宏基因组学的一般研究策略
宏基因组学
遇到的问题
样品的提取方法还有待改进，生物信息分析依赖于样品的复杂度。
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起源
宏基因组 学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于 将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是“meta-”，具有更 高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为 “应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株”的 科学。
应用
采用宏基因组技术及基因组测序等手段，来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于“沉默”状 态的天然产物。宏基因组不依赖于微生物的分离与培养，因而减少了由此带来的瓶颈问题。
随着新一代测序技术的迅猛发展，研究宏基因组的方法也已经发生了翻天覆地的变化：传统的方法是测定微 生物基因组上的16S rRNA基因，这些基因的长度通常在1500个碱基左右，广泛分布于原核生物，既能提供足够的 信息，而且具有相对缓慢的进化过程；其保守性与特异性并存，通过保守区和特异区来区别微生物的种属。基于 这些特性，科学家们通过选择这些基因区域，方便地研究环境中物种的组成多样性，但是还不能全面分析环境中 的基因功能。新一代高通量低成本测序技术的广泛应用，科学家们可以对环境中的全基因组进行测序，在获得海 量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成等。
研究对象
宏基因组学研究的对象是特定环境中的总DNA，不是某特定的微生物或其细胞中的总DNA，不需要对微生物进 行分离培养和纯化，这对我们认识和利用95%以上的未培养微生物提供了一条新的途径。已有研究表明，利用宏 基因组学对人体口腔微生物区系进行研究，发现了50多种新的细菌，这些未培养细菌很可能与口腔疾病有关。此 外，在土壤、海洋和一些极端环境中也发现了许多新的微生物种群和新的基因或基因簇，通过克隆和筛选，获得 了新的生理活性物质，包括抗生素、酶以及新的药物等。
微生物宏基因组学
微生物宏基因组学的研究成果在农业、环境保护、医学等领域有着广泛的长的影响，为土壤微生物管理和作物生产提供理论依据。在医学领域，宏基因组学可以用于研究肠道微生物的群落结构和功能，探索肠道微生物与健康之间的关系，为肠道微生态调控提供新的思路。
微生物宏基因组学是指对微生物宏基因组的研究，也就是研究微生物整个基因组的结构、功能和进化。相比于微生物单个基因的研究，宏基因组学可以更全面、深入地了解微生物的生物学特性和生态系统中的作用。
微生物宏基因组学的研究方法主要包括以下几个方面：
DNA提取和测序：从样品中提取微生物的DNA，并利用高通量测序技术对其进行测序。当前常用的测序技术有Illumina、PacBio和Oxford Nanopore等。
数据处理和分析：利用生物信息学工具对测序数据进行处理和分析，包括去除低质量序列、去除宿主DNA、基因组组装、基因注释、代谢通路分析等。
比较基因组学分析：对多个微生物的基因组进行比较，分析它们之间的共同点和差异性，探索微生物进化和适应性的规律。
功能基因组学研究：对微生物宏基因组进行代谢通路和功能基因组分析，揭示微生物在生态系统中的作用和代谢特性。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组学在生物医学领域的应用及其风险控制策略
宏基因组学在生物医学领域的应用及其风险控制策略随着DNA测序技术的不断发展，人类逐渐了解到了基因组的复杂性和多样性。
与此同时，基于高通量测序技术的宏基因组学在生物医学领域的应用也越来越广泛。
简单来说，宏基因组学就是利用高通量测序技术对生物系统内的所有DNA进行综合性测序，并将这些数据进行分析、整合和解释，以便更深入地了解生物系统的结构和功能。
宏基因组学在生物医学领域的应用主要包括以下几方面。
第一，宏基因组学在研究人类肠道微生物群落的结构和功能方面具有重要作用。
肠道微生物群落是肠道内存在的微生物群体，具有多种重要功能，包括帮助人体消化吸收、调节免疫功能、合成维生素和激素等。
利用宏基因组学技术，可以直接获取到肠道微生物群落中的DNA序列，进而对其进行分析和解释，探究其在人体健康和疾病方面的作用。
第二，宏基因组学在研究植物和动物生态系统中物种多样性和适应性方面也具有重要作用。
生物系统是由多种不同的物种构成的，它们之间的相互作用和生态功能对整个生态系统的稳定性和可持续性有着重要的影响。
利用宏基因组学技术，可以快速鉴定和识别各种物种，深入理解它们之间的相互关系和生态功能，为生态系统的保护和修复提供重要支撑。
第三，宏基因组学在研究人类疾病的诊断和治疗方面也具有潜在的应用前景。
许多疾病的发生和发展与基因组的变异和表达有着密切的关系，利用宏基因组学技术进行全面综合分析，有助于更深入地了解疾病发生的机制和病理生理过程，为精准诊断和个体化治疗提供支持。
但是，宏基因组学并非一项完全安全和风险可控的技术。
随着其在应用中的深入推广，它所涉及的安全问题也日益凸显。
其中最主要的挑战是个体隐私和数据保护问题。
由于宏基因组学涉及的是大规模的DNA数据采样和分析，如果相应的隐私保护和数据管理机制不足或者失误，极有可能会导致个体隐私泄漏和数据滥用，给人类社会和生态系统带来不可弥补的损失。
为了应对宏基因组学所面临的安全挑战，需要制定有效的风险控制策略。
宏基因组学及其技术的研究进展_楚雍烈
收稿日期 : 2008-09 -16 修回日期 : 2008 - 11 -10 作者简介 : 楚雍 烈( 1944) , 男( 汉族) , 教授 , 博 士生导 师 . 研究方 向 : 肿瘤病毒分子遗传学与免疫生物学 . E-mail : mbiology @mail . xj tu . edu . cn
随着人类科学认识论和思维方式的深化 , 在分子 生物学和分子遗传学技术方法的支撑下 , 顺应 21 世 纪生命科学的发展 , 在基因组学的基础上诞生了一门 崭新的交叉学科 — — — 宏基因组学( met ageno mics) 。 宏基因组学的问世引起世界科学界的极大关注 , 发展 很快 , 它代表了生命学科今后的研究方向 。 本文就宏 基因组学的产生 、 概念 、 研究的基本策略和方法进行 综述 。 1 宏基因组学的产生 、 发展和概念 1. 1 宏基因组学的产生背景 人类基因组计划( hum an geno me project , HGP) 的完成促使了基因组功 能性研究计划的开展 , 并推动从结构基因组学研究时 代进入功能性基因组研究为主的后基因组时代 , 人体 基因的功能研究成为生命科学领域的研究热点 。
宏基因组和宏转录组
宏基因组和宏转录组宏基因组和宏转录组是生物学研究的两个重要领域，在生物多样性研究、新物种发现、环境污染监测等方面都有着广泛的应用。
在这篇文档中，我们将详细介绍宏基因组和宏转录组的概念、研究方法、应用和挑战等方面，希望能对读者有所启示。
一、宏基因组的概念和研究方法宏基因组指的是对整个微生物群落（甚至包括整个生态系统）的基因组进行研究。
和传统分子生物学研究中只针对单个物种或单一基因的研究不同，宏基因组可以同时研究到各种微生物（包括细菌、真菌、古菌等）的基因组，从而能更全面地了解微生物群落的结构、功能和交互作用。
研究宏基因组的主要方法包括：1.高通量测序技术。
序列可以分为短序列和长序列两类，其中短序列多采用Illumina HiSeq、MiSeq等平台，长序列多采用Oxford NanoPore、PacBio等平台。
高通量测序技术可以快速、准确地获取微生物群落的基因组信息，特别是在未知物种中寻找新基因时有着重要的作用。
2.基因组装和注释。
通过将高通量测序数据进行去噪、拼接、组装等处理，可以得到微生物群落的基因组信息，然后根据数据库的信息对基因进行注释，以了解它们的功能、结构等信息。
3.比较基因组学。
对不同物种的基因组信息进行比较，可以了解它们之间的进化关系、基因家族扩张与变异、适应性等信息。
二、宏转录组的概念和研究方法宏转录组是对微生物群落中所有基因的转录本的研究。
它可以帮助我们了解群落中各种微生物的功能特征和代谢能力，从而更加深入地了解微生物群落的生物学特性和环境适应性。
研究宏转录组的主要方法包括：1. 直接测序技术。
采取高通量测序方法，将群落中mRNA转录本进行转录组测序。
通过直接转录组测序，可以避免PCR引入的失真，获得全长、高质量的RNA序列，并对微生物群落中的基因表达情况进行全面的了解。
2. 基因序列比对与定量分析。
将直接测序得到的序列与基因组序列进行比对，可对基因表达进行定量分析，获得微生物中各基因的表达量、拷贝数、相对表达量等信息，研究基因表达水平的差异。
宏基因组学的研究及其应用
宏基因组学的研究及其应用随着科技的不断进步，人类对于自然界的认识也在不断深入。
过去，我们只能通过显微镜观察到微生物的形态，而现在，我们可以通过先进的宏基因组学技术去研究微生物的DNA序列，从而了解生物界的更多信息。
宏基因组学已经成为了生物学及相关领域的研究热点，其在医学、环境监测、生态等方面应用广泛。
宏基因组学的研究方法宏基因组学是指研究环境样本中微生物群落的基因组学方法。
这是一项高通量技术，可以通过对微生物DNA的特定放大和测序来获取标准化数据，然后进行基因学分析。
在样本收集方面，一般采用一个高通量的DNA提取技术，以提取环境样本中的微生物群体中的基因组DNA。
DNA样本可以来自各种样本类型，如土壤、海洋、河流、水、气溶胶以及植物和动物等。
DNA提取和测序之后，需要对数据进行清洗、去除噪声、组装基因组和注释等复杂的分析流程。
这些数据分析工具需要依赖高级计算机科技，如云计算、高效算法、人工智能等。
宏基因组学在医学上的应用宏基因组学技术在医学上的广泛应用主要是通过研究微生物群落来了解人体内的微生物组成，从而促进人类健康的改善。
例如，人类肠道的微生物组成与许多人类疾病都有关系，包括肥胖症、炎症性肠病、癌症等等。
通过宏基因组技术，我们可以了解不同人体的微生物群落组成差异，并发展出一些治疗方案，以改善人类健康。
除了以上的应用，宏基因组技术在药物研发方面也有着广泛的应用。
许多药物的研究及开发需要使用大量的微生物，而宏基因组技术可以对微生物的基因组信息进行更深入的研究，以便更好地了解微生物的生理机制，并且开发出更有效的药物。
宏基因组学在环境研究上的应用宏基因组学技术在环境研究中的应用也是非常广泛的。
对于环境保护和治理，我们需要了解微生物对于气候变化和污染的反应，以便更好地处理环境问题。
例如，通过宏基因组技术可以了解微生物在水体中的变化及其对不良污染的反映，从而开发出更为高效的治理方案。
另外，宏基因组技术在农业生产中也有着重要的作用。
宏基因组学_基本策略及在医学研究领域中的可能应用_丛延广
●ＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇｒｅｓｓｅｓ《生命的化学》２００７年２７卷１期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹＯＦＬＩＦＥ２００７，２７（１）文章编号：１０００－１３３６（２００７）０１－００１０－０２宏基因组学：基本策略及在医学研究领域中的可能应用丛延广胡福泉（解放军第三军医大学基础医学部微生物学教研室，重庆４０００３８）摘要：宏基因组学（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）的提出是分子生物学领域的一个重要进展。
在自然生境中有大量不可培养微生物的存在，无法通过培养法进行研究，而宏基因组学的策略则突破了这一束缚。
宏基因组学是从生境中取得全部微生物的基因组，并进行系统研究的方法。
该文介绍宏基因组学的基本情况，并着重探讨其在医学研究领域中的可能应用。
关键词：宏基因组学；宏基因组中图分类号：Ｑ７———————————收稿日期：２００６－１１－２２国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０５００４３５）作者简介：丛延广（１９７３—），男，博士，副教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｇｃｏｎｇ＠ｍａｉｌ．ｔｍｍｕ．ｃｏｍ．ｃｎ在地球各种生境中，微生物表现出极大的多样性。
然而相比我们基于培养法了解的微生物，绝大多数种类的微生物因为不能培养而无法了解。
有数据表明，各种生境中有多达９９％的微生物是不可培养的，其中蕴含着巨大的应用潜能———其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物［１］。
在过去，此类开发研究都是基于培养的办法，即利用实验室技术将微生物培养出来，然后根据其表型特征进行筛选，例如对产抗生素菌株的筛选等，通过这种方式取得了大量成果。
然而，面对生境中绝大部分的不可培养微生物，这种方式是行不通的。
如何研究并开发利用这些不可培养微生物，成为重要而又急迫的任务。
近年来，宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。
宏基因组学以生境中全部ＤＮＡ作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。
由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。
宏基因组学的研究
宏基因组学的研究宏基因组学研究进展及其应用摘要：本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。
宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。
关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用引言：微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。
仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。
自然条件下，包括病毒在内的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。
人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。
为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。
宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。
宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。
由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。
尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。
1.宏基因组学的概念宏基因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。
宏基因组分析方案_微基生物
宏基因组功能基因筛选
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 引物，扩增得到 序列， 通过设计特异的 引物 序列 然后两端加上接头， 的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 进行测序分析， 用Illumilla的高通量测序技术对 的高通量测序技术对 进行测序分析 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
载体
一般选用质粒、粘粒或者 载体来构建， 一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 比较复杂的化合物，因其基因簇较大 对生物合成比较复杂的化合物， 断小于 则无法完整克隆。 ，则无法完整克隆。 细菌人工染色体（ 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆 ）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 以上的大插入片断 完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径， ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。 和表达量低。因而可选库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。 进行亚克隆和序列分析。 增加载体拷贝数以获得大量 进行亚克隆和序列分析
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选， 生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。 如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、 如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子， 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。 效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
宏基因组学一般研究策略
宏基因组学一般研究策略宏基因组学是对宏观生物体的全基因组进行测序和分析的研究领域。
相比于微生物基因组学，宏基因组学需要面对更大、更复杂的宿主基因组。
在宏基因组学研究中，通常会采用以下的一般策略：样品采集、DNA提取、宏基因组测序、数据分析与解读。
首先，样品采集是宏基因组学研究的第一步。
采集的样品可以是土壤、水体、肠道等环境样品，也可以是植物、动物等生物体的组织样品。
样品的采集需要根据研究的目标选择合适的采样地点和时机，并尽量避免污染，以保证宏基因组数据的准确性和可靠性。
第二，DNA提取是宏基因组学研究的关键步骤。
宏基因组学研究通常需要从样品中提取出总DNA，包括宿主DNA和微生物DNA。
在提取过程中，需要选择合适的提取方法，如利用化学试剂、机械破碎或酶切等手段将DNA从细胞中释放出来，并采用特定的提取试剂盒进行纯化。
DNA提取的质量和纯度对后续的宏基因组测序和数据分析具有重要影响，因此需要严格控制提取过程的操作规程，并进行质量检测。
第三，宏基因组测序是宏基因组学研究的核心环节。
宏基因组测序可以采用多种不同的测序技术，如传统的Sanger测序、高通量测序技术（包括Illumina、Ion Torrent等），还可以结合元转录组或元蛋白组测序等方法进行更全面的研究。
在宏基因组测序时，需要根据实际情况选择合适的测序深度和覆盖度，以充分覆盖宿主基因组和微生物基因组的信息。
同时，为了保证测序结果的可靠性，需要进行测序重复和质量控制。
第四，数据分析与解读是宏基因组学研究的最后一步。
宏基因组测序产生的数据量庞大，需要进行一系列的数据分析和处理，包括序列质量控制、拼接、组装、注释等。
通过对宿主基因组和微生物基因组的比对和分析，可以研究宏基因组的组成、结构、功能和演化等问题。
同时，可以将宏基因组数据与宿主表型数据进行关联分析，探究宿主和微生物之间的相互作用和共生机制。
综上所述，宏基因组学研究策略包括样品采集、DNA提取、宏基因组测序和数据分析与解读。
宏基因组学土壤微生物研究的新策略
土壤微生物的宏基因组学
近年来，随着测序技术的进步和计算能力的提升，土壤微生物宏基因组学的 研究取得了显著进展。通过对不同土地利用类型、不同气候条件和不同地理区域 土壤微生物群落的比较，发现土壤微生物的多样性和群落结构深受环境因素的影 响。此外，通过对土壤微生物群落功能基因的挖掘和分析，进一步揭示了土壤微 生物在生态系统中的重要功能。
五、总结与展望
五、总结与展望
本次演示介绍了利用宏基因组学策略研究土壤微生物的新方法，并分析了其 优点、缺点以及应用前景。虽然该策略在应用过程中存在一些问题需要优化改进， 但其为理解土壤微生物的多样性和功能提供了强有力的工具，为未来的土壤微生 物研究打开了新的篇章。
五、总结与展望
展望未来，随着科技的不断发展，宏基因组学策略将不断完善和优化，为土 壤微生物研究带来更多的突破。例如，随着单细胞测序等新技术的出现，我们将 能够更精确地研究单个土壤微生物细胞的动力学行为和基因表达；结合和机器学 习等方法，我们可以更深入地挖掘测序数据中的隐藏信息和模式。另外，通过与 其他“组学”技术的联用（如转录组学、代谢组学等），我们将能够更全面地了 解土壤微生物群落与环境的相互作用关系。
内容摘要
总之，宏基因组学为农业土壤微生物研究提供了新的视角和工具。通过深入 了解土壤微生物群落，可以更好地保护和利用这些重要的自然资源，为提高农业 产量和改善农产品质量做出重要贡献。
宏基因组学中高通量数据分析策略研究
宏基因组学中高通量数据分析策略研究随着测序技术的不断发展，宏基因组学研究领域也在不断拓展。
高通量测序技术使得宏基因组学研究所需的数据量得到了迅速增长，但是数据的复杂性和多样性也带来了巨大的挑战。
针对这些挑战，研究人员们不断提出新的分析策略和方法，以更好地解读宏基因组数据。
本文将介绍几种常见的宏基因组中的高通量数据分析策略。
1. 基于OTU的分析策略OTU（Operational Taxonomic Units）是一种根据序列相似性进行聚类的方法，将相似序列聚为一个OTU，然后统计每个OTU的数量。
OTU分析是最常用的宏基因组分析方法之一，其核心思想是将高通量测序数据中的DNA序列相似性进行聚类，使同一物种的序列聚为一类。
使用OTU分析策略可以获得每个样品中存在的不同OTU数量，从而对样品之间的差异性进行比较。
但是，由于OTU聚类方法的不同，不同的OTU分析工具可能会产生不同的结果。
2. 基于组装的分析策略基于组装的分析策略是将高通量测序得到的原始序列先进行组装，得到更长的序列，然后进行功能注释和分类。
这种方法可以获得更长的序列，使得对序列进行功能和分类分析更加准确。
但是，组装的过程中可能会出现错误，导致结果出现偏差，同时组装过程的计算强度也很大。
3. 基于古菌/细菌比例的分析策略在宏基因组研究中，细菌和古菌的组成比例往往是一个重要的指标。
在一些环境样品中，如土壤和水体样品中，细菌和古菌比例的变化往往与环境因素密切相关。
因此，基于古菌/细菌比例的分析策略可以从侧面反映环境因素对于微生物群落的影响。
4. 多样性分析多样性分析是宏基因组学研究中的另一个重要研究方向，其目的是量化样品中生物多样性的度量。
物种多样性是生物学研究中的一个重要概念，其评估方法包括物种丰富度、物种均匀度和物种多样性指数等。
多样性分析可以帮助研究人员更好地了解样品中微生物群落的多样性情况和生态系统里的复杂性。
综上所述，针对宏基因组学中所涉及到的高通量数据处理和分析问题，不同的分析策略和方法得到了广泛的应用，每种方法都有其自身的优缺点和适用范围。
宏基因组学的一般研究策略.doc
宏基因组学的一般研究策略摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。
它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。
该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。
它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。
本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。
关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略Strategies for accessing metagenomics for desired applicationsAbstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field.Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。
宏基因组学
功能筛选法
• 方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直 接检测 ；
• 方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突 变体在选择性条件下功能互补生 长的依赖于功能基因或编码功能蛋白在外 源宿主中的表达 。
底物诱导基因表达法
• 代谢相关基因或酶基因往往在有底物存 在的条件下才表达 ,反之则不表达 ,SIGEX 即利用这个原理来筛选目的代谢基因。
底物诱导基因表达法
• 第—β2 D硫代半乳糖苷
( IPTG)为诱导物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白 基因 ( gfp)表达的克隆子； • 第三步：在培养基中添加底物诱导代谢关基因的表达； • 第四步：根据 gfp基因的表达从宏基因克隆库中筛选出表 达代谢基因的克隆子 ,利用荧光激活细胞分离仪 ( FACS)从琼脂培养平板上将GFP表达的克隆子分 离出来。
焦磷酸测序技术
• 由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光 反应。
• 原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶 的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一 次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释 放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸 测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测 序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸、 荧光素。
• 宏基因组学
也称微生物环境基因组学, 环境基 因组学，元基因组学,生态基因组学。
环境基因组学建立在对疾病病因认识的基 础上 ,深入探讨环境胁迫 - 基因、 基因基因间交互作用。其目标是研究环境胁迫对 机体遗传变异的过程和机理 ,包括发掘环境 应激和应答基因的多态性 ,探究这些多态性 基因的功能及其与患病风险的关系 ,其与毒 理基因组学密切相关 ,是在人类基因组基础 上发展的功能基因组学内容之一。
超大规模宏基因组学研究思路
超大规模宏基因组学研究思路导读微生物是人体的重要组成部分，人体微生物的基因数目远远超过人体自身基因数。
其中，肠道微生物是人体微生物组的主体，口腔、皮肤、阴道微生物均为人体微生物组的重要组成部分。
有研究表明，人体不同部位的微生物组成更是存在很大差异1。
人类基因组计划完成之后，人体微生物组研究逐渐提上日程：美国国立卫生研究院于2007年底启动人体微生物组计划（Human Microbiome Project, HMP）旨在通过对人体微生物遗传和代谢的整体研究，了解人体微生物组；紧随其后，欧盟于2008年初启动人体肠道宏基因组学计划（Metagenomics of the Human Intestinal Tract, MetaHIT），旨在通过对比疾病人群，解析人体微生物与健康或疾病的关系，促进人类健康。
由于微生物在代谢及免疫调节等方面的重要作用，与人体健康密切相关。
所以，近年来，微生物研究也已成为各大科研机构的研究热点，微生物相关产品和应用更是层出不穷。
以微生物为研究对象的宏基因组学研究也变得火热起来。
加上，近年来，高通量测序技术的快速发展，使得测序成本大大降低，大规模宏基因组研究更是得以迅速开展。
作为宏基因组研究的重要工具，宏基因组鸟枪法测序技术使我们能够从基因水平、物种水平、功能水平全方位刻画微生物组；宏基因组关联分析作为宏基因组研究的一种重要分析方法，其探究微生物与多种复杂疾病如2型糖尿病、肥胖等的关系，也为疾病预防、诊断、治疗提供了新的思路。
本次特别邀请了深圳华大生命科学研究院宏基因组研究所的研究团队，结合宏基因组已有研究基础与当前宏基因组关联分析的进展，对大规模宏基因组研究思路作一总结和概述。
16s rRNA基因扩增子测序与宏基因组鸟枪法测序不同于单一物种的基因组研究，宏基因组研究以环境样品中全部微生物基因组为研究对象，其丰富的物种多样性成为宏基因组研究的难点。
16S rRNA基因扩增子测序方法以分类学标记基因为基础，能够鉴定样品中存在的微生物种类，研究微生物与疾病之间的关系。
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宏基因组学的一般研究策略摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。
它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。
该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。
它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。
本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。
关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略Strategies for accessing metagenomics for desired applicationsAbstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field.Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。
然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。
宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。
现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。
本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。
深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。
1 宏基因组学研究策略1.1宏基因组学概要宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。
其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。
1.2 微生物及其基因的富集在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。
目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。
其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常图 1 环境微生物宏基因组学研究策略[6]Fig. 1 General process of metagenomic strategie[6]用的就是上面例子中的底物选择法[5]。
每一个事物都有其两面性，富集培养虽然扩大了基因的总量，却很容易使部分微生物及其携带的基因丢失。
基因水平富集中的稳定同位素探针技术(SIP)很有代表性, 它是用稳定同位素标记底物, 用相对量较大的原子掺入到具有活性的核酸里,采用密度梯度离心法将其分开, 标记的核酸可作为PCR的模板,用来构建宏基因组文库[7]。
目前，SIP与宏基因组学结合的报道还不多，但其潜力与优势很明显，利用SIP可提高新基因发现的几率。
1.3 环境中总DNA的提取宏基因组学要分析的样品成分复杂,要获得高浓度、大片段、无偏好的总DNA是宏基因组学技术的难点，也是其重点。
现在提取DNA的方法大体有两种: 其一是直接提取法, 又称原位提取法，它用化学和物理方法直接裂解样品中的微生物使DNA得以释放,再抽提总DNA,并对DNA进行纯化。
其中以Zhou法[8]和Tsai[9]法最为常用。
该法操作简便、省时、成本低,能代表某一生境的微生物群落多样性。
其缺点是会出现细胞裂解不完全或DNA 与样品杂质共沉淀而难以分离, 故一般要再进行DNA纯化这一步,它所提取的DNA片段较小(1 kb~50 kb), 适合小片段文库的构建; 其二是间接提取法, 即异位提取法,是采用差速离心等方法将细胞从样品中分离出,再提取DNA, 该法获得的DNA纯度高、DNA 片段大(20 kb~500 kb), 适合构建大片段的基因文库。
但操作繁琐、成本高、DNA 产率低且有偏嗜性, 其产率只是上一种方法的1%~10% [10], 其总DNA往往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
可见两种方法各有利弊，应根据具体实验灵活选择，一般较好提DNA的液体样品才用后者。
本实验室通过实验研究得出：一般而言，直接裂解提取法效率较高, 不易丢失物种信息，能够获得25 kb 左右的DNA 片段。
间接法提取效率较低, 容易丢失基因信息。
因此我们建议采用直接提取法获取总DNA。
我们还采用低熔点琼脂糖包埋法提取水样中的大片段DNA，其大小在50Kb以上。
单一包埋块中的DNA含量较小，我们把多个琼脂糖包埋块放在一起后用酶法纯化浓缩，大大提高了DNA的总量，收到了很好的效果。
1.4文库的构建1.4.1载体的选择: 现在用于DNA克隆的载体有质粒、Fosmid、Cosmid、BAC、YAC和噬菌体等，可由DNA纯度、片段大小、质粒特性、宿主菌及筛选方法等灵活选择。
质粒可用于克隆小于10kb的DNA片段，对较大的基因或由多基因簇构成的DNA可以建立Fosmid 文库[11-13]和Cosmid 文库[14]。
BAC和Y AC的容量可达200 kb~450 kb[15]。
但YAC载体存在着比较高的嵌合体(占全部克隆的40%~60%),转化效率低,稳定性差,插入片段分离与纯化比较困难[15]。
BAC、PAC、MAC和人类人工染色体HAC等载体系统克服了以上缺点。
一般认为BAC是其中较好的。
Fosmid 质粒上带有 E.coli F 因子单拷贝的复制原点和需诱导的高拷贝oriV 复制原点，其表达受一个严谨条件诱导的启动子的控制。
我们可通过诱导Fosmid阳性克隆高效表达的方法获得大量质粒，便于提取功能DNA，进而进行序列和酶学特性的分析，而不需要再建亚克隆。
我们通过大量实验摸索出了Fosmid质粒的较佳的应用条件，其效果优于其它载体。
1.4.2 宿主细胞的选择: 不同种类的微生物所产的活性物质不同。
选择宿主时应考虑转化效率的高低、重组载体的稳定性、外源基因能否有效表达、目标性状是否缺陷等。
目前，E. coli 是应用最多的宿主[16.17], 其背景清楚、操作简单、繁殖快、易培养。
为了表达真核外源基因我们实验室改进了酵母和CHO等表达系统且效果明显，它们是表达真核修饰蛋白（如市售的很多药物蛋白）的重要研究方向。
现在有人利用链霉菌、假单胞菌等作为表达新抗生素的宿主效果较好[18]。
我们可根据目的产物不同灵活选择宿主菌，一般而言，若要开发新型生物催化剂则用E. coli[19]，若开发的是新的抗生素等药物则选择亲缘关系很可能较近的链霉菌等。
1.5文库的筛选活性克隆子的筛选是宏基因组学技术的又一重点和难点。
高通量的筛选策略能否应用成功是实验成败的关键。
由于生物的个体性很强，导入宿主菌的基因可能缺乏有效的转录、翻译以及蛋白转运分泌机制,也可能由于翻译后加工机制不完善,或宿主缺乏必要因子及存在密码子的偏嗜性等将直接影响筛选的效率和灵敏度[20]，给宏基因组文库筛选带来了很大的挑战。
目前筛选策略主要有一下两种：1）基于序列的筛选方法，该法用到了生物信息学，由已知的同源性很近的基因的序列设计探针或PCR引物,再用杂交或PCR扩增等技术筛选出目的基因, 该法是筛选保守性较高的生物催化剂的有效方法。
它克服了功能筛选法中对活性产物的有效表达的依赖。
其中PCR 扩增技术是最常用的[21]。
这一方法是根据保守和已知DNA序列设计的,所以它的缺点是被筛选出的新基因总是与已知基因相同或类似,或扩增的特异性不强，筛选效果不理想，且难以获得完整的功能基因。
现在基因芯片技术和优化的随机鸟枪法筛选效果也很令人信服。
序列依赖性筛选法被看作是极具潜力的一种筛选方式。
很多研究者在此方面作了改进，譬如应用穿梭载体表达外源基因，从而使宏基因组DNA 利于通过多种宿主进行筛选，或者对大肠杆菌做适当修饰以增加基因表达的范围。
2) 基于功能的筛选方法，这一种方法利用外源基因表达产物的活性来筛选阳性克隆,即采用各种活性检测手段挑选有活性的克隆子,进而对其进行研究分析。
现在大部分的新型生物催化剂都是利用这种方法筛选得到的。
人们已经在选择性平板上筛选到了脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及抗菌活性的克隆子[22,23]。
本方法中有一种有效的筛选方式是构建报告融合子[24],可将提取的总DNA随机克隆到无启动子的绿色荧光蛋白基因(GFP)前面, 运用荧光激活细胞分离(FACS)技术, 在添加特定底物的情况下富集筛选阳性克隆。