免疫分析法

免疫分析法

1,熟悉免疫分析法的基础知识

,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法

第一:概述

基本原理

基本条件

方法分类

免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法.

1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).

酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.

一,基本原理

(一)竞争抑制原理

实质都是抗原一抗体竞争结合反应

Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原

Ab:特异抗体

Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物

K:平衡常数(K=K1/K2).

抗原-抗体反应须满足以下条件:

Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;

所加入Ag*和Ab的量应是固定的;

Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;

Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中.

这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础

(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线)

用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.

B代表结合的标记抗原;

F代表游离的标记抗原;

T代表总的标记抗原.

B/F-[Ag]

B/(B+F)×100%-[Ag]

(三)抗原一抗体反应的特点

1.特异性

一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.

抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.

抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力.

交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合.

2.可逆性

抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.

是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.

3.最适比例性

抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.

以沉淀免疫反应为例

二,基本条件

三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体

(一)抗原及其制备

1.全抗原与半抗原

抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质.

物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.

免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.

抗原特异性(Antigenic Specifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.

1.全抗原与半抗原

全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.

半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.

人工完全抗原:药物(半抗原) 本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.

2.人工抗原的制备

(1) 载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力,价廉易得

载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.

牛血清白蛋白(BSA), 兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)

(2) 半抗原的选择

药物本身必须具有合适的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=O等.

(3)载体与半抗原的结合

①碳二亚胺法

利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键

②混合酸酐法

③戊二醛法

④琥珀酸酐法

⑤重氮化的对氨基苯甲酸法

3.人工抗原的鉴定

鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比

光谱分析法

化学分析法

放射性同位素法

(1)光谱分析法

结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比.

(2)化学分析法

利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别.反应出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.

(3)放射性同位素标记法

在制备人工抗原时,在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例.

4.标准抗原(Standard antigen)

标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据.

蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否则会使样品的测定结果偏高.

(二)特异抗体的制备及鉴定

1.特异抗体(Specific Antibody)

特异抗体:(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反应,在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白.

在免疫球蛋白中,免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.

2.抗体的制备

单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb): 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞,经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞.该瘤细胞通过体外培养,可大量复制,产生出特异的结构相同的均质抗体,此即单克隆抗体.

多克隆抗体(Polyclonal Antibody)的制备是将抗原直接免疫动物而得到.

抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类

(1)免疫原的制备

免疫原(Immunogen):

人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质.

水剂:抗原中加入一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原.

福氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant):其制法是:取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合,高压灭菌,等体积地与一定浓度的抗原混合,按3 mg/ml的量加入卡介苗,研磨或于无菌注射器中对拉,使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.

福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.

(2)免疫接种动物

家兔不仅对抗原的免疫反应较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.

羊,豚鼠

微量免疫法的免疫抗原量在微克级内,常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10 mg左右,大量免疫法的免疫抗原量在50～100 mg.

(3)抗血清的获得

采血时应注意无菌操作,尽可能将血放人面积较大的无菌容器中,先室温凝固30min左右,再放人30℃温箱约2h使凝固,最后放入4℃冰箱过夜.次日吸取血清,将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎,在4000-10000 r/min离心20min,即得抗血清.

大动物免疫羊部分采血

家兔等小动物杀死动物一次性放血.

3.抗体的鉴定

(1)滴度(Titer)