SouthernBlot印记杂交常见问题解析
southernblot知识
一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF 基因为构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。
SouthernBlot印记杂交常见问题解析
Southern Blot印记杂交常见问题解析1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。
(1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大(2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作(3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。
2、核酸质量对southern杂交实验的影响答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。
上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。
根据不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。
基因组越大，上样量越多。
例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。
酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。
回收会有损失，最多能损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的基因组DNA。
（以上上样量均为一个泳道）DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。
同时，需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。
（如图所示）3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。
探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。
探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标记物太少，会导致发光信号减弱。
(2)、特异性强。
最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组序列的同源片段低于30%。
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
southern印记杂交
Southern blot印迹杂交原理示意图
详细操作步骤
• • • • • • • • •
一、 待测核酸样品的制备 二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 三、 电泳凝胶预处理 四、 转膜 五、 探针标记 六、 预杂交 七、 与标记分子杂交 八、 洗膜 九、 放射性自显影检测
电泳凝胶预处理
• DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了
预杂交
• 将固定亍膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，
必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA 片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前， 必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭， 这就是预杂交的目的。 预杂交的DNA是与哺乳类动物的同源性极低，不 会与DNA探针DNA杂交
•
Southern blot技术优点：
进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处 理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较 短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为 了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须 将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段 必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝 胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后， 移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变性并断裂形成较短的 单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓 冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持 单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
• 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到
一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）
• 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的
温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
Southern印迹技术应用与注意事项
目 录
• southern印迹技术概述 • southern印迹技术的应用 • southern印迹技术的操作步骤 • southern印迹技术的注意事项 • southern印迹技术的优缺点
01 southern印迹技术概述
定义与原理
定义
Southern印迹技术是一种用于检测DNA片段在凝胶电泳后转移到膜上的分子 生物学技术。
基因突变检测
突变位点的确定
根据研究目的确定需要检测的 基因突变位点。
探针制备
针对突变位点设计特异性探针 ，可以是放射性或非放射性标 记。
杂交反应
将探针与固定在膜上的DNA片 段进行杂交，形成探针-DNA复 合物。
信号检测
通过放射自显影或荧光检测等 方法，检测杂交信号，确定是
否存在突变。
基因表达谱研究
限制性酶切和Southern转移
探针杂交
对处理后的DNA进行限制性酶切和凝胶电 泳分离，然后进行Southern转移。
使用甲基化特异性探针进行杂交，检测甲 基化状态。
03 southern印迹技术的操 作步骤
样本准备
01
02
03
样本类型
DNA样本，通常为基因组 DNA或PCR产物。
样本浓度
确保DNA浓度适中，过高 或过低都会影响电泳效果。
对实验条件要求高
需要精确控制电泳和杂交条件，否则可能导致实验失败。
与其他技术的比较
与Northern印迹技术比较
两者都是检测基因表达的重要手段，但Northern印迹技术主要用于检测RNA，而 Southern印迹技术主要用于检测DNA。
与PCR技术比较
PCR技术是一种扩增特定DNA片段的方法，而Southern印迹技术主要用于检测和分析 DNA片段。PCR技术更适用于DNA的快速扩增和定性分析，而Southern印迹技术更适
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。
后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。
本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。
关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。
本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。
Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。
1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。
1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。
1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。
目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
蛋白质印迹技术及实验中常见问题分析
Western blot ：
➢ 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗 体反应进行特异性目的蛋白的检测的过程。
➢ 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检 测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可 到10－100pg）的靶蛋白。
Western blot ：
在待分离蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互 作用的缓冲液都可以使用。常见的凝胶电泳缓冲液有两 种： Tris-甘氨酸：分离范围宽，可用于分离分子量
•快速5～15分钟， 颜色稳定； •深浅随不同蛋白质 变化; •标准曲线有轻微的 非线性
•较快40分钟内， •抗干扰能力强
二.SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫 酸钠）
同时电泳系统中存在强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半 胱氨酸之间的二硫键断裂，使得ＳＤＳ-ＰＡＧＥ的电泳中 的蛋白处于完全变性状态
概论
Sout概her论n blot
The Southern blot is used for DNA analysis and was routinely used for genetic fingerprinting and paternity testing prior to the development of microsatellite markers for this purpose.
考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合呈蓝 色，在波长595nm 吸收峰，在一定的 范围内与蛋白质的 含量呈线性关系
高 （约1～5μg/ml）,
BCA法基于双缩脲 很高 原理，碱性条件下 （0.5-20μg/ml ） 蛋白质将Cu2+还原 成 Cu+ ，BCA螯合 Cu1+ 作为显色剂， 产生兰紫色并在 562 nm有吸收峰
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
Northern-Blot印迹杂交
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。
southern印记杂交
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
体积越小,杂交动力学越高;
DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃;
温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
Southern杂交技术原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在 1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交 技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测 这些被转移的DNA片段。
1d
1d 1d
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg
Southern印迹技术应用与注意事项
随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰
胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern
印迹）。 1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹）
从而检测特定DNA分子的含量。
三、操作步骤
酶切位点、探针设计
根据酶切位点进行样本的 酶切，低压电泳分离 DNA 片段
杂交过夜，洗膜并显色
实验前
样本 准备
酶切 电泳
转膜 固定
杂交 显色
DNA提取及处理,探针标记
文本
处理电泳之后的凝胶，转 膜，固定DNA
三、操作步骤-酶切位点，探针设计
酶切位点设计原则：
备）；
4) 杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb 高效杂交液（10 mL/100㎜2），再加入 6 μL变性好的探针（5-20 ng/ mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42℃杂交过夜。
洗膜及DIG信号检测
1) 杂交后，室温下，20 mL 2×SSC+0.1%SDS 洗膜5 min，重复一次 2) 将0.1×SSC+0.1%SDS洗液置于65℃水浴锅中预热后，加入20 mL 进杂交瓶中，65℃洗 涤15 min，重复一次； 3) 将膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min，倒掉液体； 4) 加入100 mL 阻断液反应30 min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体； 5) 加入20 mL 含有抗体的缓冲液，摇动孵育30 min后，倒掉液体； 6) 再加入100 mL洗涤缓冲液洗涤15 min，倒掉液体后，重复此步骤一次； 7) 加入20 mL检测缓冲液，平衡5分钟； 8) 将膜放在盛有底物显色液的盒中（10 mL显色液/100 mm2），15-25℃避光孵育3-5h； 9) 当显色到适合效果后用水洗膜5 min，扫描结果。
Southern印迹杂交实验原理和方法-3
Southern印迹杂交实验原理和方法-3真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需3 0～60分钟。
但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。
下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。
探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。
人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。
探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。
这里介绍放射标记。
以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二）在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μlBSA(小牛血清蛋白) 2μl[α-32ρ] dATP 3μlKlenow 酶 5U（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。
室温或37℃ 1h.（四）加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。
由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。
探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。
六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。
因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。
分子生物学实验常见问题分析及对策
分子生物学实验常见问题分析及对策-141、Southern杂交技术成败主要取决于哪两个因素？答：Southern杂交技术的成败主要取决于两个因素：首先，用于探针的DNA纯度要高，否则影响特异性。
其次是探针DNA 的放射性比强度要高，因为增加放射性强，可提高检测水平。
2、Southern杂交技术中的DNA的消化和电泳有哪些注意点？答：①选择的限制性内切酶应提供某种信息，通常消化前DNA中间长度至少应该三倍于消化产生的DNA中间长度；②高分子的DNA容易造成消化不均匀，所以要用大体系酶切；而若酶切体系太大，消化后不方便上样，则可以对DNA 进行浓缩，用乙醇沉淀DNA；③电泳电泳前，除乙醇，并且70℃水浴，这样也可以破坏限制性片段黏性末端之间的碱基配对；④消化后的DNA可以在4℃保存，但是电泳加样前需加热至56℃2~3分钟，破坏黏性末端碱基对；⑤酶切后，电泳上样前最好通过荧光测量法测DNA消化产物的浓度；⑥电泳前要保证DNA分散均匀，并且若是大分子量的DNA，要用大口径吸头吸取；⑦过夜电泳，低电压慢迁移率；⑧电泳后将凝胶用溴化乙锭染色，读胶，用透明荧光尺读取迁移距离；⑨电泳后的凝胶可以再4℃保存，但是不可超过一天。
3、Southern杂交技术中的膜转移有哪些注意点？答：①凝胶、膜、吸水纸大小要适中，差不多大，不能太大，防止造成短路。
并且各层之间不能有气泡；②凝胶、膜都要做好标记，不能搞混；③转膜前要对凝胶中DNA片段进行变性、洗涤等工作，若目的DNA片段大于15kb，则变形前还要进行短暂脱嘌呤处理，使DNA 产生缺口，提高转移效率；④不带电膜需用中性缓冲液，同时凝胶经变性后需用中性缓冲液洗涤；若是带点膜需用碱性缓冲液，则凝胶可直接进行转移，不需要变性。
4、Southern杂交技术中杂交部分的主要因素有哪些，分别有什么关系？答：杂交步骤中主要因素有膜上的DNA量、探针量以及结合效率等；杂交的灵敏度可达到0.1pg，杂交信号强度与探针特异性活性呈正比，与探针长度呈反比。
Southern印迹杂交作业指导书
Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。
实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。
Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。
这里主要介绍目前常用的电转法。
电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。
一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。
常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。
实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。
2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。
3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。
4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。
5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。
杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。
2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。
3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。
4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。
5．0.1×SSC溶液。
Southern杂交检测样本收集注意事项
Southern杂交检测样本收集注意事项
1. 新鲜组织：
用解剖刀等迅速切成小碎块，约30-100 mg，放入2.0 mL离心管中，开盖液氮速冻15 min，-80℃保存，干冰运输。
每个southern blot泳道提供2-3管样品。
注：(1) 解剖刀处理组织的时间尽量控制在1 min以内。
(2) 液氮速冻时必须开盖，以防炸裂。
(3) 对于较难提取的植物组织，如苎麻、榨菜、枣子、鱼、甘蔗、大署等，1-2 g样品用铝箔纸包好，液氮速冻15 min，-80℃保存，干冰运输。
2. 细胞样品：
悬浮细胞 1000-1500 rpm，5 min，常温离心收集细胞。
贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，吹打收集，PBS洗涤细胞，去除多余培养基和胰蛋白酶。
开盖液氮速冻15 min， -80℃保存，干冰运输。
一般情况下，细胞培养的6孔板，每孔细胞数量约为0.5~2×106个。
每个离心管中的细胞数量控制在5×106个左右！每个southern blot泳道提供2-3管样品。
3. DNA样品（双蒸水水溶解）：
2-8℃短期保存，-20℃长期保存；加冰块低温运输。
质量检测
取1-2 μL的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，无蛋白质和RNA等物质污染，无降解弥散，条带清晰。
纯度、浓度检测
OD260/280=1.8~2.0，OD260/280＞2.0；浓度≥100 ng/μL。
Southern blot杂交鉴定(cross identification)
Southern blot杂交鉴定（cross identification）1）取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。
(20mL,1.0%凝胶,) 2) 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。
3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)A.将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。
B.用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
C.将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。
D.将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。
重复D一次。
在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。
4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台5) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。
另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。
准备10 X SSC 转移液。
将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。
6）安装毛细管转移装置A.将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。
B.将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。
C.将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。
D.用保鲜纸封住凝胶四边。
E.将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。
F.将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。
G.转移几小时或过夜(至少4小时)注意：勿使转移液干枯。
7)已转移的DNA与膜交联A.将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。
B.将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。
C.用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。
此膜可在4℃长期保存。
8)DNA探针的制备(略过)参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。
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Southern Blot印记杂交常见问题解析
1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、
小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。
(1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大
(2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作
(3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。
2、核酸质量对southern杂交实验的影响
答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。
上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。
根据
不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。
基因组越大，上样
量越多。
例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。
酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。
回收会有损失，最多能
损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的
基因组DNA。
（以上上样量均为一个泳道）
DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，
OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。
同时，需要对 DNA 样品进行琼
脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。
（如图所示）
3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？
答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。
探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。
探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标
记物太少，会导致发光信号减弱。
(2)、特异性强。
最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组
序列的同源片段低于30%。
(3)、ATGC含量均匀，无发卡结构和高度重复序列。
4、让客户提供含有待测目的基因的质粒是为什么？
答：这个质粒有两方面用途：
(1)、我们需要使用这个质粒为模板，根据待测目的基因序列来设计并
扩增探针序列
(2)、这个质粒经过单酶切后，用作整个实验的阳性对照。
如果客户无法提供含有待测基因的质粒怎么办？
(1)、我们会根据选取目的基因序列的直接人工合成基因并连入T载体；
(2)、直接以基因组为模板，扩增目的基因序列或探针片段后连入T载体；
(3)、以PCR产物作为阳性对照（这里的PCR产物一般对应的是探针序列，探针设计的多长，这里的阳性对照就有多大）。
5、基因组片段化时使用限制性内切酶是怎么选择的？
答：(1)、目的基因序列中不能含有该位点
(2)、常用的内切酶，价格优惠、酶切效率高
(3)、预实验可以把基因组片段化，电泳检测弥散状态看不到明显的主带。
如图2所示：
(4)、根据转化载体上的酶切位点选择
6、如何减少非特异的曝光条带？
我们采用PCR法合成双链的地高辛标记的探针，电泳检测探针是否标记成功，若条带单一，且略大于对照组，则认为探针合成成功（如图3所示）。
此外，和合成探针前，需要在NCBI上比对探针序列，若没有在待测物种中Blast到高同源性的序列，则认为该探针是特异的。
7、检测结果阴性有哪些因素造成的？
答：在southern杂交服务中，大概总结为一下几类原因：
(1)、基因组中目的基因丰度很低，低于southern blot杂交实验的检测下限（目的基因的量低于0.1pg）
(2)、在该物种基因组信息不全的状态下，探针序列特异性很难保证，结果出现大量的非特异性条带。
(3)、基因组质量达不到要求
(4)、待测样品的确为阴性
(5)、酶切方案的影响。