(TOC约束理论)干细胞常用实验技术

实验室内部的人胚胎干细胞protocol

人类胚胎干细胞H1和H9维持方案

一、试剂配制

饲养层细胞培养基

Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM)

DMEM (GIBCO 11960-044) 450ml

FCS GIBCO 16000-044 50ml 10%

Pen/Strep 2.5ml 50IU/ml

L-glut GIBCO 25030-081 5ml 2uM/ml

人类胚胎干细胞培养基

HESC-Media

KO-DMED GIBCO 10829-018 480ml

KOSR GIBCO 10828-028 120ml 20%

10mM NEAA GIBCO 11140-050 6ml 0.1mM

L-glut(0.2M) GIBCO 25030-081 6ml 2mM

Pen/Strep 3ml

55mM BME GIBCO 21985-023 1.1ml 0.1mM

ITS GIBCO 41400-045 6ml

4-80C避光保存。用前每50毫升加200-400ng bFGF

细胞冻存培养基

FBS-DMSO

FCS GIBCO 16000-044 9ml 90%

DMSO SIGMA D2650 1ml 10%

细胞消化液Trypsin-EDTA

0.25% Trysin-1mM EDTA GIBCO 25200-056 2ml 0.05%,0.2mM

PBS(-) 14190-144 8ml

MEF细胞有丝分裂终止液Mito C

Mitomycin C 0.2mg 0.05mg/ml

dd-H2O 15230-162 4ml

避光保存。

Mito C的终浓度为10ug/ml即40吸ul 工作液加到2ml F-DMEM中。.

0.1% Gelatin(用于培养皿的包被)

1% Gelatin 40ml 0.1%

ddH2O GIBCO 15230-162 360ml

高压消毒。

二、培养方案

一) 饲养层细胞的培养

1、主要实验材料

（1）培养液为F-DMEM。

（2）小鼠周龄为7～8w的性成熟母小鼠和周龄为8w的种公鼠。

2. 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养

（1）小鼠胚胎的准备

1)性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。

2)每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。

3)取怀孕12.5～14.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。

4)用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。

5)取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置于有PBS或无血清DMEM平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。

6)沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,充分洗涤,弃除表面红细胞。

7)用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。

8)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,用PBS 至少洗涤三次,充分弃除红细胞。

（2）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养

二) 培养方法有两种: 组织块培养法和单细胞悬液培养法。

组织块培养法：

1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块,吸置于离心管内。

2) 室温下静置5～10min, 弃上层液，留下胚胎组织碎块。

3) 向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。

4) 加入等体积的培养液终止消化。室温下静止5-10min。

5) 弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物。

6）加入5ml培养液重新悬浮鼠胚组织块,移入培养瓶内。每5个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。

7) 补加适量的培养液,使组织块悬浮液能均匀分布于培养瓶表面。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

8) 培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见组织块附着培养瓶表面, 周围生长出细胞。补充培养液或更换培养液,继续培养。每天观察。

9) 待细胞连成一片时,即可消化。消化时弃培养液,用PBS洗涤一次；加适量消化液（以能覆盖细胞层为度），在室温下作用大约30sec；弃消化液，让残余消化液继续作用。轻敲培养瓶底, 当细胞层出现裂隙时，加入培养液终止消化。或在倒置显微镜下观察，当细胞与细胞之间分开即可终止消化。

10）补加培养液，轻轻吹打均匀，吸置离心管内，静置5～10min。

11）上层为单细胞悬液,下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内,弃组织块。

12）以800～1000rpm 5min离心，弃上清。加入培养液,重新悬浮细胞沉淀。以1:3比例传代。采用3～5代细胞作为饲养细胞。

单细胞悬液培养法：

1)～5）步骤同组织块培养法1)～5) 步骤。

6)重复组织块培养法3）～4）步骤5～6次,即重复消化鼠胚组织块5～6次。每次消化后都收集上层液即单细胞悬液。最后一次消化后弃组织块。

７)将收集到的单细胞悬液离心，800～1000rpm 5min。

８)弃上清,加入培养液,轻轻吹吸,制备成均匀的单细胞悬液。

9) 移置培养瓶内。5个鼠胚制备出来的单细胞悬液可以使用3个100ml的培养瓶。

10)补加适量的培养液，吹吸均匀。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每天观察。

11)培养2～3d后,细胞连成片,即可消化。消化过程同组织块培养法９)步骤。

12)以1:2～1:3比例传代培养,2～3d传一代。采用3～5代细胞作为饲养细胞。

（3）培养结果

在培养MEF初始的1～2代时,杂细胞（非成纤维细胞的其他组织细胞）较多,细胞形态多样；在第三代开始时,杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时,由于受杂细胞的影响,形态不够典型。

三）细胞冷冻

1. 当细胞90%-100% 融合时,尤其细胞少量堆聚可冷冻。

2. 处理方法同传代培养1-8，每25 cm2 的细胞加1ml FBS-DMSO重悬细胞。

3. 每个冷冻管编号加1ml细胞悬液。

4. 置入40C1小时，放入1cm厚的泡沫盒中置入-800C过夜，置入液氮长期保存。四）灭活饲养层细胞并备饲养层皿

试剂和材料

HESC Medium、PBS(+)、PBS(-)、Mito C、Trypsin-EDTA

离心管、移液管

Mito C处理（以25 cm2培养瓶为例）

1. 需要铺皿前一天，全换液。.

2. 留2ml培养基。

3. 加40ul Mito C（10ug/ml）。

4. 培养皿底以0.1％Gelatin溶液覆盖预处理。

5. 3小时后，去培养基，处理方法同传代方法。

6. 重悬细胞，细胞计数，以、

7.0×104/ cm2（MEF）铺皿。

7. 置于培养箱常规培养。

8. 15分钟后，取出皿，吹打皿中央，重新置于培养箱中培养。