L氯化钾溶液,通过盐解作用,溶解释放海带多糖,然后加入2倍体积无水乙醇沉淀多糖,12000 rpm离心5 min。