环境工程微生物学实验八 细菌纯种分离、培养和接种技术
细菌的分离纯化和接种实验
环工综合实验细菌的分离纯化和接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：1.为什么湖水用10－4、10－5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低的浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。
2.为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察；第三，防止培养基干涸。
3.微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面？答：⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射接种，活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理，接种过程必须在煤气灯旁进行，接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置，操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触，往培养基是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤1.制备细菌稀释液：使用5ml移液管加4.5ml无菌水放入贴有10-3、10-4、10-5、10-6标签的小试管中，用一根1ml的无菌移液管吸取10-2的湖水稀释液0.5ml放入贴有10-3标签的小试六、思考题1.氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans,T.f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水（pH<4）中最为常见。
其化能自养，专性好氧，嗜酸，革兰氏阴性，，主要利用利用CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。
请思考其分离纯化的方法和步骤。
答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液，在实验室用9K或Leathen 培养基反复分离纯化。
实验8微生物无菌接种、分离和纯化
接种工具、管、瓶口接种前后要通过灼烧灭菌 塞子丌能脱手
实验原理
于接种之前打开 接种室和超净工
作台紫外灯消毒
30min，同时打 开风机 接种时必须关闭 紫外灯
无菌接种技术的基本操作 转接斜面 （斜面接种）
演示：斜面转接
1、标记
2、左手持斜面
3、灼烧接种环
5、冷却，取菌转接 6、重烧管口，盖塞 4、取塞，灼烧管口 7、重烧接种环
微生物的分离纯化技术
分离：从混杂的群体中把各种微生物分开 纯化：进一步分离，得到纯培养物
菌落纯：由一个或几个相同种细胞所得到的群体
形态、结构、生物学特性基本相同的群体
研究一般特性 菌株纯：由一个细胞繁殖得到的后代（纯培养） 应用研究、生产
微生物的分离
常用菌种分离方法——固体平板分离
3、结果：划线及涂布分离的效果 4、分析讨论 操作过程及结果中遇到的问题，解决方法
思考题 微生物接种时，采取哪些措施来防止杂菌污染？
下一次预习 实验9和10
实验内容：细菌生理生化反应试验和pH对 大肠杆菌生长的影响
实验八
微生物无菌接种、分离和纯化技术
实验目的
学习和掌握微生物无菌接种技术
学习和掌握超净工作台的使用方法 学习和掌握涂布分离和划线分离等微生物分离纯化 技术
实验原理
微生物无菌接种技术
在无菌条件下，用接种工具从原菌种中挑取少许菌体，接入到 新培养基上扩大培养的技术
常用接种工具
接种环：划线、斜面转接、液体培养基
接种针：固体穿刺培养 接种勾：多用于丝状微生物转接 接种铲：多用于丝状微生物转接 无菌移液管： 液体培养基间的接种
环境工程微生物学操作实验报告 范例
培养基的配制和灭菌细菌的纯种分离、培养接种技术及菌落形态的观察姓名：***学号：************ 课程名称：环境工程微生物实验一、实验目的1、熟悉玻璃器皿的洗涤与灭菌前的准备工作。
2、了解微生物培养基的基本原理，掌握配制、分装培养基的方法。
3、学习各类物品的包装、配制、灭菌技术。
4、从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用微生物和纯化微生物的方法。
5、学会几种接种技术。
6、平板菌落计数。
7、抗Cu菌的筛选。
8、观察实验分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落的形态特征。
9、通过观察和比较细菌，放线菌，酵母菌及霉菌的菌落形态，达到初步鉴别微生物的能力。
二、实验原理1、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，有碳、氢‘氧、氮、磷、硫、钾、钙、钠、镁、铁、等微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。
调整适合的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。
由于微生物的种类及代谢类型的多样性，因而培养基放入种类也多，他们的配方及配制法也有所差异，但一般的配置过程大致相同。
本实验采用肉汤蛋白胨培养基、查氏培养基（筛选霉菌）、高氏1号淀粉琼脂培养基（筛选放线菌）。
2、灭菌原理:本次实验中培养基、移液枪头等采取加压蒸汽灭菌法。
加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。
培养皿等玻璃器皿用具采用干热灭菌法，另外还有膜过滤灭菌法。
接种时对接种针等采用灼烧灭菌。
3、分离纯化原理：本实验使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。
此法加样量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，现正置一段时间等水分蒸发后倒置。
平板划线法也可以分离从而获得单一菌落以观察其形态特征。
4、微生物的接种原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。
本次实验采取斜面接种法、穿刺接种法，使用到的接种工具是接种环，接种针。
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
微生物的接种分离纯化与培养方法
微生物的培养方法实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。
一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图1）图1 接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
细菌的分离纯化和接种实验
细菌的分离纯化和接种实验引言细菌的分离纯化和接种实验是微生物学研究中常用的实验方法之一。
通过这个实验，我们可以将混合细菌群体中的某种特定细菌分离出来，并进行纯化和培养。
本文将介绍细菌的分离纯化和接种实验的步骤和注意事项。
材料和方法实验材料•需要分离的混合细菌样品•无菌培养基•培养皿•灭菌的培养液•灭菌的试管和移液器•灭菌的培养箱•实验台实验步骤1.准备工作–消毒实验台和所需实验用具，保证实验环境无菌。
–准备好无菌培养基和培养皿。
2.分离细菌–从混合细菌样品中取一小部分，加入无菌培养基中。
–用无菌的移液器均匀涂抹混合液在无菌培养皿上。
–将培养皿密封好，放入灭菌的培养箱中进行培养。
3.纯化细菌–经过一段时间的培养，观察培养皿中的菌落情况。
–选择一个孤立的菌落，用无菌的移液器将其转移到另一个无菌培养皿中。
–重复上述步骤，直至获得纯化的菌落。
4.培养细菌–将纯化的菌落转移到新的无菌培养基中。
–用无菌的移液器均匀涂抹细菌液在无菌培养皿上。
–将培养皿密封好，放入灭菌的培养箱中进行培养。
5.接种实验–准备好待接种的培养基和细菌培养液。
–用无菌的移液器取适量的细菌培养液，加入到待接种的培养基中。
–轻轻摇动培养基，使细菌均匀分布。
–将接种好的培养基放入培养箱中进行培养。
6.结果分析–经过一段时间的培养，观察接种后的培养基中细菌的生长情况。
–记录菌落的数量和形态特征，如颜色、形状等。
注意事项•实验过程中要保持实验环境的无菌状态，严禁对细菌样品和培养基进行交叉污染。
•实验操作要轻柔，避免对细菌造成机械损伤。
•实验结束后，要对实验用具进行正确的处理和消毒，防止细菌的传播和感染。
结论细菌的分离纯化和接种实验是微生物学研究中常用的实验方法。
通过这个实验，我们可以从混合细菌群体中分离出特定细菌，并进行纯化和培养。
这些分离纯化的细菌可以用于后续的微生物学研究和实验，为我们深入了解细菌的特性和功能提供了重要的基础。
在实验操作过程中，我们要严格遵守无菌操作的要求，保证实验的可靠性和准确性。
细菌的纯种分离培养和接种技术实验报告
细菌的纯种分离培养和接种技术实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的纯种分离培养和接种技术，了解细菌的形态特征及生长习性，并能够正确使用细菌培养基和培养设备。
二、实验原理1. 细菌纯种分离：将混合菌涂于琼脂平板上，经过培养后，可以观察到不同形态和颜色的菌落。
选取单个菌落进行多次传代，最终得到纯种菌株。
2. 细菌培养基：含有必需营养物质的液体或固体培养基，可以提供适宜的环境促进细菌生长繁殖。
3. 细菌接种：将细菌转移到新的培养基中，以便于观察其生长情况。
三、实验步骤1. 准备工作：清洁工作台、消毒琼脂平板和试管等设备。
2. 分离纯种：取一支无菌铅笔，在琼脂平板上划出几条直线。
用无菌铅丝在混合液体中沾取少量后，在平板上均匀涂抹，避免相互重叠。
将琼脂平板倒置在恒温箱中，以适宜的温度和时间进行培养。
3. 传代：观察到菌落后，用无菌铅笔在菌落周围划出一圈。
用无菌铅丝沾取少量菌落，划过圈内，再均匀涂抹于新的琼脂平板上。
重复以上步骤多次，直至得到纯种细菌。
4. 培养：将培养基加热消毒后倒入试管中，待其冷却后，在试管口处焊接一根无菌铁针。
用无菌铁针沾取少量细菌接种于培养基中，放入恒温箱中进行培养。
5. 观察：观察培养基上的细菌生长情况、形态特征和颜色等。
四、实验注意事项1. 实验前要进行必要的清洁和消毒工作。
2. 操作时要保持无菌状态，避免污染。
3. 培养箱应设置适宜的温度和湿度，并定期消毒。
4. 实验结束后要及时清理和消毒设备和工作台。
五、实验结果经过分离和传代，成功得到纯种细菌。
在培养基上观察到细菌的形态特征、颜色和生长情况，并能够正确进行接种操作。
六、实验总结本实验通过对细菌纯种分离培养和接种技术的学习和掌握，使我们更加深入地了解了细菌的形态特征和生长习性，同时也提高了我们的操作技能。
在今后的学习和研究中，这些知识和技能将会发挥重要作用。
环境工程微生物学操作实验报告-范例
环境工程微生物学操作实验报告-范例培养基的配制和灭菌细菌的纯种分离、培养接种技术及菌落形态的观察姓名：张世凡学号：201330480123课程名称：环境工程微生物实验一、实验目的1、熟悉玻璃器皿的洗涤与灭菌前的准备工作。
2、了解微生物培养基的基本原理，掌握配制、分装培养基的方法。
3、学习各类物品的包装、配制、灭菌技术。
4、从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用微生物和纯化微生物的方法。
5、学会几种接种技术。
6、平板菌落计数。
7、抗Cu菌的筛选。
8、观察实验分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落的形态特征。
9、通过观察和比较细菌，放线菌，酵母菌及霉菌的菌落形态，达到初步鉴别微生物的能力。
二、实验原理1、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，有碳、氢‘氧、氮、磷、硫、钾、钙、钠、镁、铁、等微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。
调整适合的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。
由于微生物的种类及代谢类型的多样性，因而培养基放入种类也多，他们的配方及配制法也有所差异，但一般的配置过程大致相同。
本实验采用肉汤蛋白胨培养基、查氏培养基（筛选霉菌）、高氏1号淀粉琼脂培养基（筛选放线菌）。
2、灭菌原理:本次实验中培养基、移液枪头等采取加压蒸汽灭菌法。
加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。
培养皿等玻璃器皿用具采用干热灭菌法，另外还有膜过滤灭菌法。
接种时对接种针等采用灼烧灭菌。
3、分离纯化原理：本实验使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。
此法加样量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，现正置一段时间等水分蒸发后倒置。
平板划线法也可以分离从而获得单一菌落以观察其形态特征。
4、微生物的接种原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。
微生物的接种分离和纯培养
接种工具：接种环、接种针、 移液管和刮铲等
○ 接种必须在严格无菌的环 境中进行！
试验材料
菌种：四联球菌，大肠杆菌，枯 草杆菌，变形杆菌，混合菌液
培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养 基，牛肉
膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋 白胨半固体培养基
其他：接种针，接种环，培养皿， 吸管，记号笔等
以无菌操作用接种环 沾取待分离的混合菌 液；
左手持盛培养基的三 角瓶，在火焰附近， 用右手手掌边夹取棉 塞，将三角瓶转移到 右手，瓶口过火；
左手持培养皿底并使 其面向火焰，划线， 划线距离恰当（尽量 靠近，但线与线勿碰 到）。
左手取一无菌培养皿， 在火焰边稍稍打开皿 盖，倒入培养基15ml 左右，放在桌面上轻 轻摇匀，待凝后即成 平板；
微生物的接种分离和纯培养
什么是纯种培养？
自然界中的微生物都是杂居在一起的，通过分离，
01
使它们由混杂状态到单个个体在固体培养基上成为
一个菌落，就获得纯种。
原理是将待分离的样品进行一定的稀释，使之分散，
02
在固体培养基上形成单个菌落，再转接到适当的培
养基上，就认为是纯种。
接种技术
接种技术是将微生物接到适 于生长繁殖的人工培养基或 生物体内的过程。
穿刺接种技术
一．用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺与半固体培养基中间，刺至管底， 再按原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻巧、快速；
二．塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培养24小时观察结果。
实验步骤之二分离法
01
琼脂平板划线分离法
02 稀释分离法
琼脂平板划线分离法
牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基加热熔化后，冷 却至45℃左右；
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
细菌纯种分离、培养和接种技术
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料1、菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法1、水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
微生物的接种、分离和培养
实验六微生物的接种、分离和培养一、目的要求1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理与操作要领。
2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。
3．了解微生物需氧培养的方法。
4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。
二、实验原理1. 微生物接种指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。
根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。
2. 微生物分离指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。
常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。
平板分离法的基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
3. 微生物培养指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。
本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。
4. 微生物的培养形状培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。
平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。
菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。
菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。
实验8 接种和分离技术
实验8 接种和分离技术返回目录细菌常以混合状态存在于环境中，为研究细菌的特性或大量使用某种细菌时，必须从标本中分离出纯的细菌，此种获得纯细菌的方法为分离技术。
经过一定的分离技术将细菌接种于适宜的培养基中，细菌可以生长繁殖形成单个的菌落，从而可以将标本中的各种细菌分离开来。
【试剂与器材】菌种葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液、大肠埃希菌或葡萄球菌斜面培养物。
培养基肉汤管、半固体培养基、固体斜面培养基、普通琼脂平板。
其他接种环、接种针、酒精灯、记号笔等。
【操作步骤】1．琼脂平板分区划线分离法是通过在琼脂平板表面连续划线，使混杂的细菌充分地分散成单个细菌，经生长繁殖后形成单个细菌集团(即菌落)，以达到分离纯种细菌的目的。
(1)灭菌接种环，待冷，取1环葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液。
(2)琼脂平板倒放于桌面，左手抓握起平板底部，尽量直立使琼脂面靠近酒精灯火焰，以免杂菌污染。
右手持沾菌接种环在平板表面上端来回划线，涂成一薄膜(第1区，约占平板面积的1/5)。
划线时接种环与琼脂表面呈30°～45°，用指力轻轻来回滑动密集划线，切忌划破琼脂。
(3)灭菌接种环，杀死环上剩余的细菌，待冷，转动培养皿约60°～70°，将接种环通过第1区3～4次，作连续划线为第2区，约占平板面积1/4，待冷划第3、4区(图1-3-1)。
(4)划线完毕，盖好皿盖，在平板底部用记号笔注明标本(细菌)名称，接种日期及接种者，平板倒置于35℃～37℃温箱培养24h。
(5)取出平板观察菌落分布情况，注意3区和4区是否有单个菌落，并记录菌落的大小、形状、色泽、边缘、透明度等特征(图1-3-2)。
图1-3-1 平板分区划线分离法图1-3-2 菌落分布示意图2.琼脂斜面接种法常用于纯菌的移种或保存菌种。
(1)左手拇指、食指、中指握持菌种管，右手持灭菌的接种环，以右手掌与小指拔取并夹持试管管塞，管口通过火焰灭菌。
将接种环伸入菌种管，自斜面取少量大肠埃希菌后退出，放下菌种管。
细菌的接种及分离培养
细菌的分离—平板划线法
分区划线法： 连续划线法：
第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
1.分区划线法
2.连续划线法
（三）细菌的纯种接种法
当细菌分离成纯种后，常需要接种到相关的培养基中，以测试其各种生物学性状。一般可用斜面、半固体、液体培养基来检验细菌的培养特性，相应培养基的接种方法有三种。Biblioteka 03044
3
一般培养（需氧培养）：
培养温度：35℃（采用恒温培养箱）
培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱
厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
3
4
四、细菌培养法
细菌在固体培养基中的生长现象
菌落： 定义：指单个细菌在平板培养基上37℃18-24h的生长繁殖，形成单一的肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
实 验 6
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细菌培养法
一、目的要求
单击此处添加副标题
1、掌握细菌的一般培养法； 2、掌握细菌培养的接种方法，进一步熟悉无菌操作技术。
3
菌种：葡萄球菌培养物、大肠杆菌培养物、枯草杆菌培养物、变形杆菌培养物；
实验器材：接种环、接种针、酒精灯；
培养基：普通琼脂平板、试管斜面、液体培养基、半固体培养基；
菌落与菌苔
菌落（S型）
菌苔
菌落（R型）
菌落的形态特征有助于细菌的鉴别
细菌在液体培养基中的生长现象
微生物的分离培养和接种技术
菌落计数规则：
选择平均菌落数在30~300间的平板 1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘 以稀释倍数报告； 2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的 菌落数除以低稀释度的菌落数的值）： 1）若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所 得的值的均值报告。 2）若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数 进行报告。 3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍 数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告； 4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数 最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；
培养后平板
右手用接种环挑取涂布分离培
养的平板中的目的单菌落
用已经粘有菌体的接
种环 于另一新的空白平板中划线
分区划线法：灼烧、冷却、取菌 区1划线
灼烧、冷却
区2划线
区3划线
灼
烧、冷却
区4划线…… 完毕、灼烧
连续划线法：灼烧、冷却、取菌 完毕、灼烧
连续划线
7、斜面接种
选择分离效果较好，认为已经纯化的单菌落，挑选一个， 用接种环接种斜面。贴好标签。
注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次”确保混匀。
4、培养
待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于370C温箱中 培养24h；
5、菌落计数
含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平 板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目 推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。
平板菌落计数——活菌计数
0.1ml
0.1ml
0.1ml
细菌的纯种分离
2.0g，水 100ml,pH7.2-7.4.
灭菌条件：121 摄氏度（相对蒸气压力为 0.103MPa）,20min.
(2)加棉塞、包装后灭菌。
4.斜面的制作 灭菌后如需制成斜面培养基，应在培养基冷却至 50-60 摄氏度，将试管搁置成 一定的斜度，斜面高度不超过试管总高度的 1∕3。
（三）稀释水的制备
细菌的纯种分离、培养和接种技术及菌落形态的观察
班级：09 环科二班 姓名：李建文 学号：200930260213 一、 实验目的：
（1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 （2）了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。
（3）学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术。 （4）从湖水中分离、培养微生物，掌握常用的分离微生物的方法。 （5）学会接种技术。 （6）观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。 （7）通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的菌落特征，
（1） 分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管，
右手控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管，用于制造斜面培养基时，一般装
量不超过试管高度（15mm*150mm）的 1∕5.分装时谨防培养基沾在管口上，否
则会使棉塞沾上培养基而造成染菌。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，Nacl
达到初步鉴别上述微生物的能力
二、 实验原理：
1、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖 的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水， 按一定的体积分数配制而成。调整合适的 pH，经高温灭菌后以备培养微生 物之用。本实验配制固体培养基，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体 培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入质量浓度 15-20g∕L 的琼脂为固体 培养基。
实验八 微生物的接种技术及分离纯化-
微生物的分离—平板倾注法
吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5 、 10－6土壤稀释液0.5-1mL，加在空培养皿中。 混和摇匀 水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀 铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培 养箱培养。 计算出每克土壤中放线菌的数量。 挑取单个菌落，进行划线分离。
2、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌 存活率，请设计1-2中可行的检测方法。
①首先将干酵母粉稀释成一定的浓度，用 血球计数板直接计数，统计总菌量，然 后采用平板稀释法计数活菌量，两者的 比值为活菌存活率。 ②也可将干酵母粉稀释成一定的浓度，用 分光光度计测出光密度值，再换算出总 菌量，然后采用平板稀释法计数活菌量， 两者的比值为活菌存活率
实验八 微生
1．掌握倒平板的方法和几种分离纯化微 生物的基本操作技术。 2．学习平板菌落计数的基本原理和方法
实验原理
1. 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一 株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 本实验采用平板分离法： 1)选择合适的选择培养基。 2)通过稀释倒平板和平板划线等技术得到单 个菌落。 2.平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后， 取一定量的稀释液接种在平板上，经过培养，平 板上出现单个菌落，即为一个菌落形成单位 （colony-forming units,cfu） 。
二、划线分离
平板的制作（牛肉膏蛋白胨培养基）
将15ml培养基无菌条件下倒平板，待其凝固后
备用（4皿/组）
划线分离： 取枯草杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液一环， 采用连续划线或分区划线的方法分离单菌落
菌落计数方法 p207
（1）计算相同稀释度的平均菌落数 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。 若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此 一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小 于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。 （3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘 稀释倍数。 （4） 所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘 稀释倍数。 （5） 所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300 的平均菌落数乘稀释倍数。
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南昌大学实验报告
学生姓名：学号：专业班级：
实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩：
实验八细菌纯种分离、培养和接种技术
一、实验目的：
1、学习从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法；
2、学会几种接种技术。
二、实验基本原理：
自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。
要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。
受污染的土壤或水体中，微生物的数量和污染物的降解之间存在着显著的关系.为了提高污染物降解速率,常需接种一些能降解目标污染物的高效菌。
从经过富集、驯化培养的样品中筛选目标菌株，往往是获得高效降解菌的有效方法。
根据目标微生物特定的营养要求，设计相应的选择培养基。
是快速高效获得目标菌的关键步骤。
土壤是微生物生活的大本营，有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株，事实上，生产、工程上很多有益菌株都是从土壤中分离得到的。
从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
微生物纯种分类的方法有很多，常用的方法有两类一类是单细胞挑取法，采用这种方法能获得微生物的克隆纯种，但对仪器条件要求较高，一般实验室不能进行。
另一类是单菌落分离（平板分离法），该方法简便是微生物学实验中常采用的的方法。
通过形成单菌落获得纯种的方法有平板划线法、平板浇注（稀释混合平板法）、平板表面涂布法。
此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。
其原理包括两方面：
1、在适合于待分离微生物的生长条件下（如营养、酸碱度、温度与氧等）培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。
但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
三、主要仪器设备及耗材：
1.器材：
培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、搪瓷杯、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、电子天平、滤纸、pH试纸等。
2.试剂：
配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、结晶紫染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀绿染液、0.5％番红水染液、3％过氧化氢水溶液、蒸馏水等。
3.土样：学生自主实时选择土样，地表10cm左右。
四、实验步骤：
1、玻璃器皿的准备
玻璃器皿在实验前必须洗涤干净，根据实验要求准备相应数量，移液管、培养皿等包装好后灭菌。
可采用干热灭菌法处理。
2、配制牛肉膏蛋白胨培养基：
配方：
牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g
蛋白胨 1% …………………………………… 5g
NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g
琼脂 2% …………………………………… 10g
pH ………………………………………… 7.0~7.2
水 500ml
配制好的培养基分装好后，必须马上进行灭菌处理（高压蒸汽法）。
3、准备稀释水
稀释水也必须灭菌，可与培养基灭菌一起进行。
4、制备土壤稀释液：
称取土样10g，放入盛有90ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，入振荡培养箱中振荡摇匀20min，使土样和水充分混合，取1支1ml无菌移液管从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001等不同稀释度的土壤溶液。
稀释过程如图1示：(同学们不必画图)
土壤样品
土壤样品
图1 稀释过程示意图
5.平板分离法分离
浇注平板法（稀释混合平板法）
分别取上述不同稀释液少许（0.5～1ml），与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
平板划线分离将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。
在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。
划线法特点：快速、方便。
注意：分区划线（适用于浓度较大的样品），连续划线（适用于浓度较小的样品）。
（同学们不必画图)）
图2 划线法分离示意图
涂布平板法由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。
其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落
6 其他一些接种技术
五、思考讨论题
如何从环境中分离目标微生物？
（理解选择性压力法在分离细菌中的作用，富集培养基的应用等）
六、实验体会及对实验改进的建议。