克隆策略
合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略
合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略不依赖限制性内切酶的分子克隆策略是一种生物学的技术，用于将特定的DNA片段复制成多个复制物，以便进行进一步分析和研究。
它可以帮助遗传学家获取大量特定的DNA序列，并可以通过特定的实验室方法对这些序列进行功能分析。
一、概述不依赖限制性内切酶的分子克隆策略主要是通过外源保护化合物（TAP）来实现无限制酶性克隆技术（TFC）。
TAP通过专门表达的融合蛋白分泌到培养基中，形成一个不接受基因粒范围的抗胞内抗原的壳。
TAP可以把DNA片段放置在其中的交叉起始位点，然后可以使用TFC把DNA片段克隆到另一个载体上，最终得到重组基因。
另一个重要的技术是以有害突变为基础的PCR方法，即突变依赖PCR （MAPS），它是一种不需要保护性蛋白酶就可以进行无限制酶性复制的高通量克隆方式。
MAPS神经可以检测特定的基因突变区域，从而克隆出对应的特定DNA片段。
二、TAP和MAPS的原理理解TAP技术是不依赖限制性内切酶的一种分子克隆策略，其效率要高于传统的限制性内切酶的分子克隆策略。
其原理是：通过表达一种特殊的保护化合物，形成一个不可受阻基因粒范围的抗胞内抗原的壳，这个抗原壳可以将DNA片段放置在其中的交叉起始位点，然后可以利用TFC把DNA克隆到载体上。
MAPS方法是一种基于毒性突变的PCR技术，它可以检测特定的基因突变区域，从而克隆出特定的DNA片段，而不需要任何保护性酶。
三、TAP和MAPS的实验流程在TAP技术中，需要研究者完成以下几个步骤：（1）设计一对序列特异性引物，可以通过in silico方法预测是否存在交叉起始位点，以确定可克隆的最佳DNA片段；（2）在受体上，添加足够的融合蛋白，以保护邻接的交叉起始位点；（3）在源上提供足够多的DNA片段，通过TFC把这些DNA片段复制到受体上；（4）培养新生成的菌株，检测复制基因效率。
MAPS方法的实验流程如下：（1）把特定的DNA片段转录制备好，由此形成一组cDNA；（2）利用突变依赖的PCR技术，根据特定的cDNA的突变，选择相应的引物搭配；（3）复制特定的DNA片段；（4）把复制出的DNA片段克隆到载体上；（5）检测复制的DNA的效率。
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径基因图位克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是⼀种模式植物，具有基因组⼩(125Mbp ) 、⽣长周期短等特点，⽽且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。
同时，拟南芥属⼗字花科(Cruciferae),具有⾼等植物的⼀样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易⽤于其它⾼等植物包括农作物的研究，产⽣重⼤的经济效益，专门是⼗字花科中还有许多重要的经济作物，与⼈类的⽣产⽣活紧密有关，因此⽬前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有⽣命活动的基础。
不论要揭⽰某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第⼀将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因⼯程或分⼦⽣物学的起点。
本⽂就基因克隆的⼏种常⽤⽅法介绍如下。
1 、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.⽤该⽅法分离基因是按照⽬的基因在染⾊体上的位置进⾏的，⽆需预先明⽩基因的DNA 序列，也⽆需预先明⽩其表达产物的有关信息。
同源重组介导的克隆策略研究进展
３Ｙｕ ｎ Ｌ ｎ ｐｎ ｇ — ｅｈ Ａ ｃ ｌ ｒ ． ａ ｏ ｇ ｉｇＨｉｈ Ｔ ｃ ｕｔ ｅＣＯ，Ｌ Ｄ，Ｃ ａ ｇｈ ，Ｈｕｎ ｎ４ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｕ Ｔ ｈ ｎｓａ ’ａ １ ０ １ ｈｎ ）
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｐｒ ｇ ｅ ｓｏ ｃ ｍｂｉａｉｎ Ｂａ ｅ ｎ Ｃｌ ｎｎ ｅｈ ｄ ｓ ａ ｃ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｒｅ ｏ ｎ ｔｏ ｓ ｄ ｏ ｏ ｉ ｇ Ｍ ｔｏ ｓ
Ｄ ｉ ｉ ，＂ｉ ｕ ，Ｌ ｉ ｇａｇ ａ Ｑ． ｎ ｒ ｎＹ ｎ ａ ｕＸａ ｙｎ ｎ
摘 要 ：随 着 基 因功 能 的深 入 研 究 ，构 建 表 达载 体 是 研 究 各 基 因的 功 能 及 其 相互 关 系 的 第 一 步 。 近年 来 涌 现 的 多 种 同 源 重 组 介 导 的 高 效 克 隆 策 略 极 大 地 方 便 了 载体 的构 建 。 简 要 综 述 了 同源 重 组介 导 的 克 隆 方 法 的研 究 进 展 ，及 其 在 载 体 构 建 中 的应 用 。 关键词 ：载体构建 ；同源重组 ；连接酶非依赖型克隆；无 限制酶系统 中图 分 类 号 ：Ｑ ８ ７５ 文 献标 志码 ：Ａ ｄ ｉ １． ６／ｓｎ１７ — ６ ６ Ｘ） ０ １ ６０ ２ ｏ： ０３ ９ｊｓ．６ １ ９４ （ ． １ ． ． ９ ｉ ２ ０ ０
ｃｏ ｉ ｇ ｓ ｓｅ ｌｎ ｎ ｙ ｔ ｍ
分 子 生物 学经 过 ２ Ｏ年 的发 展 ，利 用 限制 性 内切 酶 和连 接 酶 的 方法 成 为 载 体 构 建 中一 个 稳 定 而 有 效 的 系统 。在 载 体构 建 的过 程 中 ，可根 据 实 验 要 求 选 择合 适 的克 隆方法 ，最大 程度 利 用 每种 方 法 的优 点 。 经典 克 隆这 种 依 赖 限制 性 酶 切 位 点 的技 术 完 全 依 赖
基因分离的策略
基因分离的策略一、概念基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。
分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。
基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。
基因的分离是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。
由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组的很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、C、G四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。
二、基因克隆的总体策略1、功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。
①通过分析蛋白质中氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从cDNA文库中分离cDNA克隆②通过制备基因产物单抗来进行cDNA片段分离③通过构建cDNA的表达文库，利用基因产物的功能来筛选基因2、定位克隆法：在事先不知道基因的相关功能信息的条件下，通过遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体某一区段，再通过该区域的精细物理图或表达图分析、寻找候选基因并进行突变分析从而确定疾病的相关基因。
CpG岛筛选法、NotI连锁片段筛选法、外显子捕捉法和外显子扩增法、剪切位点筛选法、启动子捕捉法、polyA捕捉法、显微切割微克隆法、候选基因法。
3、消减杂交：将不同来源的基因组DNA或mRNA进行杂交，两者之间相同的核酸片段互补，或通过随机引物进行差别显示PCR扩增不同来源的cDNA，比较其中的mRNA表达差异，从而将两种之间的差异mRNA被筛选出来。
该法有两种思路：①采用杂交的方法：消减文库、代表性差异显示、比较基因组错配筛选② mRNA差别显示，采用PCR扩增，比较其mRNA的表达差异。
4、动物园杂交：利用一些基因在进化中高度保守的特点，在同种或不同种生物的基因组中有许多高度同源的基因，或具有共同的结构，因而可以利用已经有的基因与基因组文库或cDNA文库杂交，来调取高度同源、或结构相似、功能相似的基因。
QTL精细定位和克隆的策略
QTL精细定位和克隆的策略QTL（Quantitative Trait Loci）精细定位和克隆是一种用于研究复杂性状遗传基础的策略。
QTL是指影响数量性状的基因或染色体区域，通过精细定位和克隆这些QTL，可以了解底层的基因机制以及其对数量性状的调控方式。
本文将介绍QTL精细定位和克隆的策略及其主要步骤。
1.QTL的初步定位：初步定位是通过建立遗传图谱或关联分析等方法，确定QTL所在的染色体区域。
常用的方法包括构建遗传连锁图和联合鉴定法。
遗传连锁图通过建立基因座之间的连锁关系，得到QTL大致所在的染色体区域。
联合鉴定法是基于多个遗传座的遗传效应与表型表达之间的关系，通过统计模型来确定QTL的位置。
2.QTL的精细定位：精细定位是在初步定位的基础上，进一步缩小QTL的定位区域。
常用的方法包括细分群体和QTL-候选基因关联分析。
细分群体是通过构建更多的染色体互换系或染色体片段替代系，并进行连锁鉴定，缩小QTL区域。
QTL-候选基因关联分析则是通过挖掘精密的关联信号，确定QTL所在的基因区域。
这些关联信号可以来自候选基因的DNA多态性标记或RNA表达水平等。
总之，QTL精细定位和克隆是一种通过缩小QTL区域，最终确定突变基因，揭示底层的基因机制的策略。
通过建立遗传图谱和进行关联分析等初步定位方法，缩小QTL的定位区域。
随后，通过细分群体和QTL-候选基因关联分析等精细定位方法，最终确定QTL所在的基因区域。
最后，通过基因克隆和功能验证，揭示QTL对数量性状的调控方式。
这些研究有助于深入理解数量性状的遗传基础，提高作物和动物的育种效率。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
空心病的心脏克隆细胞治疗策略研究
空心病的心脏克隆细胞治疗策略研究心脏病是世界范围内的一大健康问题，其中空心病是一种严重的心脏疾病，常常导致心脏功能衰竭。
近年来，心脏克隆细胞治疗策略成为研究的热点，为患者提供了一种新的治疗选择。
本文将介绍空心病的病理机制、心脏克隆细胞治疗的原理和方法，并探讨其在临床应用中的前景。
空心病是一种心肌细胞丧失或损伤导致心脏功能减弱的疾病。
通常情况下，心肌细胞的损伤是不可逆转的，因为心肌细胞的再生能力非常有限。
因此，寻找一种替代治疗方法成为了研究的重点。
心脏克隆细胞治疗策略就是利用体外培养的心脏干细胞或多能干细胞，通过注射或移植到患者的心脏，以修复受损的心肌组织。
心脏克隆细胞治疗的原理是利用干细胞的多能性和自我更新能力，将其转化为心脏特定的细胞类型，如心肌细胞、心内膜细胞和心包细胞。
这些特定的细胞类型可以替代受损的心肌细胞，恢复心脏的功能。
在过去的几十年里，研究人员已经开发出了各种不同的方法来实现心脏克隆细胞治疗，包括体外培养、基因编辑和生物材料支架等。
在体外培养的过程中，研究人员首先从患者的体内或体外获取干细胞，如诱导多能干细胞或心脏干细胞。
然后，这些干细胞经过特定的培养条件，被诱导分化为心脏特定的细胞类型。
最后，这些细胞被注射或移植到患者的心脏，以修复受损的心肌组织。
这种方法的优点是可以使用患者自身的细胞，减少免疫排斥的风险。
然而，体外培养的过程中存在一些技术挑战，如细胞转化效率低、细胞成熟度不足等。
除了体外培养，基因编辑也是一种常用的心脏克隆细胞治疗方法。
通过基因编辑技术，研究人员可以改变干细胞的基因组，使其具有心脏特定的功能和特征。
例如，将干细胞中的特定基因进行敲除或过表达，可以促使其分化为心肌细胞。
此外，基因编辑还可以用于修复患者体内的病因性基因突变，从而达到治疗的效果。
然而，基因编辑技术在应用中仍然存在一些安全性和效率的问题，需要进一步的研究和改进。
生物材料支架是一种新兴的心脏克隆细胞治疗方法。
克隆策略复习题及答案.doc
克隆策略复习题及答案一、填空题1.克隆策略有三层含义：① 采用什么样的技术路线将目的基因中克隆出来；②用什么方法将目的基因同载体连接；③通过什么方法将体外连接的DNA分子导入适当的受体进行扩增或表达。
2.假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：①保持正确的可读框；②能够使其转录的启动子；③具有翻译的起始和终止信号。
3.现有的基因克隆策略大体上分为四类：功能克隆、定位克隆、表型克隆、电子克隆。
4.受体细胞的感受态是接受外源DNA的生理状态。
5.DNA重组连接的方法大致分为四种：①黏性末端连接；②平末端连接；③同聚物加尾连接；④接头/连接子连接。
6.将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个基因组DNA克隆，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个基因组DNA文库。
7.将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个cDNA克隆,源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个cDNA文库。
8.在构建cDNA克隆之前，可以用差示杂交来富集一特殊的核昔酸序列。
做法是：用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞（不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切）的过量mRNA 分子杂交。
9.一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用染色体步移技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。
10.只要知道基因组中某一特定区域的部分核昔酸组成，用聚合酶链式反应（PCR）可以将这段DNA进行百万倍的扩增。
11.SD序列是mRNA分子中同核糖体RNA结合的序列，其结构特征是AGGAGG的全部或一部分。
12.环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的1% o13.cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用mRNA为模板，通过反转录合成一个双链的、无内含子的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
14.产生平末端的方法通常有：①平切的酶；②S1核酸酶切除黏性末端；③DNA聚合酶补平黏末端。
分子生物学中的克隆策略
分子生物学中的克隆策略克隆技术是分子生物学中应用最广泛的一项技术，其在基因工程、治疗、疫苗和药物研发等领域都有着重要的应用。
具体来说，克隆技术主要是指在体外复制和扩增特定DNA序列的过程。
为了实现有价值的克隆，需要选择合适的克隆策略。
一、催化剂-下游PCR法PCR是分子生物学实验室中最常用的技术之一，其可以扩增DNA的片段。
但是，PCR方法具有一定的局限性，PCR扩增的DNA片段长度不宜过长，而且与RNA结合后再翻译会产生较大的误差。
考虑到此种情况，研究者便设计了催化剂-下游PCR法。
在这种克隆策略中，研究者首先在DNA末端加入适当的序列标记（例如，带有限制酶切位点的标记），并在PCR反应体系中添加在另一条DNA链上特异性结合的相应催化剂，通过PCR扩增特定长度的DNA片段。
此外，在克隆过程中应注意，催化剂不能过多，否则可能引发非特异性放大，导致产物不纯。
二、限制酶-连接PCR法限制酶-连接PCR法是一种基于限制酶嗣中的DNA连接技术的克隆策略。
此种策略中，研究者在目标DNA的两端加入相同的限制酶切割位点，然后使用相应的限制酶处理目标DNA和载体DNA，以及用T4 DNA连接酶连接。
通过连接后，将连接后的目标DNA插入到适当的载体上并导入所需的表达宿主，如大肠杆菌（E. coli）, 单细胞藻等。
这种方法的优点是适用于大片段DNA的克隆，具有比较高的克隆效率和精确度。
此外，使用脚印标记探测目标DNA和核心连接位的研究也具有极大的借鉴意义。
三、COLD-PCR技术肿瘤组织中富含突变，突变基因的测序需要进行高度敏感的检测。
在这种情况下，COLD-PCR技术可以带来巨大的帮助。
COLD-PCR技术基于常规PCR方法进行改进，该策略使用高选择性扩增，以扩大突变基因，减小野生型基因，以达到高灵敏度检测突变基因以及基因突变率的效果。
通过这种技术，可以分离出包含目标突变基因的DNA片段，随后再进行DNA测序，以更好地理解该突变基因的生物学特性和相关性。
目的基因克隆
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
植物细胞色素P450基因的克隆策略及鉴定方法
ａ ｄ ｉｅ ｔ ｃ ｔｏ ｔ ｏ ｆｐａ ｔｃ ｔｃ ｒ ｍｅＰ４ Ｏ ｒ ｕ ｎ ｄ ｎｉ ａｉｎ ｍｅｈ ｄｓｏ ｌｎ ｙｏ ｈ ｏ ５ ｓｗｅ ｅ ｓ ｍｍａｉｅ Ａｎ ｈｅｆ ｕ ｅｒ ｓ ａｃ ｅ ｒ ｒ ｄｃｅ ． ｉ ｆ ｒｚｄ． ｄ ｔ ｕｔｒ ｅ ｅ ｒ ｈ ｓｗｅｅ ｐ ｅ ｉｔｄ
Ｋ ｅ ｒ ｓ Ｃｙｏ ｈｏ ４ ０：Ｃｌｎｎ ｔａｅ ｙ；Ｉ ｅ ｔ ｉａｉｎ ｍｅｈｏ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ｔｃ ｒｍｅ Ｐ ５ ｏ ｉｇ ｓｒ ｔｇ色素 ｅ ５ （ｙｏｈｏ ｅＰ ５ 简称 ｅ ５ ） ４ ｏ ｃｔｃ ｒｍ ４ ０， ４ ｏ 广泛存 在于 动物 、 物 、 菌 、 菌等 细胞 内… ， 与 内质 网、 粒 体 、 植 细 真 是 线 质
Ｃｌｎｎｇ Ｓｔａ ｅ ｉｓａｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔｏ Ｍ ｅｌ ｒｓｏ ａ ｏ ｉ ｒ ｔｇ ｅ ｄ Ｉ ｅ ｔｆ ａ ｎ ｔｌ ｆＰｌｎｔＣｙｔｃ ｏ ５ ｎ ｉ ｉ ｏ ｏ ｈｒ ｍｅ ｐ４ ０ Ｇｅ ｅ
Ｚ ＨＡＮＧ ｏ ｇｈ ａ ｔａ （ ｏｌｇ ｆ ｅＳｉｎ ｅ ，Ｈ ｎ ｎＡ ｒ ｕｔｒｌ ｉｅｓ ｙ Ｚ ｅ ｇｈ ｕ ，Ｈｅａ ５ ０ ２） Ｓ ｎ ・ｕ ｎｅ ｌ Ｃ ｌ ｅｏ “ｆ ｃｅ ｃｓ ｅ ａ ｇｉ ｌ ａ ｖｒｉ ， ｈ ｎ ｚｏ ｅ ｃ ｕ Ｕｎ ｔ ｎ ｎ４ ０ ０
ｌｔ ｆｂｏ ｈ ｍｉａ ｅ ｃｉｎ ． Ｐ ａ ｔｃ ｔｃ ｒｍｅ Ｐ４ ０ｓｉｖ ｌｅｉ ｈ ｙ ｔ ｅ ｉ ｆｍａ ｙ ｓ ｃ ｎ ｒ ｔｂ ｌ ｅ ｎ ｅｏ ｉｃ ｔ ｎ ｍｅａ ｌｓ ｏ ｏｓ ｏ ｉｃ ｅ ｃ ｌｒａ ｔｏ ｓ １ｎ ｙｏ ｈｏ ５ ｎ ｏｖ ｎ ｔ ｅ ｓｎ ｈ ｓｓｏ ｎ ｅ ｏ ｄａｙ ｍｅａ ｏｉ ｓａ ｄ ｄ ｔｘｆ ａｉ ｔｂｏｉｍ ｆ ｔ ｉ ｏ
植物基因识别及克隆策略研究进展
ｓ ｒｐ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｏ ｃ ． Ｔ ｒ ｕ ｈ ｏ ａｉｏ ｏ ｉ ｅ ｅ ｔ ｓｒ ｔｇ ｅ ， ａ ｖ ｎ ａ ｅ ｎ ｉａ ｖ ｎ ａ ｅ ｏ ｉ ｅ ｅ ｔ ｃ ｉｔ ｍｉ ｓ ａ ｄ ｐ ｏｅ ｍｉ ｓ ｈ ｏ ｇ ｃ ｍｐ ｒ ｎ ｆ ｄ ｆ ｒ ｎ ｔａｅ ｉ ｓ ｓ ｆ ｄ ａ ｔ ｇ ｓ ａ ｄ ｄ ｓ ｄ ａ ｔ ｇ ｓ ｆ ｄ ｆ ｒ ｎ ｆ
通 讯 技 术 Ｌ Ｉ Ｒ Ｎ Ｂ Ｏ Ｅ Ｎ Ｌ Ｇ Ｖ ｌ ２ Ｎ ． Ｊ ｔ ０ １ ＥＩ Ｓ Ｉ Ｉ Ｔ Ｃ Ｏ Ｙ 丌 Ｈ ｏ． ｏ ・～ ． … １ — ４ ｕ・ ２ ， ，２ ｌ ｒ Ｅ Ｔ Ｈ Ｏ
… ．
５ ９ ８
ｄｉ ０３ ６￣．ｓ．０ ９ ０ ０ ． １ ． ． １ ｏ：１ ． ９ ｉ ｎ１０ － ０ ２２ １ ４０ ９ ｓ ０ ０ ３
释， 揭示 其参 与 的发 育及代 谢 途径 。传 统上 ， 因 的 基 识 别 主要 从 基 因组 水 平 、 录组 水 平 和 蛋 白质 水 平 转 进 行 ， 转 录 组 水 平 的基 因识 别 及 克 隆 ， 在 成 为 而 正 通 过 基 因功 能 解 读 揭 示 发 育 及 代 谢 调 控 途 径 的 重
ｌｔ ｄ ｔ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔ ｎ ｍｅａ ｏｉｍ ｆ ｐ ａ ｔ ｆ ｎ ｔ ｎ ａ ｎ ｔ ｔ ｎ ｏ ｈ ｇ ｎ ｓ ｎ ｔ ｅ ｅ ｅｓ ｆ ｇ ｎ ｍｉｓ ｔ ｎ ａ ｅ ｏ ｄ ｖ ｌｐ ｎ ａ ｄ ｔｂ ｌ ｓ ｏ ｌ ｎ ， ｕ ｃｉ ｎ ｏ ａｉ ｆ ｔ ｅ ｅ ｅ ｏ ｈ ｌｖ ｌ ｏ ｏ ｏ ｅ ｏ ｃ ， ｒ － ａ
新基因全长cDNA的克隆策略
随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成, 生命科学 已经进入了后基因组学时代(post genomics)。 在对基因组结构进一步了解的
同时,功能基因组学逐渐成为核心内容. 基因组序列测定的完成仅仅是基因组
计划的第一步, 更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与 表达规律。 因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题, 它将是21 世纪生命科学研究的重要领域. 那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基 因功能的研究方案从而进行全面和系统的研究是每个基因功能研究者面相 似的基因。
• 如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用 RACE(cDNA 末端快速扩增)或反向
PCR和锚定 PCR方法克隆该基因的 cDNA全长序列的引物进行序列分析。
• 所有DNA片段；
• 2.连接至载体；
• 3.转化到受体细胞扩增；
• 4.目的序列的筛选鉴别。
• 如果已知一个基因的序列，那么可以通过已知序列设计引物，然后通过PCR技术获 得目标DNA片段。
• 如果一个或多个物种的某种基因已经被分离，可以通过同源性对比找到的保守性
• 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳
到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基 因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时， 失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起。由转座子引起的突变便可部分突变株DNA序 列的克隆，。
• 目前基因功能的基本策略： • 1 .新基因全长 cDNA的克隆策略； • 2 .通过生物信息学预测新基因的功能； • 3 .新基因的表达谱分析；
简述构建质粒克隆载体的基本策略
简述构建质粒克隆载体的基本策略下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!构建质粒克隆载体的基本策略在分子生物学研究中，构建质粒克隆载体是一项基础且关键的实验技术。
植物新基因克隆策略和技术进展
因克 隆 已取 得较 好 结果 并 部 分商 品 化 ， 涉及 植 物 发 育遗 传
调控与信号转导如导致合子形成和胚胎发育 、 调控花粉管
生 长 、 制叶 片发育 和根 发育 、 控 营养 细胞 和生 殖 器官 细 胞分 化 等相 关基 因 的克隆 也取 得 巨大进 展 。模 式植 物结 构 基 因 组 的相继 阐明 ， 多种 植物 高密 度 分子 标记 连锁 图 谱 的构 建 、 大片段 Ｄ Ａ克 隆系 统 的建立 ， Ｎ 序列 测定 技 术 和基 因遗 传转 化技术 的发 展 ，使得 更 多未 知基 因 的克 隆成 为可 能 。随着 ｇｎ ｎ ｅｅ ａｋ中数 据 的急 剧增 加 ， ｂ 分子 操 作技 术 的 日渐 完 备 以 及 研究 基 因差异 性表 达 的重 大意 义 ， 达序 列标 签技 术 、 表 同 源序列 技术 、图位克 隆和 差异 表 达基 因分 离等 技 术将 越来 越 受重 视 。 为此 ， 者对植 物新 克 隆策 略和技 术发 展进 行 了 笔
谱 、 图谱 、 基 因组测 序 以及 功能 基 因组 学等 将全 面 展 物理Ｎ ｍ Ｎ （ Ｄ ＴＰ Ｒ） Ｄ Ｒ ＿ｃ 、代 表性 差 示 分 析 （ Ｄ Ｒ Ａ）和抑 制 差 减 杂 交 （Ｓ ） Ｓ Ｈ 等方 法 获得 的 Ｅ Ｔ数据 也必 将呈 加速度 增 长 。因此 ， Ｓ
基 序 与公 共 数 据库 的基 因进 行 “ 电子 杂交 ”进 而 可 以从 理 ， 论 上 推测 其所 代 表 的基 因 的功能 。 电子 杂交基 因筛选 后 经 的 Ｅ Ｔ 其 延伸 基序 可 作为 某一 基 因标 签 ， 合 Ｐ Ｒ技 术 Ｓ及 结 Ｃ 克隆新 基 因 ， 其过 程如 下 ： 首先 以该标 签 序列 提供 的信 息设 计 合 成 基 因特 异 引物 （ Ｓ ）再 用 Ｏｉ （Ｔ 对 ｍ Ｎ ＧＰ， ｌｏｄ ） Ｒ Ａ进 行 ｇ 反转 录 的同时 加上 锚定 引物 ， 后在 总 Ｒ Ａ 中 ， 用 ｃ Ｎ 然 Ｎ 采 ＤＡ
高表达蛋白的分子克隆策略
高表达蛋白的分子克隆策略随着生物技术的不断发展，蛋白质工程在医学、农业和工业等领域中起着重要作用。
高表达蛋白的分子克隆策略是实现高效表达大量目的蛋白的关键步骤。
本文将介绍一种常用的高表达蛋白的分子克隆策略，并讨论其优势和应用。
一、引子序列的优化设计引子序列是一段与目的蛋白编码序列相连接的DNA序列。
在进行分子克隆前，引子序列的优化设计可以显著提高目的蛋白的表达水平。
引子序列优化设计的原则包括选择适宜的起始密码子、避免稳定性较差的二级结构形成、避免启动子及转录终止位点的干扰等。
二、宿主菌的选择选择适合蛋白表达的宿主菌对于高效表达目的蛋白至关重要。
常用的宿主菌包括大肠杆菌(E. coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、哺乳动物细胞等。
例如，E. coli是最常用的宿主菌之一，其优势在于生长速度快、易于培养，并且表达的目的蛋白易于纯化。
在选择宿主菌时，需要考虑目的蛋白的性质以及宿主菌的表达系统是否能够满足需求。
三、载体的选择和构建为了实现高效表达目的蛋白，需要选择合适的表达载体。
常见的表达载体包括质粒和病毒载体。
质粒是最常用的表达载体，具有稳定性好、易于操作的优点。
病毒载体具有较高的表达水平，但需要严格遵守相关安全操作。
根据不同的表达需求，可以选择具有不同启动子、选择性标记基因和调控序列的载体。
四、限制酶切和连接酶切酶的选择限制酶切是分子克隆的基础步骤，它可以将目的蛋白编码序列与表达载体进行切割。
为了确保蛋白质的高表达，限制酶切的选择是关键之一。
常用的限制酶切酶有EcoRI、BamHI、XhoI等。
连接酶切酶的选择也是非常重要的，它可以将目的蛋白编码序列正确连接到表达载体上。
目前，T4 DNA连接酶和DNA拼接酶是常用的连接酶切酶。
五、转化方法转化方法是将重组质粒导入到宿主菌中的过程。
常用的转化方法包括化学转化、电转化和热激转化等。
转化方法的选择需要根据宿主菌的特性和质粒的大小来确定。
生物信息学序列分析利用生物信息学进行功能基因电子隆技术
在对目的基因进行克隆时所采取的策略十分重要， 其途径大致分为： 正向遗传学途径 反向遗传学途径 电子克隆(in silicon cloning)——一种全新的方法。
正向遗传学是指通过生物个体或细胞的基因组的自 发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变， 然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应 的突变基因，并揭示其功能。功能性克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)等，如：遗 传病基因的克隆。
2.6 cDNA微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术
近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术，其实验 包括6个步骤：将cDNA克隆加工为可供点印的材料；将 cDNA克隆(或寡核苷酸)点印到载体上；样品RNA的分离 (总RNA或mRNA)；探针的制备(例如cDNA的合成和标 记)；标记的探针DNA与载体上的DNA杂交；杂交结果的 成像和图象分析。主要应用于：基因表达水平的检测； 通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可 能致病基因或疾病相关基因；可进行基因点突变、多态 性检测及染色体结构研究。其最为主要的优点是：可自 动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况； 并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。
然后以该D于植物基因的克隆，由于可供利用的转座子 的种类太少，而转座子在不同的植物中转座的频 率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来 鉴定转座子突变个体，限制了转座子标签法的应 用范围。
二、电子克隆基因 （In silico cloning）
1. 功能性克隆(functional cloning) 1.1 纯化后克隆 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备 了免疫 筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利 用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。
基于克隆策略的QoS选播路由算法
Ｚ ＨＡＮＧ Ｙ ａ ｙ ａ ， ＨＡＮＧ Ｙｎ ， Ｕ Ｚ ｅ ｗｅＡｎ ｃ ｓ Ｑｏ ｏ ｔ ｇ ｂ ｓｄ ｏ ｌｎ ｔａｅｉｓ ｏ ｕｅ ｎ ｉｅｒｎ ｕｎ ｕｎ Ｚ ｉｇ Ｙ ｈ ｎ ｉ ｙａｔ ． Ｓ ｒ ｕ ｎ ａｅ ｎ ｃｏ ｅ ｓ ｔｇｅ． ｍｐ ｔｒ Ｅ ｇｎ ｅｉｇ ｉ ｒ Ｃ ａ ｄ Ａ ｐｉ ｔ ｎ ，０ １４ （５ ：１１ ． ｎ ｐ ｌ ａ ｏ ｓ２ １ 。７ ３ ） １－３ ｃｉ
Ｋｅ ｒ ｓ ｎ ｃｓ； ｕｉｇ ａ ｏｉ ； Ｓｐ ａ ｔ ｓｄ ｌ ｏ ｓ ａ ｔｃ ｎ ｔ ｔ ｉ ｙ ｗｏｄ ：ａ ｙａｔ ｏｔ ｌ ｒｈ Ｑｏ ａ ｍｅ ｒ；ｅ ｙ ｃ ｎｔ ｉ ；ｌ ｅｓ ａ ｇｅ ｒ ｎ ｇ ｔ ｍ ｒ ｅ ａ ｒｎ ｏ ｒ ｅ ｓ
摘 要： 在分析选播 通信模 型的基础 上， 出一种基于克隆策略 的Ｑ Ｓ 提 ｏ 选播路 由算法， 在保证带宽和时延的条件下对 目 函数进 标 行优化 ， 对带 时延 约束的Ｑ ｓ ｏ 选播路 由问题作 了深入研 究 。既保 留了遗传 算法较 强的全局搜 索能力 ， 又避免 了局部 搜索性能差 和早熟现 象， 结果表 明与基于遗传算法的选播路 由算法相 比， 实验 此算法是有 效可行 的。 关键词 ： ； 由算法； ｏ 参数 ； 约束 ； 选播 路 ＱＳ 时延 克隆策略 Ｄ ：０３ ７０ｉ ｎ１０ —３ １ ０ １ ５０ ４ 文章编号 ：０ ２８ ３ （ ０ １３ －０ １０ 文献标识码 ： ＯＩ１ ． ８ ．ｓ． ２８ ３ ． １ ． ． ７ ｓ ０ ２ ３ ０ １０ －３ １２ １ ）５０ １—３ Ａ 中图分类４ Ｔ ３ ３ ￣：Ｐ ９
全基因组测序中逐步克隆法的步骤与策略探究
全基因组测序中逐步克隆法的步骤与策略探究全基因组测序是一种广泛应用于基因组研究的技术，通过测序DNA的所有基因组，可以获得大量的基因组信息。
在全基因组测序中，逐步克隆法是一种常用的策略，用于将基因组DNA分解成多个较小的片段，并在克隆和测序过程中逐步重组和细化。
本文将探讨全基因组测序中逐步克隆法的步骤与策略。
步骤一：DNA提取和纯化全基因组测序的第一步是从细胞或组织样本中提取和纯化DNA。
DNA提取的目的是获取足够数量和质量的DNA，以确保后续步骤的成功进行。
常用的DNA提取方法包括Phenol-Chloroform法、Spin Column法和磁珠法等。
DNA纯化则是为了去除杂质和污染物，提高测序的准确性和可靠性。
步骤二：DNA片段化在全基因组测序中，整个基因组DNA需要被切割成较小的片段，以方便后续的克隆和测序。
常用的DNA片段化方法包括机械切割、酶切和超声波处理等。
机械切割是通过力的作用使DNA断裂，酶切是利用特定的内切酶识别和切割DNA 的特定序列，超声波处理则是利用超声波的能量将DNA打碎成小片段。
通过选择不同的片段化方法，可以控制DNA片段的大小和分布。
步骤三：构建文库在逐步克隆法中，DNA片段化后需要进行文库构建。
文库是将DNA片段克隆入可复制的DNA载体中，以方便扩增和测序。
文库构建的关键步骤包括：1.选择适当的DNA载体，如质粒或噬菌体；2.将DNA片段与DNA载体连接，通常利用DNA连接酶。
连接反应的时间和温度需要严格控制，以确保高效率的连接；3.将连接后的DNA载体转化入宿主细胞，如大肠杆菌。
转化后，将使用选择性培养基筛选含有目标DNA片段的克隆。
步骤四：分析和筛选逐步克隆的核心思想是逐步缩小克隆片段范围，直至获得目标序列。
在构建文库后，需要对克隆进行分析和筛选。
常用的分析和筛选方法包括计数法、杂交法、PCR扩增和测序等。
计数法是通过测定不同克隆中DNA片段的相对数量，来推断目标序列所在的克隆范围。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
①粘性末端连接，每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分 子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末 端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌(Escherichia coli) 的限制酶EcoRI作用于识别顺序
↓…GAATTC… …CTTAAG…↑
（↑指示切点），产生具有粘性末端…G …CTTAA和AATTC… G…的片段。把所要克隆的DNA和…载体DNA用同一种限制 酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。 ②平整末端连接，某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘 性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌 （Hemophilus parainfluenzae）的限制酶Hpal作用于识别 顺序
6.2.3 在噬菌体载体上克隆
合成cDNA的局限性 1、并非所有mRNA都有polyA结构 2、细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 3、 mRNA在细胞中含量少，队酸和碱敏感， 分离困难 4 、仅仅限于克隆蛋白质编码基因
6.3 从内切酶部分酶切后， 将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因 组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整样每个细胞就包含了一个基 因组DNA片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多 细胞一起包含了该生物全部NA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上， 然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片 段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某 种生物的全部基因都包含在内的情况下，克隆大片段DNA
许多真核基因片段超过47kb，所以柯斯质粒 被采用。但是质粒噬菌体柯斯质粒都无法分 离整个基因，所以高容量载体BAC,YAC就能 解决这个问题。
当cDNA和质粒DNA混合的时候，有几种可 能的情况。最好的情况就是一个插入的 cDNA连接一个质粒DNA形成一个重组DNA。 如果浓度不匹配，那么可形成单分子串联体 而不是双分子重组DNA.如何区分插入有外源 DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体 分子是较为困难的。通过调整连接反应中外 源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载 体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进 一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸 化等来最大限度的降低载体的自身环化。
完全酶切和部分酶切的区别： 完全酶切，是指使用的内切酶在目标片段上的切点全部切开， 切出来的片段大小不会因为酶量增加，或酶切时间加长而导 致片段大小发生改变（确保不发生星号活性的量和时间）。 克隆构建载体时，就是使用的完全酶切。所有的切点都切了。 部分酶切是指，只对片段上一部分酶切位点产生切割。这种 一般是在建库，或者需要酶切基因组后，获得一定大小范围 内的片段而使用的酶切方法。这种酶切不要求获得某一大小 的片段，而是要获得例如200-500bp的片段，在电泳上没有 条带，而是smear。所以部分酶切需要严格控制酶的用量和 时间，要尝试稀释后的酶液，切一定时间段内，哪一个条件 可以获得目标范围的片段。 部分酶切的条件需要更多的摸索，而且重复性要求也会更高。
Байду номын сангаас
基因克隆即重组DNA技术，指在体外对DNA 分子按照既定的目的和方案，采用酶学方法 将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连 接,组装成一个新的DNA分子。 在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的 宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形 成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆。
基因克隆包括四个基本技术环节：
↓…GTTAAC… …CAATTG…
而产生末端为…GTT …GAA的DNA片段。用机械剪切方法 取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶（例如 感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶）的作用 下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。
③同聚末端连接，在脱氧核苷酸转移酶（也称末端 转移酶）的作用下可以在DNA的3′羧基端合成低聚 多核苷酸。如果把所需要的DNA片段接上低聚腺嘌 呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸， 那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过 DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。 ④人工接头分子连接，在两个平整末端DNA片段的 一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里 面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处 理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一 步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起 来。
1、目的基因和载体的获得； 2、目的基因与载体连接,形成重组分子； 3、重组DNA分子导入宿主细胞； 4、含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩 增。
6.1 哪一个方法是最好的
一个是构建感兴趣的生物个体的基因， 即将生物体的基因全部分段克隆，然后建个是用PCR体外扩增技术或者人工化学 合成法直接合成目的基因。
目的基因来mRNA还是基因组DNA是每一个 试验面临的第一个选择。 mRNA有两个优点：1在特定组织细胞里时空 特异性的表达某种基因；2没有非编码基因。 选择了目的基因的物质来源，接下来确定载 体和宿主系统。在目的基因和实验总体目标 确定的情况下，这一系统的选择是相对容易 的。
“If it ain‟t broke, don‟t fix it” By keeping the overall aim of the experiments in mind, the researcher can minimize the effects of such compromises and choose the most efficient cloning route.
6.2 克隆mRNA
指一种特定的mRNA在某个细胞中的平均分 子数。 丰度越高克隆越容易
6.2.1 cDNA的合成
合成cDNA过程中的几个问题： 1、很难得到全长的cDNA片段 2、在核酸酶去除发卡结构时，会去除一些重 要的5‟端序列
6.2.2 在质粒载体上进行克隆
从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶 切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使 两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌, 即可完成。 连接Cdna与质粒有三种方法1平性末端连接2 分子连接3同聚物加尾。
6.3准备。准备DNA片段需要考虑两方面： 1、DNA片段的大小； DNA片段的大小取决于载体的运输能力。超过 100kb是比较理想的。置换型形噬菌体EMBL-4的 运载能力在23kb左右，YAC,BAC在300kb 2、剪切DNA片段的方法。 剪切DNA片段的方法由机械剪切，缺点是不能产生度梯度离心或是 凝胶电泳进行“分馏”。 插入DNA可以通过磷酸化来避免自身环化和 串联体的形成。
6.4 克隆策略展望
6.4.1 cDNA的合成和克隆
保罗伯格和冈山发明的方法，质粒本身成为 引物，mRNA-s1DNA杂交双联与质粒即连接 分子连接后再进行置换反应，将杂交链变为 Cdna双链 。
“策略”就是为了实现某一个目标，首先预先 根据可能出现的问题制定的若干对应的方案， 并且，在实现目标的过程中，根据形势的发 展和变化来制定出新的方案，或者根据形势 的发展和变化来选择相应的方案，最终实现 目标。 克隆即来自同一始祖的相同副本或拷贝的集 合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化,即无性繁殖。
6.4.2 克隆DNA的表达
克隆DNA的表达。有些试验不需要表达DNA，有些 试验需要将序列作为探针或是生产蛋白质等商业用 途，就需要克隆基因的表达。表达时，选用于表达 载体相匹配的菌株。外源基因在原核细胞表达的必 要条件： 1、删除内含子及5„非编码区； 2、外源基因置于强启动子和SD顺序控制下； 3、维持正确开放阅读框架； 4、Mrna稳定且可有效转译，形成蛋白质不被降解； 5、蛋白不需要翻译后加工过程。