四个不结球白菜自交不亲和S单元型分子鉴定

四个不结球白菜自交不亲和S单元型分子鉴定

作者：李霞，胡侦华，周国林，等

来源：《湖北农业科学》 2015年第16期

李霞，胡侦华，周国林，汪爱华

（武汉市蔬菜科学研究所武汉蔬菜展示中心，４３６４００）

摘要：利用已报道的ＳＲＫ及ＳＬＧ基因序列保守区设计的特异性引物，通过ＰＣＲ扩增和克隆测序，结合生物信息学分析方法对４份国外引进的不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ）自交不亲和材料的Ｓ单元型进行分子鉴定。结果表明，不亲和材料Ａ１包含的Ｓ位点基因序列与甘蓝（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａＬ．）ＳＬＧ－３１的相似度为９８％（Ｅ值是０）；不亲和材料Ａ２、Ａ３包含ＣｌａｓｓＩ类及ＣｌａｓｓⅡ类２种Ｓ单元型，Ｓ位点处于杂合

状态。不亲和材料Ａ４包含的Ｓ位点基因序列与青花菜（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａＰｌｅｎｃｋ）单倍型ＢＯＩ１ＳＲＫ蛋白基因具有９８％的序列相

似度，序列覆盖度达９９％。

关键词：不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ）；自交不亲和；Ｓ单元型；分子鉴定

中图分类号：Ｓ６３４．３；Ｑ３２１＋．７；Ｑ５０３

文献标识码：Ａ

文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１６－３９４８－０４

ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１

５．１６．０３０

收稿日期：２０１４－１２－１６

基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系项目（ＣＡＲＳ－２５－３０）；武汉市规模设施

蔬菜关键技术集成与示范项目（２０１３０２１７０２０１１０５８４）

作者简介：李霞（１９８１－），女，河南获嘉人，博士，研究方向为小白菜分子育种，（电话）１３２９７０１０３１７（电子信箱）ｌｉｘｉａ＿ｎａｐｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；

通信作者，

汪爱华，女，高级农艺师，博士，从事蔬菜育种学与生物技术研究，（电子信箱）ｗａｎ

ｇａｉｈｕａｌｔ＠１６３．ｃｏｍ。

白菜（ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ．）属十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒ

ａｅ）芸薹属（ＢｒａｓｓｉｃａＬ．），原产于中国，栽培历史悠久。其规模无论是面积还是产量，在蔬菜作物中均居首位。不结球白菜，又称小白菜（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ．ｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ），主要分布在长江流域的中、下游地区，其播种面积约占该地区蔬菜总面积的1/3。白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势显著，利用

自交不亲和（Ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）系制种是目前最常用的白菜杂交

制种技术之一，其主要靠不同单倍型自交不亲和系之间互配来获得，因此对于育种工作者来说，获得自交不亲和系单倍型的快速准确鉴定至关重要。目前普遍采用花期交互授粉的方法进行鉴定，其操作过程繁杂、效率低、准确度不高［１］。快速、准确的鉴定白菜自交不亲和性以及

所携带的Ｓ单元型（在遗传上由具有复等位基因的多态性Ｓ位点基因控制的单元类型），不仅

可以加速自交亲和系和自交不亲和系的选育进程，而且可以做到有针对性地配制杂交组合、提

高育种效率、避免杂交不结实现象发生。

自交不亲和现象是植物在长期进化过程中促进异花授粉、保证物种生存、延续的生殖特性。根据遗传控制不同，显花植物的自交不亲和特性大致可分成配子体自交不亲和（Ｇａｍｅｔｏ

ｐｈｙｔｉｃｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ＧＳＩ）与孢子体自交不亲和（Ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃｓｅｌｆ-ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ＳＳＩ）２种类型［２］。配子体自交不亲和是植物界最普遍的一种自交不亲和类型，而孢子体自交不亲和仅存

在于十字花科、石竹科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）等植物中。芸薹属是十字花科孢子体控制型的典型代表，研究表明，芸薹属植物自交不亲和性

受单位点（Ｓ－ｌｏｃｕｓ）复等位基因（Ｓ１，Ｓ２，……，Ｓｎ）的控制，在白菜自交不

亲和研究中已鉴定出１００多种Ｓ单元型［３，４］。目前，自交不亲和机理研究认为，自交不亲和现象的发生是花粉与柱头乳突细胞间的自我识别引起的，其识别过程主要体现为Ｓ单倍

型特异性的受体－配体识别机制，参与这一识别过程的蛋白主要包括：Ｓ位点糖蛋白基因（Ｓ

ｌｏｃｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ，ＳＬＧ基因）、Ｓ位点受体激酶基因（Ｓ

ｌｏｃｕｓｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ，ＳＲＫ基因）、花粉蛋白外壳基因（Ｓｌｏｃｕｓｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ，ＳＣＲ基因）。

其中ＳＬＧ和ＳＲＫ为柱头表达蛋白基因，ＳＣＲ为花粉壁中存在的特异因子基因，３个紧密

连锁的基因参与了花粉和柱头间的相互识别［５－７］。随着分子生物学技术的不断发展及芸

薹属植物自交不亲和性的深入研究，若干Ｓ单元型ＳＬＧ、ＳＲＫ和ＳＣＲ基因序列也已确定。随着ＤＮＡ测序技术的飞速发展，通过生物信息学分析，白菜自交不亲和Ｓ单元型分子水平的

快速鉴定也已成为可能。

试验利用已公布的ＳＲＫ、ＳＬＧ基因特异引物的ＰＣＲ扩增、克隆测序及生物信息学分

析等技术，对４份引进的小白菜自交不亲和材料Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４的Ｓ单元型进行分子

鉴定，以期为小白菜杂交组合的授粉配制提供参考依据。

１材料与方法

１．１材料

参试的不结球白菜自交不亲和材料Ａ１，Ａ２，Ａ３及Ａ４都从国外引进，由武汉市蔬菜

科学研究所提供。离心柱型ＰＣＲ产物回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，ｐＭＤ１

８－Ｔ载体购于宝生物工程（大连）有限公司。

１．２方法

１．２．１ＤＮＡ的提取选取各材料的幼嫩叶片，利用改良的ＣＴＡＢ小样法提取４

份试验材料的基因组ＤＮＡ，置于－２０℃环境保存备用。

１．２．２引物设计利用已报道的特异性引物ＰＳ５和ＰＳ１５，该引物是由Ｎｉｓ

ｈｉｏ等［８］设计的用于扩增ＣｌａｓｓⅠ类（Ｓ单元型在花粉中表现为显性）ＳＬＧ的引物，特异引物Ｐ３和Ｐ４是张爱芬［９］设计用于扩增ＣｌａｓｓⅡ类（Ｓ单元型在花粉中表