免疫分析法
免疫分析定量操作规程
免疫分析定量操作规程免疫分析是一种用于检测抗原或抗体的定量方法，其中包括了酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）和荧光免疫测定法（FIA）等多种技术手段。
在进行免疫分析的定量操作时，需要按照一定的规程进行操作，以保证结果的准确性和可重复性。
以下是免疫分析的定量操作规程的一些要点：1.试剂准备：a.充分摇匀试剂瓶，确保试剂溶液均匀混合。
b.避免试剂受到阳光暴晒或高温，保持存储环境稳定。
c.注意试剂的保质期，过期试剂不得使用。
2.标准曲线制备：a.按照实验要求准备不同浓度的标准品。
b.将标准品依次加入已标记编号的试管中，制备标准曲线。
c.准备相应的空白对照，标准曲线上和标本测定时要包含空白对照。
3.样本处理：a.样本提取：按照实验方法的要求，采用适当的提取方法，将样本处理成所需的形式。
b.稀释样本：根据样本浓度情况，选择适当的稀释倍数，使其在标准曲线范围内测量。
c.确保样本处理的准确性，避免交叉污染。
4.试剂加入：a.按照试剂方案加入试剂，避免试剂倒错或加漏。
b.试剂加入后要立即轻轻摇匀，使试剂和样本充分混合。
c.确保试剂加入的准确量和顺序，避免对结果产生影响。
5.孵育和洗涤：a.按照实验要求，在适当的温度和时间下进行孵育，保证所需的反应充分进行。
b.洗涤操作要准确、迅速，避免反应物的非特异性结合和干扰物的残留。
c.注意洗涤缓冲液的配制和使用时间，确保洗涤效果。
6.信号检测和数据处理：a.按照实验要求选择恰当的信号检测方法，如酶标仪、放射计或荧光仪等。
b.确保检测设备的正常工作和实验环境稳定。
c.数据处理要谨慎，确保数据的准确性和可靠性，如标准曲线拟合、计算和结果分析等。
7.质量控制：a.每天开始实验前，进行设备的校准和质控品的测量。
b.在实验过程中，每个批次样本测定时要配备质控品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
c.记录和分析质控品的结果，如出现异常情况要及时调查和处理。
免疫分析的定量操作规程是确保实验结果准确和可靠性的重要环节，需要严格遵守。
11.4生物制品分析方法 -免疫法
生物制品分析的常用方法生物制品分析中常用的方法包括理化分析法、电泳法、酶法、免疫法、生物检定法等。
理化分析法在前面章节已有介绍，本节主要介绍电泳法、酶法和免疫法。
三、免疫分析法动物的免疫反应分为细胞免疫和体液免疫两种。
体液免疫指在外界抗原物质的刺激下产生专一性抗体的反应。
抗原和抗体的沉淀反应可以在体外发生，目前常被用于抗原物质的鉴定。
免疫扩散和免疫电泳法因其高度的反应专一性而成为近代生物制品不可缺少的分析技术。
常用的方法包括：免疫斑点法、免疫印迹法、免疫双扩散法和免疫电泳法。
免疫分析法（immunoassay，IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。
由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。
各种标记技术（放射性标记、荧光标记、化学发光、酶标记等）的发展，使免疫分析的选择性更加突出。
结合免疫分析法与其他分析方法的放射免疫测定法和酶联免疫测定法因具有独特的优势，随着商品化试剂盒的普及，近年来在定量分析中的应用也越来越广泛。
（一）免疫鉴定法1. 免疫斑点法本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体性能特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
检查方法是取硝酸纤维素膜，用EBM缓冲液浸泡15 min，将供试品、阴性对照品（可用等量的人白蛋白）及阳性对照品点在膜上，上样量应大于10ng。
室温干燥60min。
取硝酸纤维素膜，浸入封闭液（10%小牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜的缓冲液）封闭60 min。
弃去液体。
加入缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参照抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。
硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8 min。
弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40 min。
硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8 min。
免疫分析法ppt
酶联免疫分析法——应用2
2、放射免疫分析法(RIA)
• 简介
1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核 素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA)。
• 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫
化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种 超微量物质的测定方法。
兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高
效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相 色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射 电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电 泳－离子阱质谱等方法。
二、免疫分析法
免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。
特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。
免疫分析法ppt
兴奋剂的检测方法
之免疫分析法
一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法
（1）酶联免疫分析法 （2）放射64年，国际运动医学会的国际兴奋剂 会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的 运动员使用任何异体物质，或以不正常的 量和不正常的进入机体的途径使用生理物 质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛 成绩的行为。
抽干。
4、结果
γ一记数 仪记数， 并自动计 算尿中MA
浓度 (ng·ml-1)
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检 测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术 (RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的 特异性，更兼有发光反应的高敏感。
1、酶联免疫分析法(ELISA)
酶联免疫分析法——原理
(整理)免疫分析法
免疫分析法1,熟悉免疫分析法的基础知识,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法第一:概述基本原理基本条件方法分类免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.一,基本原理(一)竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反应Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数(K=K1/K2).抗原-抗体反应须满足以下条件:Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;所加入Ag*和Ab的量应是固定的;Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线)用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原;F代表游离的标记抗原;T代表总的标记抗原.B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag](三)抗原一抗体反应的特点1.特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力.交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合.2.可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.3.最适比例性抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.以沉淀免疫反应为例二,基本条件三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1.全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质.物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.抗原特异性(Antigenic Specifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.1.全抗原与半抗原全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.人工完全抗原:药物(半抗原) 本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.2.人工抗原的制备(1) 载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力,价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA), 兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)(2) 半抗原的选择药物本身必须具有合适的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=O等.(3)载体与半抗原的结合①碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键②混合酸酐法③戊二醛法④琥珀酸酐法⑤重氮化的对氨基苯甲酸法3.人工抗原的鉴定鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比光谱分析法化学分析法放射性同位素法(1)光谱分析法结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比. (2)化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别.反应出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.(3)放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例.4.标准抗原(Standard antigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据.蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否则会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体(Specific Antibody)特异抗体:(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反应,在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白.在免疫球蛋白中,免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.2.抗体的制备单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb): 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞,经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞.该瘤细胞通过体外培养,可大量复制,产生出特异的结构相同的均质抗体,此即单克隆抗体.多克隆抗体(Polyclonal Antibody)的制备是将抗原直接免疫动物而得到.抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类(1)免疫原的制备免疫原(Immunogen):人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质.水剂:抗原中加入一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原.福氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant):其制法是:取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合,高压灭菌,等体积地与一定浓度的抗原混合,按3 mg/ml的量加入卡介苗,研磨或于无菌注射器中对拉,使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.(2)免疫接种动物家兔不仅对抗原的免疫反应较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.羊,豚鼠微量免疫法的免疫抗原量在微克级内,常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10 mg左右,大量免疫法的免疫抗原量在50～100 mg.(3)抗血清的获得采血时应注意无菌操作,尽可能将血放人面积较大的无菌容器中,先室温凝固30min左右,再放人30℃温箱约2h使凝固,最后放入4℃冰箱过夜.次日吸取血清,将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎,在4000-10000 r/min离心20min,即得抗血清.大动物免疫羊部分采血家兔等小动物杀死动物一次性放血.3.抗体的鉴定(1)滴度(Titer)滴度又称效价或工作稀释度.滴度用免疫反应液中抗体(实指抗血清)的稀释度表示,稀释倍数越大,表示滴度越高.测定滴度可采用标记抗原法.RIA法测定抗血清的效价为例首先将抗血清用空白血清按比例稀释,然后精密吸取各稀释抗血清等量,分置若干支试管中,再于各试管中分别加入定量的放射性同位素标记药物(设放射性强度为T),温育.待反应达到平衡后,于反应液中加人分离剂(如沉淀剂),分离与抗体结合的标记药物(沉淀部分),测定各管中沉淀的放射性强度(B),并计算各管中标记药物的结合百分率(B/T%).当抗血清稀释度足够低时,其结合率趋于极值,该值称为"过量抗体结合率"(标记药物全被结合),如图中曲线的AB段,可用来衡量标记药物的质量.自AB段以后,随着抗血清稀释倍数增大,其标记药物的结合率逐渐降低,实际工作中多采用结合率为50%时(C点)的抗血清稀释度(D点).(2)活度(Avidity)活度:抗体与相应抗原的亲和力(Affinity).活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合能力.活度高,表明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小.抗体活度高低与免疫分析方法的灵敏度密切相关,它主要表现在剂量反应曲线的斜率上,斜率越陡,表明活度越高,测定效果越好.(3)特异性(Specificity)特异性:抗原和抗体的结合能力与其它结构相类似的干扰物的结合能力的比较.如果抗体与抗原的结合能力越强,而与其它类似结构的干扰物结合能力(称为交叉反应)越弱,则说明抗体的特异性越强.三,方法分类1.按标记物的种类分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)(2)酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)(3)化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CIZIA)(4)荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)荧光免疫分析法底物标记荧光免疫分析(Substrate labeled fluorescence immunoassay,SLFM)荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)荧光淬灭免疫分析(Fluorescent Quenching Immunoassay,FQM)荧光增强免疫分析(Fluorescent Enchancement Immunoassay,FEIA)时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)2.按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失,因此无需将反应液分作两相,即可在均相溶液中进行测定,故称为均相免疫分析.如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique,EMIT) .(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,只有在反应液中加入分离剂,将游离标记药物和结合标记药物分开之后,才能测出各自部分的标记药物浓度.否则,测定的是两者的总浓度.由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后,才能分别测定,故称为非均相免疫分析.如放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA)第二放射免疫分析放射性同位素标记抗原F与B的分离技术放射免疫测定仪标准曲线的制备与样品测定步骤方法评价应用举例放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA):利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术.特点:灵敏度高,特异性强,样品用量少,标记物容易制备以及放射性强度容易检测一,放射性同位素标记抗原在体内药物分析中,常采用放射性同位素.放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其它元素的不稳定同位素.放射性同位素在发生核衰变时,会发射出α-射线,β-射线及γ-射线.用相关仪器检测产生的射线,即可用于于定量分析.1.放射性强度放射性强度(严格说应为放射性活度):每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数(desintegration per-second,dps),其单位为贝可(Bq).1贝可相当于每秒1次核衰变,即lBq=1dps.1居里是指每秒钟放射性同位素发生3.7×1010次核衰变.2.放射性比度放射性比度或称比放射性或比活性:放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度. mci × g-1或mci×ml-13.放射性化学纯度(放化纯度)放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比.一般实验要求放化纯度大于90%.(二)标记抗原(Iabeled Antigen)标记抗原又称放射性标记药物,供标记的药物通常应是待测药物的纯品.标记抗原的纯度决定RIA的特异性,而标记抗原的放射性比度则决定RIA的灵敏度.因此,标记抗原是RIA测定技术中最关键的成分.1.对标记抗原的一般要求①有高的放射性比度;②标记后抗原仍具有原来的抗原性;标记物稳定性要好,不致因辐射引起化合物分解.2.标记放射性同位素的选择125I的特点是:①化学性质活泼,易于标记;②标记物在衰变中放出的γ-射线能量较高,易于测定;③标记物的放射线半衰期相对较短,须经常标记;④碘原子的半径较大,标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团,易使药物分子的抗原性受到影响.3H的特点是:①用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度;②标记后的药物的抗原性不会受到影响,因为氢原子的半径较小,且3H只是与药物分子的1H发生交换,不涉及化学元素的改变③ 3H的半衰期很长,可达12～16年;④ 3H发射出的β射线能量较低,须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度.(三)标记方法1.125I标记抗原的制备取代反应将其标记在药物或药物的衍生物上.用碘标记时一般采用氧化法,常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等,目前应用最多的是氯胺T.氧化法是指先用氧化剂将放射性碘离子(I-)氧化成游离的放射性碘分子(I2),然后再进行标记.大分子药物可直接采用放射性碘标记.小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸,组氨酸或含酚基的衍生物,然后再进行标记,使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代.2.3H标记抗原的制备H标记可分为定位标记和非定位标记两种方法.非定位标记通常采用气体曝射法,即将药物与氚(3H)气密封在一起,放置几天或几周,使3H与药物分子的1H发生交换定位标记采用特殊的合成路线,即先将3H引入药物分子结构中的指定位置,制成含有不饱和双键的标记药物前体,然后再对双键部位进行催化加氚.这种制备3H标记物的方法称为定位标记.二,F与B的分离技术游离的标记药物(F)和结合的标记药物(B)1,沉淀法2,吸附法3,固相法4,双抗体法(一)沉淀法用蛋白沉淀剂将抗体沉淀,从而可使与蛋白(抗体)相结合的药物也一起沉淀下来,而游离的药物由于未与蛋白结合,便留在于溶液中.常用的沉淀剂:硫酸铵,亚硫酸氢钠,乙醇,异丙醇.方法:在免疫反应达到平衡后的反应液中加入一定量的饱和硫酸铵溶液,使最终浓度为1.6-2.0mol/L (约40%-50%的饱和度),立即混匀,在4℃条件下反应20～30min后,离心,分离沉淀物,用40%的硫酸铵饱和溶液洗涤沉淀,然后测定放射性强度.优点:快速,简便,价廉.缺点:不能使F和B完全分离,沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附,因而空白值较高.(二)吸附法吸附法是利用固体吸附剂能在反应液中吸附游离抗原的原理而使F与B分离.常用的吸附剂:右旋糖酐包裹的活性炭(Dextron Coated Carbon,DCC),纤维素,硅酸盐等.原理:DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用,使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附,而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中.方法:当免疫反应达到平衡后,于反应液中加入DCC吸附剂,待吸附达平衡后,离心.离心后的结果正好与沉淀法相反,上清液中是与抗体相结合的标记药物(B),而沉淀中则是游离的标记药物(F).优点:快速,简便缺点:如药物一抗体结合物的离解常数较高时,测定结果不稳定.(三)固相法原理:通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体表面,待抗原与抗体形成结合物(B)后就附在固相物上,而游离的抗原(F)则仍留在反应液中,从而实行分离.该法实质上是一种固相免疫测定法(solid-phase immunoassay),其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂.常用的固相载体:葡聚糖凝胶,聚苯乙烯,纤维素,试管等.方法:采用试管固相法,即将抗体直接附着于试管底部的内壁上,测定时于试管中加入样品和试剂,当放射免疫反应达到平衡后,结合物就附在管壁上,游离抗原则留在液相中.通过离心或采用简单倾去法便可将两相分离.优点:简便,快速,实用.缺点:有时难以获得重复的结合率,其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物,导致结果误差增大.(四)双抗体法分离原理:药物(半抗原)与抗体结合后,虽然分子量增大,但还不足以生成沉淀而处于"溶解"状态,这种抗体通常被称为第一抗体,它可通过将抗原注入家兔,豚鼠等动物体内免疫获得.然后再将第一抗体作为新的抗原注入羊,马,牛等较大动物,则可免疫获得第二抗体(抗一抗体).当往第一抗体的反应液中加入第二抗体后,第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大,从而生成沉淀.离心后与抗体结合的标记药物(抗原-第一抗体-第二抗体结合物)处在沉淀中,而游离的标记抗原则留在上清液中.优点:分离效果好,适用范围广.缺点:抗体的制备有一定难度,且操作流程较长.三,放射免疫测定仪一类是γ计数器(γ-Counter),其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体,为提高其发光效率,还在晶体内加入有0.1%-0.5%的铊作为激活剂,该仪器适合测定125I,131I等同位素发射出的能量较高的β-射线.一类是液体闪烁测量仪(Liquid Scintillation Counter),由于该仪器放出的β射线能量低,射程短,不可能穿人和激发固态闪烁晶体,而只能在特定的闪烁液中进行,由β-射线激发液体闪烁剂而产生闪光现象.该仪器适合测定3H,14c等同位素发射出来的β-射线.(一)测量原理液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的β-射线能作用于闪烁液而发出荧光(闪光),该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变次数有关,通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量.1.溶剂作用:溶解闪烁剂和放射性样品;同时还起着吸收和转移β-射线能量的作用.条件:溶剂分子必须具有高度共轭的双键,只要受到能量低的β-射线的辐射,其π电子就能跃迁至激发态.一类是烷基苯类,甲苯,对-二甲苯,1,2,4-三甲苯等,主要适用于脂溶性药物的测定.另一类是醚类,1,4-二氧六环,适用于水溶性药物的测定.种类2.闪烁剂作用:接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量→激发态→基态→发射出闪烁的荧光(光子)→光电倍增管→光电转换测量系统记录.要求:性能稳定,闪烁效率(闪烁剂放出光子的能量)高,淬灭耐受性好,发光衰减时间短.常用的闪烁剂有:对联三苯(TP),2,5-二苯基恶唑(PPO),2-苯基-5-(4-联苯基)-1,3,4-恶-二唑(PBD)等.(二)仪器简介1.计数瓶计数瓶(或称闪烁杯):一个具盖的玻璃或塑料小瓶(10～20m1),用于盛装样品和闪烁液.当放射性药物分子与闪烁液接触时,溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂,闪烁剂将吸收的能量转变为光能(荧光),荧光透过计数瓶壁,进入光电倍增管.2.光电倍增管光电倍增管:光阴极,倍增极和阳极构成.进入光电倍增管的荧光(光子)通过光阴极表面的透明面板后,直接撞击光阴极,光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子,光电子经数个倍增极依次放大,使电子数剧增.这些电子最后被阳极收集,产生一个电压脉冲,并由记录器记录下来3.记录器用于记录单位时间内所产生的电压脉冲数,该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核衰变次数(闪烁次数).通常采用每分钟计数(counts per minate,cpm),作为放射性同位素药物的放射性强度.四,标准曲线的制备与样品测定步骤(一)标准曲线的绘制取标准抗原,用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度.加入定量标记抗原,其总放射性(T)应能满足准确测量的需要.加入定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求.将标准抗原,标记抗原,特异抗体与缓冲液混匀后,在适当条件下温育,待反应平衡后测定总计数率(T).加入分离剂,使结合部分(B)与游离部分(F)分离.测定各管结合部分或游离部分的计数率.标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标,以结合率(B%)为纵坐标作图.纵坐标B%的计算有两种方法:一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较,即B%=(B/T)×100%;另一种是用零标准管(不加药物标准品)的放射性强度B0代替T比较,即B%=(B/B0)×100%.(二)样品测定步骤下述情况样品需进行简单处理:测定方法不够灵敏,可将被测物适当浓集;测定方法不很专属,可将被测物与其它干扰物质分离;待测物以缀合物形式存在,可设法使其游离,然后进行测定.例:125I-RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl 空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下,迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内),摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率.五,方法评价灵敏度高,特异性强,取样量少,适用于大批量样品的测定.需用放射性同位素标记抗原,其放射性对操作人员的健康,对环境的污染都会造成危害,而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器,成本较高,因而使其普及受到限制. 六,应用示例固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛浓度的方法1.主要试剂2.测定方法3.结果计算(1)标准曲线法以地高辛标准品血清浓度为横坐标,B标/T(%)为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出标准曲线..以地高辛标准品血清浓度为横坐标,但用(B标-BNSB)/(B0-BNSB)(%)为纵坐标作标准曲线,当测得血清样品的(B样-BNSB)/(B0-BNSB)(%)值后,也可从标准曲线上得到对应的血清药浓(2)回归方程计算法以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度),以logitY为因变量进行直线回归第三酶免疫分析法酶标记抗原均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法评价应用示例酶免疫分析(Enzyme Immunoassay,EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法.酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法. 一,酶标记抗原(一)标记酶的选择特异性强,酶蛋白分子中应具有足够的活性基团,以便能与药物结合.活性要高,即当底物浓度低时,确有较高的催化反应率.酶的活性不易受样品中其它成分影响,有较好的稳定性.酶的纯度要高,且生物体液中应无标记酶,底物,抑制剂及其它干扰物质存在.酶的活性测量方法应简单,灵敏,精密和快速.酶的来源,纯化,供应等应方便,价廉.最常用的标记酶1.辣根过氧化物酶(HRP):约有50%的EIA使用此酶.2.碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定,其活性可用分光光度计或荧光计测量.3.6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA.4.β-半乳糖苷酶(β-Gal): 适用于均相EIA和非均相EIA.5.苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA.(二)底物的选择①无色,无毒能溶水;②化学性质稳定,不受光照的影响;③转化率高,在酶催化下可产生大量的有色物质;④显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比;⑤应有终止酶反应的试剂.常用酶的底物1,辣根过氧化物酶的底物:邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA),四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB/TMBS)2,碱性磷酸酶底物:对硝基酚磷酸盐溶液(p-NPP),4-甲基伞酮基-磷酸盐(4-MUP)3,β-D-半乳糖苷酶底物:邻硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷(o-NPG),氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷(CPRG),试卤灵-β-D-半乳糖吡喃苷(RG)4,葡萄糖氧化酶底物:与辣根过氧化物酶底物相同(三):酶标记药物的制备。
酶免疫分析法
免疫分析法(immunoassay,IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。
由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限,使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。
1、酶免疫分析(EIA)酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示踪物,由高活性的酶催化底物显色或发光,达到定量分析的目的。
这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。
因其操作简便,不需昂贵设备,不污染环境,加之酶标记物相当稳定,有效期长,应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。
最初应用的EIA技术,多采用HRP标记抗体或抗原,灵敏度不高。
后来逐步发展了各种放大体系,如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系,以及采用PCR技术的PCR-EIA分析,使灵敏度有很大改进。
1.1生物素-链亲和素酶免分析(biotin avidin system BAS-EIA)[1]生物素(botin)广泛存在于动植物组织中,在生物体内是羧化酶的辅酶;亲合素又名抗生物素蛋白,与生物素具有高度的亲和性,利用这一点,以生物素和亲和素为中介,可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。
但亲和素的非特异性结合高,后又发现另一种亲合素,称之为链亲合素(Streptavin,SA),克服了亲合素非特异性结合高的缺点。
免疫分析技术中,目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。
一个完整的SA分子上的4个相同亚基,都可以和一个生物素分子结合,其Ka值达1015L/mo1,是抗体抗原反应的10~100万倍。
又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子,不改变其免疫活性。
1.2脂质体免疫分析法(liposome immunoassay,LIA)[1]脂质体是一种生物摸拟膜,它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。
其膜内可包容上万个标记物分子,具有很高的信号放大作用。
免疫分析法
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三种试剂的作用
抗体
作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白；
（三）抗原-抗体反应的特点
1、特异性
一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生
标记药物
提供可检测的信号（响应值）；
特异性结合反应。
交叉反应（cross reaction）
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第一节 概 述
免疫分析法（Immunoassay，IA）是指以特异性 抗原-抗体反应为基础的分析方法。
免疫分析法
SO3H R-N=N R-N=N
SO3H
SO3H N=N-R
间偶氮氨基苯磺酸
对偶氮氨基苯磺酸
邻偶氮氨基苯磺酸
三个同分异构体，当重氮化后和蛋白质结合时，在血清学上 能够互相区别
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标记抗原一抗体的结合率（B％）随着未标记抗 原量（待测物）的增加而减少（呈负相关）。 这种现象称作竞争抑制作用，即未标记抗原量的 增加抑制了标记抗原与抗体的竞争性结合。
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+
形成肽键 蛋白质的氨基
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6
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（5）重氮化的对氨基苯甲酸法 具酚羟基的半抗原 带有羧基的半抗原 重氮化的对氨基苯甲酸
合理地利用分子类似物间的交叉反应（Cross reaction）
合物。
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免疫分析方法
步骤：
A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙 烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则 与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附 的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用 光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。
1.2 免疫电泳
免疫电泳是一种将区带电泳和
双向免疫扩散相结合的免疫化
学分析技术。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板 上进行电泳，使其中的各 种成分因电泳迁移率的不 同而被分离成肉眼不可见 的区带。 停止电泳后，在与电泳方 向平行的槽内加入相应抗 血清，使抗原和抗体呈双 向扩散，已分离的各抗原 与相应抗体在琼脂中扩散 而相遇，在二者比例合适 处形成肉眼可见的沉淀弧。
（三）竞争法
酶联免疫吸附法ELISA
ELISA的基本原理和方法
ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
基本原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）
基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反 应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与 吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；
D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色 的改变与所加的待检标本溶液中的抗原 量成正比。
（二）间接法
间接法是检测抗体 最常用的方法，其 原理为利用酶标记 的抗抗体以检测已 与固相结合的受检 抗体，故称为间接 法。
免疫分析法
(2) 有机探针
荧光黄 常用的探针 荧光产率高，有较好的光稳定性和低的温度系 数。其缺点是斯托克斯位移较小。 在碱性的条件下，荧光黄与免疫球蛋白IgG的 自由氨基起反应. 罗丹明类化合物 广泛用来标记抗体 和荧光黄相比，其荧光产率不如荧光黄，可是 其发射波长较长，样品背景干扰较少。此外， 罗丹明类亦常作为能量转移的接受体。
(3) 金属螯合物
某些稀土金属离子会与某些配位体生成会发强荧光的配 合物。
如：Eu(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Nd(Ⅲ)与 β-二酮衍生物 对-氨基甲酰三氟丙酮 聚氨羧酯盐 邻菲罗啉
2．荧光免疫检测法的类型
（1） 均质检测法
均质检测法不需要分离步骤，方法简便快速， 但它常受到来自背景（血清）的干扰，该法系 根据已标记抗原联接于抗体时发生已标记抗原 荧光性质的改变。通常将均质检验法分为：
酶不稳定、光度分析线性范围窄 。
竞争型酶联免疫法测定氯霉素含量示意图
四.发光免疫分析法
荧光免疫分析法 化学发光免疫分析法 以荧光物质或化学发光反应物质作为标记物。 优点： 专一性强 灵敏度高 稳定性好，可避免放射性污染 标记物不同，因而检测方法也不同
A．荧光免疫分析法 Fluonescense Immuuoassay 1．荧光探针 （1） 一般要求 a 检测最常遇到的样品为血清，它有很高的荧光
c. 荧光激发转移
如荧光黄作为给予体，罗丹明作为接受体，荧 光黄的荧光与罗丹明的吸收光谱重叠，后者可 吸收前者的荧光。 例：吗啡的测定
i) 用荧光黄（F）标记抗原 罗丹明（R）标记抗体 Ag+AgF+AbR (Ag-AbR) + (AgF-
AbR) Ag的存在减少了荧光的猝灭程度
免疫分析法
The derivatives of AMPPD are superior than the parent compound to the lighting rates and signal intensities.
（3） 酶标记物GOD和G-6-PDH 利用某些酶作为标记物，然后通过标记的酶催 化生成的产物，再作用于发光物质，以产生生 物发光和化学发光。 葡萄糖 （4）固相法发光免疫分析 它不需要离心处理，操作简便，精确度高， 所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球
抗体和抗原（Antigen , Antibody）
免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。 抗原是一种外来物质，当其进入动物体内能 引起抗体的产生，并能和抗体反应的物质。 抗体 (antibody . Ab) 与抗原 (antigen . Ag) 的结合具有极高的专一性和亲合性。 不能诱导产生抗体，但能和适当抗体起反应， 即有免疫反应性的简单分子称为半抗原。
二. 放射性免疫分析（RIA）
Berson和Yallow 将免疫反应与分析化学相结合创立了放射性免疫分析法。 荷尔蒙的测定 先将荷尔蒙注入天竺鼠体内 对抗此抗原的抗体（Ab） Ag* + Ab === Ag*-Ab 要测定一病人的血清标本中荷尔蒙的浓度， Ag + Ag*-Ab === Ag-Ab + Ag* ( + Ag*-Ab ) 测定Ag*，可计算标本中所含有的荷尔蒙（Ag）浓度
Relative § ¶ 5 -100 14 84 -17 44 ---
b．吖啶酯类 不需要催化剂 优点： 高量子产率，低背景信号和易于与蛋白质连接，主要用 于标记半抗原和蛋白质。 缺点： 光发射是瞬时的
The molecular structure of the used acridinium ester NHS
免疫分析法
（1）活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键的结合剂 碳化二亚胺类（EDC） 异唑盐类 烷基氯甲酸类
（一）半抗原和载体结合的化学反应
（2）连接氨基的结合剂 二异腈酸类 二亚胺酯 卤代硝基苯
（一）半抗原和载体结合的化学反应
2、甾体
甾体激素不能直接和载体蛋白形成有效的共 价键，因此需要先制备甾体的衍生物（含游离的 羧基），然后再与载体蛋白连接，制成全抗原。 （1）甾体衍生物的制备 琥珀酸衍生物 肟衍生物 （2）甾体衍生物和蛋白质的结合反应
腹水制备法：常规是先腹腔注射0.5ml 液体石蜡（主要是 为了防止动物的排斥反应）于小鼠，1～2周后腹腔注射 1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水， 密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多， 而小鼠死亡之前，处死小鼠，用滴管或注射器将腹水吸入 试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。腹水中单克隆 抗体含量可达到0.5～5mg/mL，这是目前最常用的方法。
去掉福氏完全佐剂中的卡介苗即为不完全佐剂。
一、全抗原和半抗原
3、药物分子的抗原特异性
1）实践中，当药物分子和蛋白质载体结合后，诱导 机体产生的抗体通常为不均一抗体。即：有多个 不同的抗体，各抗体的特异性略不相同；
2）和蛋白质的结合还可能导致药物分子原有抗原特 异性的改变—抗原决定簇改变。
二、人工抗原的合成
抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答 的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。
四、抗体的制备
免疫分析中，常用到的两类抗体为抗血清 （多克隆抗体）和单克隆抗体。 1、抗血清 抗血清，通常指由抗原直接免疫动物后所制成 的多克隆抗体，它是免疫分析中的重要工具。 抗血清也称免疫血清，要获得一种质量好的抗 血清，主要有免疫原的制备、动物免疫、放血、 抗血清分离及抗血清的分析鉴定等步骤。
免疫分析
免疫分析免疫分析技术是一种以抗体和抗原的特异性结合来定性和定量分析目标物质的分析技术。
在免疫反应系统中，各种免疫分析的技术原理都是一样的，即抗原抗体反应。
但在检测系统中，根据标记物的不同，可以将免疫分析分为：荧光免疫分析（FIA）、放射免疫分析(RIA)、化学发光免疫分析(CLIA)和酶免疫分析(EIA)。
一、现代免疫分析在农药监测中的应用1）放射免疫分析(RIA)放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。
它包括以标记抗原(Antigen, Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody, Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay ,IRMA)。
前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。
最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。
但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。
1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。
2）酶免疫法(EIA)酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。
酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。
用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。
酶标试剂制备容易、稳定、价廉。
酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。
EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、酶免疫试验法(Enzyme-monitored Immunotest , EMIT)、竞争结合酶免疫分析法(Competitive Binding Enzyme Immunosorbent Assay, EIA)和免疫酶分析法(Immunoenzymometric Assay, IEMA)。
体内药物分析：免疫分析法
④琥珀酸酐法 该法是利用琥珀酸酐在无水吡 啶中与半抗原分子中的羟基反应，首先生成带 有羧基的半抗原琥珀酸衍生物，然后再与蛋白 质的氨基结合，形成肽键。
⑤重氮化的对氨基苯甲酸法 该法是利用重氮 化的对氨基苯甲酸（重氮化合物）先与带酚羟 基的半抗原反应，生成带有羧基的半抗原，然 后再与蛋白质结合
3. 人工抗原的鉴定
三种试剂的作用分别是： 1. 抗体是作为标记药物和非标记药物竞争结合 的蛋白； 2. 标记药物提供可检测的信号（响应值）； 3. 非标记药物在标准曲线制备时是药物标准品， 在样品中则为被测药物。它用于建立被测药物 量（浓度）与响应值之间的函数关系，是样品 中药物浓度计算的依据。
Ag Ab K1 Ag Ab
从图中可见，抗血清A的滴度及它和标记抗 原的亲和力较小，质量最差；B的滴度虽高， 但亲和力不够高；C质量最佳，选其结合率 50%稀释度，建立放射免疫分析方法最适宜。
（2）活度（Avidity）
活度是指抗体与相应抗原的亲和力 （Affinity)。它可反映出抗原与抗体结合的牢 固程度。活度高，表明形成抗原-抗体结合物的 速度快而解离小。抗体活度高低与免疫分析方 法的灵敏度密切相关，它主要表现在剂量反应 曲线的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，测 定效果越好。
4. 标准抗原（Standard antigen）
标准抗原是指在免疫测定中用来 制作标准曲线或制备标记抗原用的药 物标准品。标准抗原是免疫分析法的 定量依据。
（二）特异抗体的制备及鉴定
1. 特异抗体（Specific Antibody）
特异抗体是指抗原（免疫原）作用于机体 产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特 异性结合的免疫球蛋白。抗体具有高度的特异 性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。在 免疫球蛋白中，免疫球蛋白G（IgG）含量最高 （约占70％），是免疫分析中最常用的抗体。
免疫分析法
1. 双抗夹心法测抗原
适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定 半抗原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点
夹心
2. 间接法测抗体
3. 竞争法测定抗原
（1）将Ab吸附在固相载体表面;
（2）加入酶标Ag和待测Ag，竞争结合Ab； 对照只加入酶 标 Ag； （3）加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知 Ag量。
• 中和毒素
• 促进吞噬功能
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结合抗原和中和毒素
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.
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促进吞噬功能
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三、抗原与抗体反应的特点
1. 液相沉淀反应
（1） 絮状沉淀试验 操作步骤：
（a） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。
（b） 各管加入一定浓度的适量抗血清。
（c） 振摇使抗原、抗体充分混匀，臵37℃孵育。
（d） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的 管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低， 目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。
原，用于抗体的定量检测（如诊断伤寒病的肥达试验）。
2. 间接凝集
将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再
与相应抗体反应，出现颗粒物凝集现象。常用载体为人O型 血红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。
3. 间接凝集抑制试验
其原理是：将待测抗原（或抗体）与特异性抗体（或抗
原）先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液；
1、免疫动物的选择： ①抗原来源与动物种属的关系（越近越差）
免疫分析法
免疫分析法
免疫分析法是一种生物化学分析方法，它利用免疫反应来检测和测定特定的物质。
通过使用抗体来检测某些物质，这种方法能够快速准确地测量活性物质的含量，这些活性物质可以是蛋白质、核酸、激素或抗原等。
免疫分析法的步骤如下：
1. 样品制备：将样品中所要检测的物质分离出来，并浓缩到合适的浓度。
2. 抗体制备：制备一种特异性的抗体，以便检测样品中的特定物质。
3. 结合：将抗体与样品中的特定物质结合起来，形成抗原-抗体复合物。
4. 检测：通过检测抗原-抗体复合物的数量，来估计样品中特定物质的含量。
5. 评价：评价测定得到的结果，以检查测定的准确性。
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免疫分析法1,熟悉免疫分析法的基础知识,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法第一:概述基本原理基本条件方法分类免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.一,基本原理(一)竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反应Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数(K=K1/K2).抗原-抗体反应须满足以下条件:Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;所加入Ag*和Ab的量应是固定的;Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线)用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原;F代表游离的标记抗原;T代表总的标记抗原.B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag](三)抗原一抗体反应的特点1.特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力.交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合.2.可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.3.最适比例性抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.以沉淀免疫反应为例二,基本条件三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1.全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质.物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.抗原特异性(Antigenic Specifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.1.全抗原与半抗原全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.人工完全抗原:药物(半抗原) 本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.2.人工抗原的制备(1) 载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力,价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA), 兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)(2) 半抗原的选择药物本身必须具有合适的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=O等.(3)载体与半抗原的结合①碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键②混合酸酐法③戊二醛法④琥珀酸酐法⑤重氮化的对氨基苯甲酸法3.人工抗原的鉴定鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比光谱分析法化学分析法放射性同位素法(1)光谱分析法结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比.(2)化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别.反应出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.(3)放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例.4.标准抗原(Standard antigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据.蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否则会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体(Specific Antibody)特异抗体:(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反应,在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白.在免疫球蛋白中,免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.2.抗体的制备单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb): 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞,经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞.该瘤细胞通过体外培养,可大量复制,产生出特异的结构相同的均质抗体,此即单克隆抗体.多克隆抗体(Polyclonal Antibody)的制备是将抗原直接免疫动物而得到.抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类(1)免疫原的制备免疫原(Immunogen):人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质.水剂:抗原中加入一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原.福氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant):其制法是:取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合,高压灭菌,等体积地与一定浓度的抗原混合,按3 mg/ml的量加入卡介苗,研磨或于无菌注射器中对拉,使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.(2)免疫接种动物家兔不仅对抗原的免疫反应较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.羊,豚鼠微量免疫法的免疫抗原量在微克级内,常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10 mg左右,大量免疫法的免疫抗原量在50～100 mg.(3)抗血清的获得采血时应注意无菌操作,尽可能将血放人面积较大的无菌容器中,先室温凝固30min左右,再放人30℃温箱约2h使凝固,最后放入4℃冰箱过夜.次日吸取血清,将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎,在4000-10000 r/min离心20min,即得抗血清.大动物免疫羊部分采血家兔等小动物杀死动物一次性放血.3.抗体的鉴定(1)滴度(Titer)滴度又称效价或工作稀释度.滴度用免疫反应液中抗体(实指抗血清)的稀释度表示,稀释倍数越大,表示滴度越高.测定滴度可采用标记抗原法.RIA法测定抗血清的效价为例首先将抗血清用空白血清按比例稀释,然后精密吸取各稀释抗血清等量,分置若干支试管中,再于各试管中分别加入定量的放射性同位素标记药物(设放射性强度为T),温育.待反应达到平衡后,于反应液中加人分离剂(如沉淀剂),分离与抗体结合的标记药物(沉淀部分),测定各管中沉淀的放射性强度(B),并计算各管中标记药物的结合百分率(B/T%).当抗血清稀释度足够低时,其结合率趋于极值,该值称为"过量抗体结合率"(标记药物全被结合),如图中曲线的AB段,可用来衡量标记药物的质量.自AB段以后,随着抗血清稀释倍数增大,其标记药物的结合率逐渐降低,实际工作中多采用结合率为50%时(C点)的抗血清稀释度(D点).(2)活度(Avidity)活度:抗体与相应抗原的亲和力(Affinity).活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合能力.活度高,表明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小.抗体活度高低与免疫分析方法的灵敏度密切相关,它主要表现在剂量反应曲线的斜率上,斜率越陡,表明活度越高,测定效果越好.(3)特异性(Specificity)特异性:抗原和抗体的结合能力与其它结构相类似的干扰物的结合能力的比较.如果抗体与抗原的结合能力越强,而与其它类似结构的干扰物结合能力(称为交叉反应)越弱,则说明抗体的特异性越强.三,方法分类1.按标记物的种类分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)(2)酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)(3)化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CIZIA)(4)荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)荧光免疫分析法底物标记荧光免疫分析(Substrate labeled fluorescence immunoassay,SLFM)荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)荧光淬灭免疫分析(Fluorescent Quenching Immunoassay,FQM)荧光增强免疫分析(Fluorescent Enchancement Immunoassay,FEIA)时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)2.按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失,因此无需将反应液分作两相,即可在均相溶液中进行测定,故称为均相免疫分析.如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique,EMIT) .(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,只有在反应液中加入分离剂,将游离标记药物和结合标记药物分开之后,才能测出各自部分的标记药物浓度.否则,测定的是两者的总浓度.由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后,才能分别测定,故称为非均相免疫分析.如放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA)第二放射免疫分析放射性同位素标记抗原F与B的分离技术放射免疫测定仪标准曲线的制备与样品测定步骤方法评价应用举例放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA):利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术.特点:灵敏度高,特异性强,样品用量少,标记物容易制备以及放射性强度容易检测一,放射性同位素标记抗原在体内药物分析中,常采用放射性同位素.放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其它元素的不稳定同位素.放射性同位素在发生核衰变时,会发射出α-射线,β-射线及γ-射线.用相关仪器检测产生的射线,即可用于于定量分析.1.放射性强度放射性强度(严格说应为放射性活度):每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数(desintegration per-second,dps),其单位为贝可(Bq).1贝可相当于每秒1次核衰变,即lBq=1dps.1居里是指每秒钟放射性同位素发生3.7×1010次核衰变.2.放射性比度放射性比度或称比放射性或比活性:放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度. mci × g-1或mci×ml-13.放射性化学纯度(放化纯度)放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比.一般实验要求放化纯度大于90%.(二)标记抗原(Iabeled Antigen)标记抗原又称放射性标记药物,供标记的药物通常应是待测药物的纯品.标记抗原的纯度决定RIA的特异性,而标记抗原的放射性比度则决定RIA的灵敏度.因此,标记抗原是RIA测定技术中最关键的成分.1.对标记抗原的一般要求①有高的放射性比度;②标记后抗原仍具有原来的抗原性;标记物稳定性要好,不致因辐射引起化合物分解.2.标记放射性同位素的选择125I的特点是:①化学性质活泼,易于标记;②标记物在衰变中放出的γ-射线能量较高,易于测定;③标记物的放射线半衰期相对较短,须经常标记;④碘原子的半径较大,标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团,易使药物分子的抗原性受到影响.3H的特点是:①用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度;②标记后的药物的抗原性不会受到影响,因为氢原子的半径较小,且3H只是与药物分子的1H发生交换,不涉及化学元素的改变③ 3H的半衰期很长,可达12～16年;④ 3H发射出的β射线能量较低,须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度.(三)标记方法1.125I标记抗原的制备取代反应将其标记在药物或药物的衍生物上.用碘标记时一般采用氧化法,常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等,目前应用最多的是氯胺T.氧化法是指先用氧化剂将放射性碘离子(I-)氧化成游离的放射性碘分子(I2),然后再进行标记.大分子药物可直接采用放射性碘标记.小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸,组氨酸或含酚基的衍生物,然后再进行标记,使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代.2.3H标记抗原的制备H标记可分为定位标记和非定位标记两种方法.非定位标记通常采用气体曝射法,即将药物与氚(3H)气密封在一起,放置几天或几周,使3H与药物分子的1H发生交换定位标记采用特殊的合成路线,即先将3H引入药物分子结构中的指定位置,制成含有不饱和双键的标记药物前体,然后再对双键部位进行催化加氚.这种制备3H标记物的方法称为定位标记.二,F与B的分离技术游离的标记药物(F)和结合的标记药物(B)1,沉淀法2,吸附法3,固相法4,双抗体法(一)沉淀法用蛋白沉淀剂将抗体沉淀,从而可使与蛋白(抗体)相结合的药物也一起沉淀下来,而游离的药物由于未与蛋白结合,便留在于溶液中.常用的沉淀剂:硫酸铵,亚硫酸氢钠,乙醇,异丙醇.方法:在免疫反应达到平衡后的反应液中加入一定量的饱和硫酸铵溶液,使最终浓度为1.6-2.0mol/L (约40%-50%的饱和度),立即混匀,在4℃条件下反应20～30min后,离心,分离沉淀物,用40%的硫酸铵饱和溶液洗涤沉淀,然后测定放射性强度.优点:快速,简便,价廉.缺点:不能使F和B完全分离,沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附,因而空白值较高.(二)吸附法吸附法是利用固体吸附剂能在反应液中吸附游离抗原的原理而使F与B分离.常用的吸附剂:右旋糖酐包裹的活性炭(Dextron Coated Carbon,DCC),纤维素,硅酸盐等.原理:DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用,使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附,而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中.方法:当免疫反应达到平衡后,于反应液中加入DCC吸附剂,待吸附达平衡后,离心.离心后的结果正好与沉淀法相反,上清液中是与抗体相结合的标记药物(B),而沉淀中则是游离的标记药物(F).优点:快速,简便缺点:如药物一抗体结合物的离解常数较高时,测定结果不稳定.(三)固相法原理:通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体表面,待抗原与抗体形成结合物(B)后就附在固相物上,而游离的抗原(F)则仍留在反应液中,从而实行分离.该法实质上是一种固相免疫测定法(solid-phase immunoassay),其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂.常用的固相载体:葡聚糖凝胶,聚苯乙烯,纤维素,试管等.方法:采用试管固相法,即将抗体直接附着于试管底部的内壁上,测定时于试管中加入样品和试剂,当放射免疫反应达到平衡后,结合物就附在管壁上,游离抗原则留在液相中.通过离心或采用简单倾去法便可将两相分离.优点:简便,快速,实用.缺点:有时难以获得重复的结合率,其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物,导致结果误差增大.(四)双抗体法分离原理:药物(半抗原)与抗体结合后,虽然分子量增大,但还不足以生成沉淀而处于"溶解"状态,这种抗体通常被称为第一抗体,它可通过将抗原注入家兔,豚鼠等动物体内免疫获得.然后再将第一抗体作为新的抗原注入羊,马,牛等较大动物,则可免疫获得第二抗体(抗一抗体).当往第一抗体的反应液中加入第二抗体后,第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大,从而生成沉淀.离心后与抗体结合的标记药物(抗原-第一抗体-第二抗体结合物)处在沉淀中,而游离的标记抗原则留在上清液中.优点:分离效果好,适用范围广.缺点:抗体的制备有一定难度,且操作流程较长.三,放射免疫测定仪一类是γ计数器(γ-Counter),其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体,为提高其发光效率,还在晶体内加入有0.1%-0.5%的铊作为激活剂,该仪器适合测定125I,131I等同位素发射出的能量较高的β-射线.一类是液体闪烁测量仪(Liquid Scintillation Counter),由于该仪器放出的β射线能量低,射程短,不可能穿人和激发固态闪烁晶体,而只能在特定的闪烁液中进行,由β-射线激发液体闪烁剂而产生闪光现象.该仪器适合测定3H,14c等同位素发射出来的β-射线.(一)测量原理液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的β-射线能作用于闪烁液而发出荧光(闪光),该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变次数有关,通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量.1.溶剂作用:溶解闪烁剂和放射性样品;同时还起着吸收和转移β-射线能量的作用.条件:溶剂分子必须具有高度共轭的双键,只要受到能量低的β-射线的辐射,其π电子就能跃迁至激发态.一类是烷基苯类,甲苯,对-二甲苯,1,2,4-三甲苯等,主要适用于脂溶性药物的测定.另一类是醚类,1,4-二氧六环,适用于水溶性药物的测定.种类2.闪烁剂作用:接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量→激发态→基态→发射出闪烁的荧光(光子)→光电倍增管→光电转换测量系统记录.要求:性能稳定,闪烁效率(闪烁剂放出光子的能量)高,淬灭耐受性好,发光衰减时间短.常用的闪烁剂有:对联三苯(TP),2,5-二苯基恶唑(PPO),2-苯基-5-(4-联苯基)-1,3,4-恶-二唑(PBD)等.(二)仪器简介1.计数瓶计数瓶(或称闪烁杯):一个具盖的玻璃或塑料小瓶(10～20m1),用于盛装样品和闪烁液.当放射性药物分子与闪烁液接触时,溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂,闪烁剂将吸收的能量转变为光能(荧光),荧光透过计数瓶壁,进入光电倍增管.2.光电倍增管光电倍增管:光阴极,倍增极和阳极构成.进入光电倍增管的荧光(光子)通过光阴极表面的透明面板后,直接撞击光阴极,光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子,光电子经数个倍增极依次放大,使电子数剧增.这些电子最后被阳极收集,产生一个电压脉冲,并由记录器记录下来3.记录器用于记录单位时间内所产生的电压脉冲数,该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核衰变次数(闪烁次数).通常采用每分钟计数(counts per minate,cpm),作为放射性同位素药物的放射性强度.四,标准曲线的制备与样品测定步骤(一)标准曲线的绘制取标准抗原,用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度.加入定量标记抗原,其总放射性(T)应能满足准确测量的需要.加入定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求.将标准抗原,标记抗原,特异抗体与缓冲液混匀后,在适当条件下温育,待反应平衡后测定总计数率(T).加入分离剂,使结合部分(B)与游离部分(F)分离.测定各管结合部分或游离部分的计数率.标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标,以结合率(B%)为纵坐标作图.纵坐标B%的计算有两种方法:一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较,即B%=(B/T)×100%;另一种是用零标准管(不加药物标准品)的放射性强度B0代替T比较,即B%=(B/B0)×100%.(二)样品测定步骤下述情况样品需进行简单处理:测定方法不够灵敏,可将被测物适当浓集;测定方法不很专属,可将被测物与其它干扰物质分离;待测物以缀合物形式存在,可设法使其游离,然后进行测定.例:125I-RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl 空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下,迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内),摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率.五,方法评价灵敏度高,特异性强,取样量少,适用于大批量样品的测定.需用放射性同位素标记抗原,其放射性对操作人员的健康,对环境的污染都会造成危害,而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器,成本较高,因而使其普及受到限制. 六,应用示例固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛浓度的方法1.主要试剂2.测定方法3.结果计算(1)标准曲线法以地高辛标准品血清浓度为横坐标,B标/T(%)为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出标准曲线..以地高辛标准品血清浓度为横坐标,但用(B标-BNSB)/(B0-BNSB)(%)为纵坐标作标准曲线,当测得血清样品的(B样-BNSB)/(B0-BNSB)(%)值后,也可从标准曲线上得到对应的血清药浓(2)回归方程计算法以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度),以logitY为因变量进行直线回归第三酶免疫分析法酶标记抗原均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法评价应用示例酶免疫分析(Enzyme Immunoassay,EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法.酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法. 一,酶标记抗原(一)标记酶的选择特异性强,酶蛋白分子中应具有足够的活性基团,以便能与药物结合.活性要高,即当底物浓度低时,确有较高的催化反应率.酶的活性不易受样品中其它成分影响,有较好的稳定性.酶的纯度要高,且生物体液中应无标记酶,底物,抑制剂及其它干扰物质存在.酶的活性测量方法应简单,灵敏,精密和快速.酶的来源,纯化,供应等应方便,价廉.最常用的标记酶1.辣根过氧化物酶(HRP):约有50%的EIA使用此酶.2.碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定,其活性可用分光光度计或荧光计测量.3.6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA.4.β-半乳糖苷酶(β-Gal): 适用于均相EIA和非均相EIA.5.苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA.(二)底物的选择①无色,无毒能溶水;②化学性质稳定,不受光照的影响;③转化率高,在酶催化下可产生大量的有色物质;④显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比;⑤应有终止酶反应的试剂.常用酶的底物1,辣根过氧化物酶的底物:邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA),四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB/TMBS)2,碱性磷酸酶底物:对硝基酚磷酸盐溶液(p-NPP),4-甲基伞酮基-磷酸盐(4-MUP)3,β-D-半乳糖苷酶底物:邻硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷(o-NPG),氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷(CPRG),试卤灵-β-D-半乳糖吡喃苷(RG)4,葡萄糖氧化酶底物:与辣根过氧化物酶底物相同(三):酶标记药物的制备酶标药物的酶活性和免疫活性决定了酶免疫测定法的灵敏度,因此酶标药物成为EIA的。