激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光扫描共聚焦显微镜技术在生物学中的应用
激光扫描共聚焦显微镜技术在生物学中的应用生物学是研究生命存在、发展规律和生命活动的科学。
在传统的生物学研究中，显微镜是不可或缺的工具。
然而，传统的显微镜技术受到分辨率和探测灵敏度等限制，难以观察到生物体内微小结构的细节，而激光扫描共聚焦显微镜技术则克服了传统显微镜的诸多局限，成为生物学研究领域中一种重要的高分辨率成像技术。
一、激光扫描共聚焦显微镜技术的原理激光扫描共聚焦显微镜技术（LSCM）在20世纪的80年代初由著名物理学家弗里茨·斯特鲁斯曼发明。
它是一种基于激光打激光扫描光束来扫描物体表面的成像技术。
和传统显微镜成像技术不同的是，LSCM的光源是激光器，通过激光束聚焦于少于1微米的空间范围内。
然后，激光束扫描样品表面，强制荧光物质发射荧光，荧光信号由探测器接收。
探测器会接收到被物体反射出的荧光，并产生电信号，将这些信号以频率多路复用形式送入相应通道中。
此后，扫描激光束移动至下一个位置，重复上述过程并记录。
整个过程可以将照片连续拍摄，创建三维图像。
二、 1. 细胞内环境成像激光扫描共聚焦显微镜技术在细胞内环境成像领域应用广泛。
激光扫描共聚焦显微镜技术可以穿透多个细胞层进行观察，而成像效果还能保持在细胞内的三维结构。
通过LSCM成像，可以查看细胞和细胞器的形态，了解细胞内部活动的触发机制，揭示细胞内部储量物质和分子的特征。
例如，LSCM被广泛应用于分子生物学和免疫学研究中，以观察分子间的交互以及细胞内蛋白质的定位。
2. 功能性神经元成像LSCM技术也被广泛应用于观察和研究神经元的活动。
通过LSCM技术可以实时地观察神经元的活动情况，并且能够在极短的时间范围内捕捉神经元间复杂的联系。
由于神经元在体内不断的活动，这需要实时的成像技术，LSCM正好能满足这样的需求。
3. 病原体与宿主细胞相互作用分析病原体与宿主细胞的相互作用是研究感染病患的关键问题。
通过LSCM技术，可以更深入的了解病原体与宿主细胞之间的相互作用过程，包括侵染、排异、生存和繁殖等方面。
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理介绍激光扫描共聚焦荧光显微镜（Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy，LS-CFM）是一种先进的显微镜技术，用于获取高分辨率的细胞和组织图像。
它基于激光光源和共聚焦原理，通过激发标记的荧光物质来提高显微镜的分辨率和对比度。
本文将详细介绍LS-CFM的原理和应用。
激光扫描共聚焦显微镜的工作原理激光光源LS-CFM使用激光光源作为激发荧光物质的光源。
激光光源具有高强度、单色性和方向性，可以提高显微镜的灵敏度和分辨率。
扫描系统LS-CFM的扫描系统包括镜片、扫描镜和探测器。
激光光束经过镜片聚焦到样本上，扫描镜通过改变反射角度来扫描样本表面，探测器记录荧光信号。
共聚焦原理共聚焦原理是LS-CFM的核心原理，它通过控制扫描镜的运动和探测器的观察位置，只获取样本特定平面（焦平面）的荧光信号。
由于样品处于共焦面上时探测荧光的最大值，可以得到高分辨率图像。
荧光物质激发和发射过程在LS-CFM中，荧光物质被激光光源激发后会发射荧光。
荧光物质的发射波长通常比激发波长长。
激发光和发射光通过不同的光路，以避免激发光干扰荧光信号。
LS-CFM的优势1.高分辨率：共聚焦原理使LS-CFM能够获取超过传统荧光显微镜的分辨率，可以观察更细微的结构和细胞器。
2.高对比度：由于共焦面上只有样品发出的荧光被探测到，背景信号减少，对比度更高。
3.深度扫描能力：LS-CFM具有深度扫描能力，可以获取样本的三维图像。
这对于观察细胞内部结构和复杂的生物组织是非常重要的。
4.实时观察：LS-CFM可以实时地观察样本，能够捕捉到细胞和组织的动态变化。
5.多光标标记：通过使用不同的荧光标记剂，LS-CFM可以同时观察多个分子或细胞器的位置和相互作用。
LS-CFM的应用生物医学研究LS-CFM在生物医学研究中扮演着重要的角色。
它可以用于观测细胞分裂、细胞迁移、细胞凋亡以及细胞器的分布和运动。
共聚焦激光显微镜原理
共聚焦激光显微镜原理共聚焦激光显微镜是一种高分辨率的显微技术，它利用激光光束对样品进行扫描，通过聚焦和探测来获取高分辨率的图像。
下面将详细介绍共聚焦激光显微镜的原理。
1. 激光扫描共聚焦激光显微镜使用一个激光束对样品进行扫描。
这个激光束可以是单色或多色的，并且可以调节其波长和功率。
在扫描过程中，激光束会被反射、散射或吸收，从而产生不同的信号。
2. 共聚焦共聚焦是指将激光束聚焦到一个非常小的点上，通常在几百纳米以下。
这个点称为焦点，在这个点上产生了强烈的电磁场，可以使样品中的荧光物质发出荧光信号。
同时，在这个点周围也会有一定程度的荧光信号。
3. 探测探测是指检测样品中发出的荧光信号，并将其转换成电子信号。
探测器通常使用光电倍增管或者CCD相机，可以捕捉到非常微弱的荧光信号。
4. 三维成像共聚焦激光显微镜可以进行三维成像。
通过改变激光束的焦距，可以在样品中扫描不同深度的区域。
这样就可以获得样品的三维结构信息。
5. 高分辨率共聚焦激光显微镜具有非常高的分辨率。
由于激光束被聚焦到一个非常小的点上，因此可以获得非常高的空间分辨率。
同时，由于只有在焦点处才会产生荧光信号，因此也可以获得非常高的时间分辨率。
6. 应用共聚焦激光显微镜广泛应用于生物医学研究领域。
它可以用于观察细胞、组织和器官中的结构和功能，并且还可以用于研究生物大分子如蛋白质、核酸等的结构和功能。
总之，共聚焦激光显微镜是一种高分辨率、非侵入性、三维成像技术，在生物医学研究领域具有广泛的应用前景。
激光共聚焦显微镜分析技术
狭分缝光谱扫描
光谱扫描带宽 精度 2 纳米
滤光片系统 OTE
灵敏度较光谱式差
光学能量转移效率
94%
98% 88.5% 86.7% 90.3% 88.5% 100%
光谱式探头
棱镜分光,狭缝扫描,全无滤片
• 第一优势:提高灵敏度 • 光谱式与滤光片比较： 88% 对 61% • 为了达到相同样品质量 (相同探测发射 能量), 较低OTE 的仪器需要较高激光能 量作为激发以致更大机会做成样品漂白 ，干 扰 PSF, 因此降低图象质量
• Seamless recording of full spectrum
• Up to 4 PMT´s with individual gain adjustments to compensate for emission properties of stains
(PMT=Photomultiplier tube)
激光光源扫描器内装有针孔光栏分光镜发射荧光单色器及检测器荧光显微镜装有微米步进马达系统光学装置计算机图像存储与处理及控制系统
激光共聚焦显微镜技术 第2章
激光扫描共聚焦显微镜的基本结构、 工作原理及基本功能
一 、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构和工作 原理 激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集 和分析的大型精密仪器。其主要由以下几部分组 成:激光光源、扫描器（内装有针孔光栏、分光 镜、发射荧光单色器及检测器)荧光显微镜（装 有微米步进马达）系统、光学装置、计算机图像 存储与处理及控制系统。
Emission Filter Emission Pinhole
Principle of a standard Confocal
Detector
Barrier Filter Fixed characteristics Pinholes
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座 ppt课件
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜吴旭2008.10.14高级显微镜原理正置、倒置显微镜细胞遗传工作站活细胞工作站激光显微分离系统激光共聚焦显微镜概述激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……Conventional fluorescence microscope Confocal microscope历史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987Zeiss 、Leica 、Meridian 、OlympusZeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜基本原理相差、DIC 常用荧光标记共聚焦原理Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope.D. Phase-contrast or adifferential-interference-contrast microscopeFour types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.常用荧光探针Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles荧光显微镜原理明场：透射荧光：落射落射的优点：物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。
激光共聚焦扫描显微镜技术
激光共聚焦扫描显微镜技术一、简介激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。
在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。
目前，激光共聚焦显微镜（LSCM）技术已广泛应用于生物医学领域。
本文对LSCM的应用原理、较普通光镜的优点及生物学应用做简单介绍。
激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。
在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。
二、 L SCM的主要组成部分及工作原理：illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
beamsplitter:光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Objective:物镜Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
detector pinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。
最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书操作说明书激光扫描共聚焦显微镜是一种高端的显微镜设备，具有高分辨率、高灵敏度的特点，广泛用于生物学、医学、材料科学等领域。
为了正确且有效地操作激光扫描共聚焦显微镜，本操作说明书将为您提供详细的指导。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜由以下主要部分组成：1. 显微镜主体：负责接收样本的光信号，并进行扫描成像。
2. 激光系统：提供高能量、高稳定性的激光光源，用于激发样本的荧光信号。
3. 探测系统：用于接收样本的荧光信号，并将其转化为图像信号。
4. 控制系统：提供对显微镜参数进行调节和设置的功能。
二、注意事项在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请确保您已熟悉以下注意事项：1. 安全操作：激光光源具有较强的激光辐射，请佩戴适当的激光防护眼镜并避免直接暴露于激光光束下。
2. 样本准备：样本应事先处理好并放置在适当的载玻片上，确保样本表面平整，避免气泡或杂质的干扰。
3. 导入样本：轻轻将载玻片插入显微镜主体的样本台中，并用调节旋钮精确定位样本。
4. 参数设置：根据实验需要，设置合适的激光功率、放大倍数和扫描速度等参数，确保获得清晰的图像。
5. 镜头清洁：定期清洁显微镜镜片，避免灰尘或污渍影响成像质量。
注意使用专用的镜头清洁纸和清洁液。
三、操作步骤基于激光扫描共聚焦显微镜的特点，以下为一般操作步骤的指导：1. 打开设备电源，等待设备启动并进行自检。
2. 调节放大倍数：通过显微镜主体上的放大调节旋钮，调节适当的放大倍数，以便观察到合适大小的图像。
3. 确定激光功率：在控制系统中，设置合适的激光功率以激发样本的荧光信号，避免过高的功率导致样本损伤。
4. 调整扫描速度：通过控制系统中的扫描速度调节器，设置合适的扫描速度，以获得清晰且稳定的图像。
5. 对焦样本：使用显微镜主体上的对焦调节旋钮，将样本调焦至最清晰状态。
6. 开始扫描：通过控制系统中的扫描启动按钮，启动扫描功能，并观察图像显示区域是否居中和清晰。
激光共聚焦显微镜分析技术
激光共聚焦显微镜分析技术激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）是一种高分辨率的荧光显微镜技术，可以在细胞和组织水平上观察和研究样本的三维结构和功能。
其原理是利用激光束经过一组物镜后，聚焦于样本的一个点上，再通过探测器收集经过样本的反射或荧光信号，然后通过扫描样本的X、Y和Z轴移动，以获取图像的二维和三维信息。
1.高分辨率：激光共聚焦显微镜使用激光束的聚焦原理，可以获得比传统显微镜更高的分辨率。
它可以减少标记物质的模糊和混叠现象，提供更清晰、更详细的图像。
2.3D成像能力：激光共聚焦显微镜可以获取堆叠图像，从而构建三维结构。
通过扫描样本的Z轴，可以获得不同深度的切片图像，再通过软件进行堆叠和重建，得到三维结构信息。
3.实时观察：激光共聚焦显微镜可以实时观察和记录样本的变化过程。
通过快速的扫描速度和高灵敏度的探测器，可以实现对细胞和组织的实时观察，并捕捉瞬间变化的图像。
4.荧光标记：激光共聚焦显微镜可以应用于荧光标记技术，通过使用特定的荧光染料或标记抗体，可以观察和定位特定蛋白质、细胞器和细胞分子的位置和表达水平。
激光共聚焦显微镜分析技术广泛应用于细胞生物学、生物医学研究、药物发现、神经科学等领域。
它可以提供高分辨率的图像和三维结构信息，帮助研究人员深入理解生物学过程和细胞功能。
以下是几个应用激光共聚焦显微镜的案例：1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以观察和分析细胞和组织的形态、结构和功能。
它可以用于观察细胞分裂、细胞移动、细胞器的定位和交互作用等细胞过程的研究。
2.荧光探针研究：激光共聚焦显微镜可以与特定的荧光染料或标记抗体结合使用，用于研究特定蛋白质或细胞分子的位置和表达水平。
通过荧光标记技术，可以观察和定位蛋白质在细胞内的位置和亚细胞结构。
3.三维结构重建：激光共聚焦显微镜可以通过扫描样本的Z轴，获得不同深度的切片图像，并通过软件进行三维堆叠和重建。
激光共聚焦显微镜成像原理及注意事项.
激光共聚焦显微镜成像原理及注意事项.激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率显微镜技术，能够在活体细胞和组织中实现光学切片成像。
其独特的成像原理使得它在生命科学研究中应用广泛，特别是对于三维结构的观察和表征。
本文将详细介绍激光共聚焦显微镜的成像原理及注意事项。
一、成像原理：激光共聚焦显微镜的成像原理基于共焦成像原理和激光扫描技术。
共焦成像原理是基于单一点扫描获得图像的原理，通过共焦点扫描光束与样品进行相互作用，并采集反射或荧光信号来生成图像。
激光扫描技术则是利用一个高速可移动的信号光束进行扫描，从而实现样品的成像。
具体来说，激光共聚焦显微镜的成像过程包括以下几个步骤：1. 激光束光路调节：将激光束从激光器引导到显微镜系统中。
这一步骤包括调节激光束的聚焦和对准光轴等操作。
2. 共焦原理叠加：在显微镜中，使用物镜透镜通过激光束得到一个具有良好成像性能的小孔径光斑，形成共焦光谱。
该光谱是适应共焦成像原理的基础工具。
3. 采集信号：通过光学扫描技术，将光谱移动到样品上，并定位到感兴趣区域。
当激光束与样品相互作用时，会发生反射或荧光的发射。
相应的反射或荧光信号通过探测器进行信号采集。
4. 图像生成：通过对采集到的反射或荧光信号进行数字化和处理，可以生成高分辨率的图像。
通过调节扫描参数，如扫描速度、激光功率和探测器灵敏度等，可以获得所需的图像质量。
二、注意事项：使用激光共聚焦显微镜进行成像时，需要注意以下几点：1. 样品的准备：样品的准备对于获得高质量的成像结果至关重要。
样品准备过程中需要避免损伤和变形，同时保持样品的生理状态和活性。
2. 激光功率的控制：激光束的强度对样品的损伤和成像结果具有重要影响。
因此，需要控制激光功率，避免过高的激光功率对样品造成伤害。
3. 扫描速度的选择：扫描速度过快可能导致图像模糊和细节丢失，扫描速度过慢则会增加成像时间。
激光扫描共聚焦显微镜
扫描速度慢
相对于传统的显微镜， 激光扫描共聚焦显微镜 的扫描速度较慢，需要 更长的时间来获取图像。
荧光衰减
荧光染料在长时间的光 照下会逐渐衰减，影响 图像的质量。
改进方向
降低成本
通过改进技术和降低制造成本，使更多 的实验室和研究机构能够使用激光扫描
共聚焦显微镜。
发展多色成像技术
利用多色荧光染料或光谱分离技术实 现多色成像，以便同时观察多个标记
物或细胞成分。
提高扫描速度
研究更快的扫描技术和算法，提高图 像的获取速度。
增强自动化和智能化
开发自动化和智能化的操作系统，减 少人工干预和操作时间，提高实验效 率。
05 激光扫描共聚焦显微镜与 其他显微镜的比较
传统显微镜
光源
传统显微镜使用普通光源，如灯泡或反射镜，提供均匀照明。
分辨率
受限于光的衍射极限，传统显微镜的分辨率相Байду номын сангаас较低。
其他现代显微技术
原子力显微镜（AFM）
01
利用原子间相互作用力进行成像，适用于表面形貌和物理性质
的测量。
扫描隧道显微镜（STM）
02
利用量子隧穿效应进行成像，适用于表面电子结构的测量。
光学 tweezers 技术
03
利用光束操纵微小粒子，实现细胞和分子水平的操控和观察。
06 激光扫描共聚焦显微镜的 未来发展与展望
激光扫描共聚焦显微镜
目录
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜技术原理 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜优缺点 • 激光扫描共聚焦显微镜与其他显微镜的比
较 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与展望
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激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
暗视野显微镜根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜观察到明场看不到的极其微小的物体最高分辨率可达0.004微米1 原理丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒的散射光。
暗视野显微镜就是利用微粒的散射光原理设计的。
2 结构特点使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。
不能由下而上地通过标本进入物镜。
从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。
暗场显微镜原理3成像特点在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。
但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。
一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um 以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um 所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。
4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。
5 暗场显微镜的要求要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘物镜前透镜必须清洁无尘载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求6暗场观察方式调节(1换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。
向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。
(2将视场光阑适当缩小，用10X 物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。
上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。
(3视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。
人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色的透明物体。
光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜色的变化，而只产生所谓的相位差。
可是这种相位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。
相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。
相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。
因此可用以观察活细胞或未染色标本。
环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。
在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。
用于观察组织培养中活细胞形态结构。
活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。
偏光显微镜依据波动光学原理观察和精密测定标本细节, 或透明物体改变光束的物理参数, 以此判别物质结构的一种显微镜分辨率可达0.04微米将普通光改变为偏振光进行镜检, 以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性或双折射性(各向异性偏振光与自然光1. 横波的偏振性光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内, 可有不同的振动方向。
2. 线偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振动。
二、起偏和检偏起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。
检偏：检查入射光的偏振性的过程。
双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。
尼科耳棱镜。
在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。
寻常光线(o光:遵守折射定律。
对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。
非常光线(e光:不遵守折射定律。
它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播。
o 光和e 光都是线偏振光, 且振动方向相互垂直二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。
如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。
旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度的现象，称为旋光现象。
这种介质称为旋光物质。
如石英、糖、酒石酸钾钠等。
微分干涉显微镜无色透明活体标本的细微结构图象呈浮雕状的立体感观察效果更加逼真1 原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。
2 特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。
荧光显微镜 Fluorescence microscope特点：光源为短波光，信噪比高荧光显微镜一、原理荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等的基础上组成的。
荧光显微镜Fluorescence microscope特点：光源为短波光，信噪比高荧光光源一般采用超高压汞灯(50一200W ，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。
每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。
荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。
它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。
二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
两种滤光片必须选择配合使用。
荧光显微镜用途1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。
组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A 呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。
3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA 综合，进行细胞内DNA 含量测定。
4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。
用于观察能激发出荧光的结构。
用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
缺点分辨力不高激光共焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM ）LSCM 的基本结构、工作原理荧光探针的选择原则LSCM 在生物医学领域中的应用激光共聚焦扫描显微镜简介80年代研发的新型显微镜以荧光显微镜成象原理为基础采用激光扫描装置，利用计算机生成图象得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察细胞，还能显示诸如Ca 2+、pH 值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
发展史1、20世纪50年代中期提出。
Marvin Minsky在哈佛大学博士后工作期间，提出了共聚焦显微镜的基本概念，并于1957年申请了技术专利。
Minsky 的发明并没有马上引起人们的注意，主要原因是没有足够强度的光源，并且当时计算机的能力还不足以处理大量的数据。
2、90年代发展成熟。
随着光学和电子技术的发展产生了更稳定和更强的激光、更高效的扫描镜片组、高效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪音的检测器。
更多适合激光激发的荧光染料不断被合成。
相应的计算机处理器速度快速发展，图像显示技术增强和大容量的存储设备的产生，推动了激光扫描共聚焦显微镜迅速普及。
2006年购入OLYMPUSFV1000，耗资18.7万美元。
激光扫描共聚焦显微镜结构和工作原理目标要求1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜技术的工作原理。
2. 熟悉激光扫描共聚焦显微镜的结构。