人类基因组DNA提取共45页
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人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析PPT课件
5. 56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次 6.加入200 μl无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上 的液体集中到管底。 7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分 多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。
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xiongdehui@
0731-8480 5449
23
19
第七节
结果分析
M 1 2 3 4 5
LIF E
21226 bp
M: λDNA/HindIII+EcoRI DNA Marker； 1-5: 基因组DNA 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图
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本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并 从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组 DNA。
7
第一节
实验原理
高盐，低pH值： 选择性结合 DNA
漂洗
低盐，高pH值： DNA从硅基质 膜上洗脱
离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗
14
第五节
7.向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中 的
操作步骤
废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9.10,000 rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。
人类基因组DNA提取
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限制性核酸内切酶切割 的原理与方法
概念
限制性核 酸酶酶
核酸内切酶： 能识别双链 DNA分子内 部的特异位点 并裂解磷酸二 酯键
外切酶：核酸
外切酶是一类能从 多核苷酸链的一端 开始按序催化水解 3、5-磷酸二酯键 ，降解核苷酸的酶 。其水解的最终产 物是单个的核苷酸
平末端
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端, 如SmaⅠ
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限制性核酸内切酶具体切割方法
一、配置反应体系 DNA保证一定纯度，反应缓冲液要保证是酶切反应 的最佳pH，保持正常的DNA浓度，选择合适的酶 量 二、把握反应温度及时间 根据产品的说明来决定最佳反应温度与反应时间， 以免内切酶产生星活性。
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分类
限制性核 酸内切酶
第一类内 切酶
第二类内 切酶
第三类内 切酶
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第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别 点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但 是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺 序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切 酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得 到同样核苷酸顺序的DNA片段， 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的 回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定 位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
限制性核酸内切酶具体切割方法 三、酶切终止
1、加入EDTA或0.1%的SDS。EDTA可能会使后续酶切变 得困难 2、在65-80℃下加热20min，但可能酶的灭活不彻底。 3、用酚或氯仿抽提，然后乙醇沉淀。
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限制性核酸内切酶切割 的原理与方法
概念
限制性核 酸酶酶
核酸内切酶： 能识别双链 DNA分子内 部的特异位点 并裂解磷酸二 酯键
外切酶：核酸
外切酶是一类能从 多核苷酸链的一端 开始按序催化水解 3、5-磷酸二酯键 ，降解核苷酸的酶 。其水解的最终产 物是单个的核苷酸
平末端
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端, 如SmaⅠ
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限制性核酸内切酶具体切割方法
一、配置反应体系 DNA保证一定纯度，反应缓冲液要保证是酶切反应 的最佳pH，保持正常的DNA浓度，选择合适的酶 量 二、把握反应温度及时间 根据产品的说明来决定最佳反应温度与反应时间， 以免内切酶产生星活性。
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分类
限制性核 酸内切酶
第一类内 切酶
第二类内 切酶
第三类内 切酶
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第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别 点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但 是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺 序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切 酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得 到同样核苷酸顺序的DNA片段， 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的 回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定 位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
限制性核酸内切酶具体切割方法 三、酶切终止
1、加入EDTA或0.1%的SDS。EDTA可能会使后续酶切变 得困难 2、在65-80℃下加热20min，但可能酶的灭活不彻底。 3、用酚或氯仿抽提，然后乙醇沉淀。
人类基因组dna的提取实验报告
人类基因组dna的提取实验报告
人类基因组DNA的提取实验报告
DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础性技术之一。
本次实验旨在从人类细胞中提取DNA，并通过多种方法进行检测和分析。
以下是实验的详细过程和结果。
实验材料与方法：
1.材料：人类细胞样本、细胞裂解液、蛋白酶K、异丙醇、氯仿、等渗盐溶液、乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA标准品。
2.方法：
（1）取100μl人类细胞样本，加入细胞裂解液中进行细胞破裂。
（2）加入蛋白酶K使细胞膜和蛋白质降解。
（3）加入异丙醇使DNA沉淀，离心去除上层液体。
（4）加入氯仿和等渗盐溶液，离心分离DNA纯化。
（5）加入乙醇沉淀DNA。
（6）加入TE缓冲液重溶DNA。
（7）用琼脂糖凝胶电泳法分离DNA并检测。
实验结果：
经过琼脂糖凝胶电泳分离，成功提取了人类细胞的DNA样本。
在电泳结果中，能够明显地看到DNA条带的形成，表明DNA的提取和纯化过程都比较成功。
为了进一步检测DNA的纯度和浓度，我们使用了多种方法，如吸光度测定、荧光染料检测等。
实验结果表明，提取出的DNA纯度较高，浓度也较为理想。
结论：
通过本次实验，我们成功地提取了人类细胞的DNA，并对其进行了检测和分析。
这为我们后续的研究提供了重要的基础。
同时，实验还说明了DNA提取技术的重要性和应用广泛性，不仅在分子生物学和遗传学领域有着广泛的应用，也在医学和生物工程等领域具有重要的价值。
提取基因组DNA
DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有 负电荷的DNA分子 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至 条带DNA都到膜上，取出洗下
500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不
适用于分子量超过10kb和单链DNA
第四十八页，共140页。
透析袋电洗脱 ：
切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继 续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。
（一）全血 1.抗凝剂
EDTA-Na2
或枸橼酸钠
作为抗凝剂
不宜使用肝素
-80℃ 4℃ 室温
抗凝剂处理血
肝素 柠檬酸* EDTA*
保存2个月，第10天收率90%
第四天收率90%
第10天提取效 果差
提取效果差
第十天收率85% 第四天收率90%
第十天提取效果差
第四页，共140页。
AB C D
mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧 光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
第二十一页，共140页。
EB与DNA的结合
第二十二页，共140页。
500l全血提取的基因组DNA电泳
动物组织提取基因组DNA
第二十三页，共140页。
纯度鉴定
第十页，共140页。
结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液 去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸， 使用生理盐水后取上清液
痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检 测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率
第十一页，共140页。
三、DNA的收率
样本类型 20mg肝脏组织
100mg豆苗 100l全血 2106培养细胞
500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不
适用于分子量超过10kb和单链DNA
第四十八页，共140页。
透析袋电洗脱 ：
切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继 续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。
（一）全血 1.抗凝剂
EDTA-Na2
或枸橼酸钠
作为抗凝剂
不宜使用肝素
-80℃ 4℃ 室温
抗凝剂处理血
肝素 柠檬酸* EDTA*
保存2个月，第10天收率90%
第四天收率90%
第10天提取效 果差
提取效果差
第十天收率85% 第四天收率90%
第十天提取效果差
第四页，共140页。
AB C D
mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧 光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
第二十一页，共140页。
EB与DNA的结合
第二十二页，共140页。
500l全血提取的基因组DNA电泳
动物组织提取基因组DNA
第二十三页，共140页。
纯度鉴定
第十页，共140页。
结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液 去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸， 使用生理盐水后取上清液
痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检 测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率
第十一页，共140页。
三、DNA的收率
样本类型 20mg肝脏组织
100mg豆苗 100l全血 2106培养细胞
人类基因组DNA的提取课件
• 同一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的位 点图谱有助于对DNA的结构进行分析。 限制性核酸内切酶分析技术是病原变异、毒株 鉴别、分型及了解基因结构和进行流行病学研究的有效方法，对动物检疫有很重要的 实用意义，尤其对区别进出境动物及动物产品携带病毒是疫苗毒还是野毒，以及推论 其是本地毒还是外来毒有很重要的意义。
● 酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在其中。（加 入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细胞降解物而纯化 DNA，可以避免酚的污染。）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
人类基因组DNA提取的方法
根据来源： ● 从全血中提取
● 从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取
其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物
理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当
于双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核苷酸为20μg/ml
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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人类基因组DNA提取的方法
● 从口腔上皮脱落细胞中提取
裂解
与裂解液消化 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液 反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心 10分钟，倒掉上清液；重复1次。 2、沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀， 再 加 酶 解 混 合 液 （ 含 350μl STE 、 150μl 10% SDS 和 10μl 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过 夜或50℃3~4小时。
● 酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在其中。（加 入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细胞降解物而纯化 DNA，可以避免酚的污染。）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
人类基因组DNA提取的方法
根据来源： ● 从全血中提取
● 从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取
其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物
理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当
于双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核苷酸为20μg/ml
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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人类基因组DNA提取的方法
● 从口腔上皮脱落细胞中提取
裂解
与裂解液消化 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液 反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心 10分钟，倒掉上清液；重复1次。 2、沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀， 再 加 酶 解 混 合 液 （ 含 350μl STE 、 150μl 10% SDS 和 10μl 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过 夜或50℃3~4小时。
2021人类基因组提取PPT优秀资料
❖ DNA的纯化:
❖ 4. 再参加600 μl洗涤缓冲液〔washing
EcoP1:AGAbCCuffer〕到离心吸附柱〔套好收集管〕中，12，
000 rpm 离心30秒。 4、小心移上清至另一离心管〔尽量防止吸取中间层〕，加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，别离范围广。
7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期 保存，那么需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
限制性核酸内切酶
一、概念
核酸酶
内切酶 外切酶
限制性核酸内切酶：
能识别双链DNA分子内部 的特异位点并裂解磷酸二 酯键
二、分类
❖ 分类依据：酶的基因、蛋白质构造、依赖的辅助因子及与DNA结合和裂解的 特异性
人类基因组提取
人类基因组DNA的提取
提取方法:
1·从全血中提取
2·从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取
(全血〕原理：
细胞裂解液 ：裂解细胞膜，收集细 胞核
SDS：破裂核膜
蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并
从DNA上解离
下来
苯酚﹑氯仿：抽提去除蛋白质
无水乙醇：沉淀DNA
75%乙醇：洗涤DNA沉淀
真空枯燥后，溶解于TE中即得到高
特性
I类
II类
III类
内切酶的蛋白结构 单一多功能的酶
内切酶和甲基化酶 共同亚基的双功能
分开
酶
限制和修饰活性 3种不同的亚基
单一成分
2种不同的亚基
所需辅助因子
ATM,Mg2+,SAM
Mg2+
ATM,Mg2+,SAM