实验六多糖的制备与检测

灭内源酶活
除淀粉
去蛋白质
浓缩 除杂
去纤维素
去酶
分离纯化
蒽酮法检测
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实验记录
操作步骤：
(1)灭内源酶活:将大麦磨成粉 (40 目),85℃烘 1 h。
(2)除淀粉:将沉淀按 1∶6 比 例溶于水,90℃处理,糊化 30 min,然后降温至 60℃,pH 值 4.0~4.5 用糖化酶处理 2h。100g 大麦粉糊化后加入 15ml 糖化 酶.
实验六 多糖的制备与检测
实验申请
实验项目：从植物种子中分离制备多糖（主要为β葡聚糖）
实验材料：大麦种子
实验器材：
（1）万能粉碎机
（2）恒温干燥箱
（3）电子天平
（4）恒温水浴锅
（5）集热式恒温加热磁力搅拌器
（6）离心机
（7）分光光度计（配套比色皿）
试剂：淀粉酶、蛋白酶、无水乙醇，Na2CO3，HCl（调 pH 用），蒽酮试剂，
乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖
类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与
蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长
下进行比色。
实验材料补充
1、 测定多糖含量的其他方法
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生 物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 注意： （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色 持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数 0.9 校正μg 数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的 校正系数加以校正计算。 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在 0.1——0.3 之间。比 如：小于 0.1 之下可以考虑取样品时取 2 克，仍取 0.2ml 样品液，如大于 0.3 可 以减半取 0.1ml 的样品液测定。 2、硫酸苯酚法与硫酸蒽酮法测多糖对比： 2.1.苯酚法测定可溶性糖 植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖 的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙 红色化合物，在 10－100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在 485nm 波长 下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本 不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定 160min 以上。 2.2.蒽酮法测定可溶性糖
乙醇洗涤,再离心收集,丙酮洗 涤,真空干燥,得粗产品β-葡聚糖。
(8)蒽酮法检测。
蒽酮比色法：
葡萄糖标准溶液（ 100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖， 溶于 蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。 蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把 浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶 内。称取样品粉末（ 5 ～ 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水， 在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏 水冲洗残渣数次，定容至刻度。 2. 标准曲线制作 取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入 各试剂。表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量
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基本实验方案
实验步骤： 1.灭内源酶活:将大麦磨成粉(40 目),85℃烘 30min。 2.除淀粉:按大麦粉：水等于 1∶6 加入水,90℃糊化 30 min,然后降温至 70℃, 调 pH=4.5 加 2ml 淀粉酶处理 2h。 3 去蛋白质:用胰蛋白酶在 37℃下 pH=7.5 处理上述溶液 2h。(1000ml 去淀 粉液加蛋白酶 0.5m) 4 去酶:在 90℃,水浴 10 min。 5 去纤维素:将上述溶液用 8000min 的离心速度离心 10min,（所得上清液 为含有β-葡聚多糖、氨基酸或寡肽、单糖、低聚糖、水溶性维生素的溶 液。） 6 浓缩、除杂:由于多糖属大分子物质,而氨基酸、寡肽、单糖、低聚糖等 属小分子物质,用超滤法除去,同时也可用作浓缩。将清液用截留分子量为 10000 的膜,压力 1.2~1.4 MPa,温度 30℃,浓缩。 7 分离纯化:用饱和硫酸铵溶液将多糖沉淀,然后用无水热乙醇洗涤,再离 心收集,丙酮洗涤,真空干燥,得粗产品β-葡聚糖。 8 蒽酮法检测。(方法见第 5 页) 工艺流程图：
次序 第 1 次离心 第 2 次离心 第 3 次离心
目标产物 上清液 沉淀 上清液
目的 除去不溶于水的物质
醇沉的多糖物质 除去不溶于水的杂质
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注意：在实验过程中应记录第一次离心后所得上清液的体积，然后取取部 分液体继续进行以下步骤，这样既可以减少离心的工作量，同时又可以避 免多次离心所带来的误差。
葡萄糖标准液（ 100 μg/mL ）。
耗材及辅助器材：
（1）温度计
（2）量筒 25ml×1，
（3）试管 25ml×8
（4）pH 试纸
（5）烧杯 200ml×5
（6）50ml 容量瓶×5
（7）多种规格移液管
参考文献： [1] 蒋本国，王艳颖，李春斌，刘秋.生物化学实验.大连民族学院.2010.7 [2] 王镜岩，朱圣庚等，生物化学教程，高等教育出版社，2008.6. [3] 谭天伟. 生物分离技术.北京：化学工业出版社.，2007.7 [4] 刘宝全. 生化分离工程实验讲义（内部试用版）.大连民族学院生命科学学 院.2011.6
生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量
测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖
与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等
（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮
法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
(6)浓缩、除杂:由于多糖属大分 子物质,而氨基酸、寡肽、单糖、 低聚糖等属小分子物质,用超 滤法除去,同时也可用作浓缩。 将清液用截留分子量为 10000 的膜,压力 1.2~1.4 MPa,温度 30 ℃,浓缩。
(7)分离纯化:用饱和硫酸铵溶 液将多糖沉淀,然后用无水热
操作结果及记录：
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实验原理： 1、大麦是我国古老的药食兼用植物。我国大麦资源丰富,但 70%以上的大 麦和大麦麸皮用作饲料,大麦资源利用附加值低。研究表明,大麦具有调血 脂、抗衰老、降血糖等多种药理活性。多糖作为一种重要的生命物质,具有 多种生物活性。本论文以大麦和大麦麸皮为原料,研究大麦多糖和大麦麸皮 多糖的提取、抗氧化活性和体外抑瘤作用,为功能性食品和药品的研究开发 提供依据,为大麦和大麦麸皮的高效利用提供新途径。在大麦胚乳细胞壁 (75% ) 和糊粉层细胞壁(26% )中含有 3% ~5%的β-葡聚糖,有些品系可高达 12%β- 葡聚糖是一种重要的非淀粉多糖,其结构由均一的 D-吡喃葡萄糖 (Glcp)单位通过β-(1→3)和β-(1→4)键连接而成,其中大约包括 58% ~72% 的由β-(1→3)键连接的纤维三糖和 20% ~34%的纤维四糖单位。β-(1→3) 键往往单个存在,β-(1→4)键则可 2 个、3 个连续存在,最大可以达到 14 个葡萄糖单位[3]。这些结构特点,使得β-葡聚糖表现出可溶性、高黏性、凝 胶形成等多种功能特性,因此β-葡聚糖不仅具有降低胆固醇、降血糖、改善 肠道功能等保健作用[4, 5];而且还可以作为增稠剂、凝胶剂等应用于食品工 业中，是一种重要的可溶性膳食纤维。 2、蒽酮法测定可溶性糖原理 :糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛 或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍
出的多糖为粗提产品，纯度不高，含有大量的杂质。 2、实验所得产品的粗提率为 36.70%。根据文献记载偏高，也说明了所提
物质中有大量杂质，初步分析为一些为除去的淀粉、纤维素、蛋白质、 水溶性维生素等成分。 3、本次试验中添加的淀粉酶用量为严格按照比例添加，会导致淀粉清除不 彻底，影响实验结果。 4、本实验中应注意三次离心的目标产物与离心的目的：
试剂 0
100 μg/mL 葡 0
萄糖溶液（ml）
管号
1
2
3
4
5
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蒽酮试剂（ml） 5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
葡萄糖量（μg）
0
20
40
60
80
100
将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620nm 波 长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ） 为横坐标绘制标准曲线。 样品测定 取待测样品提取液 1.0mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色 测定光密度。重复 3 次。
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实验结果与分析
实验记录： 1、实验原料质量：10.085g
实验 pH=6.0 - 6.5
2、提取固液比为：1:6
3、最后一次离心所得液体的体积：V=134ml
4、产品 OD 值测定：
稀释倍数 OD 值
100 0.885
1000 0.120
根据葡萄糖溶液标准曲线：
得到标准曲线方程： y 0.249x 0.003 OD 值为 0.885 时， y 0.249x 0.003 0.249 0.885 0.003 0.2234(mg / ml) OD 值为 0.120 时， y 0.249x 0.003 0.249 0.120 0.003 0.0329(mg / ml) ① 根据稀释 100 被数据计算：
(3)去蛋白质:用胰蛋白酶在 37 ℃下处理上述溶液 2h。(1000ml 去淀粉液加蛋白酶 0.5m)
(4)去酶:在 90℃,水浴 10 min。
(5) 去纤维Βιβλιοθήκη Baidu: 将上述溶液用 6000min 的离心速度离心 10min,（所得上清液为含有β葡聚多糖、氨基酸或寡肽、单 糖、低聚糖、水溶性维生素的 溶液。）
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在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总
量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合
物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞
壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，
不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半
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糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛 可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比， 故可用于糖的定量。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以 测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等，因为反应液中的浓硫酸可以把多 糖水解成单糖而发生反应 X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中 全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮 法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳 水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中 的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与 蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳 糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一 糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 630nm，故在此波长下进行比 色。 总结： 硫酸苯酚法不同单糖显色后产生较好吸收峰，稳定性也很好，但不同时间不同操作人 员操作时所测数据有差异，建议在使用硫酸苯酚法测定多糖含量时，需同时用对照品 作对照，并结合标准曲线参数计算多糖含量，避免直接由标准曲线读数，使得不同时 间所测数据产生较大差异。硫酸蒽酮法稳定性较差，线性关系不理想，重现性、稳定 性所测数据差异较大，并且蒽酮试液稳定性也较差，需临时配制，特别是加热后最大 吸收峰偏移较大，建议在进行多糖含量测定时不宜采用此法。
m 产品 m （产品 100） m （产品 1000） 2993.5 4408.6 3701.05mg
2
2
所以产品的粗提得率为：
η m产品 100% 3701.05 100% 36.70%
m原料
10.085 1000
实验结果分析： 1、在本次实验的操作中我们只进行了淀粉水解与酶失活处理，所以所提取
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C产品 C测 稀释倍数 0.2234 100 22.3（4 mg / ml） m（产品 100） C产品 V 22.34 134 2993.56mg
② 根据稀释 1000 被数据计算： C产品 C测 稀释倍数 0.0329 1000 32.（9 mg / ml） m C V （产品 1000） 产品 32.9 134 4408.6mg