生化分析实验课紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线
紫外分光光度法测定蛋白质含量
紫外分光光度法测定蛋白质含量化学2班李永亮41007061【实验目的】（1）学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；（3）掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
【实验原理】本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
该测定法具有简单、灵敏、快速高、选择性，且稳定性好，干扰易消除，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一对于测定那些与标准蛋白质中赖氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；其二若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
【实验仪器与试剂】仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管，胶头滴管试剂：标准蛋白质溶液（3.00mg/mL）,0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液【实验步骤】一、准备工作1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。
2、在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。
3、将空白放入测量池中，点击开始扫描空白，点击基线校零。
4、标准曲线的绘制二、测量工作1、吸收曲线的绘制用吸量管吸取2mL3.00mg/mL 标准蛋白质溶液于10mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm 石英比色皿，以0.9% NaCl 溶液为参比，在190 nm ～400nm 区间，每隔2nm 测量一次吸光度，记录数据。
2、标准曲线的制作用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 3.00 mg/mL 标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。
实验3 紫外分光光度法测定蛋白质含量
【实验步骤】 实验步骤】 1、标准曲线法 标准曲线的制作： 只试管按表2 加入试剂， （1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇 选择光程1cm 石英比色皿， 280nm波长测定A280， 波长测定A280 匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280， A280值为纵坐标 蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 值为纵坐标， 以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
6 2.5 1.5 0.62 5
7 3.0 1.0
8 4.0 0
0.75 1.0
（2）样品测定： 样品测定： 配制待测蛋白质溶液1ml 加入蒸馏水3ml 1ml， 3ml， 配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇 匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 A280 2. 直接测定法 在紫外分光光度计上， 在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入 比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm 280nm和 比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm 波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度： 波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为 为蛋白质浓度 蛋白质溶液在280nm 260nm处测得的吸光度值 280nm和 处测得的吸光度值) 蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。
表1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 标准曲线的绘制
项目 标准蛋白液/ml 蒸馏水/ml 蛋白质浓度/ml A280
生物化学实验--蛋白质性质试验
（三）黄色反应 原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如
酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物 质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物 硝醌酸等。
操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加 热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液 1ml，颜色有什么变化？
（四）茚三酮反应 原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三
操作：
1、尿素实验
取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其
熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，
至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然
后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶液，
2、蛋白液实验
取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4 滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
荧光法gml不同种类蛋白最大吸收波长nm标准方法准确操作麻烦费时灵敏度低适用于标准的测定紫外分光光度280205灵敏快速不消耗样品核酸类物质有影响100010000540重复性线性关系好灵敏度低测定范围窄样品需要量大folin酚试剂750灵敏费时较长干扰物质多25050500595灵敏度高稳定误差较大颜色会转移bca50500562灵敏度高稳定干扰因素少费时较长蛋白质不同方法比较一实验原理一实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸在碱性条件下可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色生成钼蓝和钨蓝化合物
察结果。 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白液2ml及醋 酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，
观察现象。
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试验四紫外吸收法测定蛋白质含量
实验四紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的1．了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2．掌握紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等氨基酸的侧基含有苯环或杂环，在280nm波长下具有最大吸收值。
由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的吸光度是蛋白质的一种普通性质。
在一定浓度范围（0.1~1.0mg/mL）蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可用做蛋白质定量测定。
核酸在紫外区也有吸收，可通过校正加以消除。
该方法的优点是定量过程中无试剂加入，蛋白可回收。
特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）紫外分光光度计（2）离心机（3）分析天平（4）研钵（5）容量瓶（6）移液管2．试剂0.05mol/L，pH7.5Tris-HCl缓冲液。
3．材料在暗箱18~25℃培养8~10天的绿豆芽下胚轴。
四、操作步骤1．提取蛋白称取绿豆芽下胚轴0.5g置研钵中，加少量石英砂和2mlL Tris-HCl缓冲液充分研磨，定容至50mL，取5mL离心（4000r/min）5min后，取上清液稀释至20倍（根据材料不同可调整稀释倍数）。
在做样品测量的同时，做空白对照，比色时以空白对照调零。
2．比色在紫外分光光度计上，于280nm和260nm波长下分别测其吸光值。
五、结果处理与分析蛋白质含量（mg/mL）=（1.45A280—0.74A260）×稀释倍数式中，A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度；A260为蛋白质溶液在260nm处测得的吸光度。
【注意事项】不同蛋白质酪氨酸的的含量有所差异，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性，尽管利用上述公式进行校正，但由于不同样品中干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法的准确性稍差。
【思考题】1．紫外吸收法（UV）测定蛋白质含量的原理是什么？此方法的主要用途是什么？2．比较紫外吸收法、双缩脲法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量优缺点。
紫外分光光度法测定蛋白质含量_百度文库(精)
教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。
即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。
定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。
因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。
由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。
光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。
紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
实验五 紫外法测定蛋白质含量
实验五紫外法测定蛋白质含量1目的学习紫外法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉紫外分光光度计的原理和使用方法。
2原理蛋白质对280nm．．．．．的紫外光有最大吸收，这是因为含有Tyr和Trp的缘故，蛋白质溶液的280nm的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。
3器材7500紫外分光光度计，石英比色皿，擦镜纸，试管，移液管，洗耳球4试剂（1）1mg/ml 血清蛋白标准液（2）未知浓度蛋白质溶液5操作步骤（1）标准曲线的绘制：取五支试管，按下表编号并加入试剂：试剂管号1 2 3 4 51mg/ml标准蛋白溶液（ml）0 1.0 2.0 3.0 4.0蒸馏水（ml） 4.0 3.0 2.0 1.0 0蛋白质浓度（mg/ml）0 0.25 0.50 0.75 1.0OD280加毕，混匀，用紫外分光光度计测OD280，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，回归出线性方程，显示R2。
（2）取未知浓度蛋白质1.0ml，加蒸馏水3.0ml，混匀，测OD280，利用回归方程计算蛋白质浓度。
6注意事项（1）标准曲线制作时准确配制蛋白质的梯度浓度。
（2）使用的比色皿要比较其空白吸光值的差异，如差异过大（>0.005），则测样品时注意加减差值；（3）熟练掌握紫外分光光度计的使用。
附：7500紫外/可见分光光度计的使用一、原理工作的依据是比尔——郎伯定律：A=KLC式中A为被测物质对单色光的吸光度值，K为被测物质的吸收系数，与入射光波长及被测物质的特性有关，L为被测物质的厚度，与比色皿的厚度有关，C为被测物质的浓度。
二、操作步骤1. 开机。
打开7500主机电源，仪器显示板LCD上显示―UV/VIS 7500‖。
随后钨灯自动点亮，氘灯在钨灯点亮后约6 sec左右自动点亮。
打开主机电源后，主机自动作一系列自检工作：2. 单点波长定量分析。
单波长吸光值（A）测定；单波长透过率（T）值测定；单波长样品浓度直读；线性回归方程参数测定。
紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理
紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理介绍紫外分光光度法是常用的一种测定蛋白质浓度的方法。
本文将详细介绍紫外分光光度法的原理以及其在蛋白质浓度测定中的应用。
紫外分光光度法原理紫外分光光度法利用蛋白质溶液对紫外光的吸收特性进行测量，从而确定蛋白质的浓度。
蛋白质分子中的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）等芳香族氨基酸在紫外光区域具有吸收峰，通过测量吸光度可以间接测定蛋白质的浓度。
实验步骤以下是使用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的一般实验步骤：1. 制备蛋白质样品制备含有待测蛋白质的溶液样品。
确保溶液浓度适中，避免过高或过低浓度对测定结果产生影响。
2. 预热紫外分光光度计打开紫外分光光度计并进行预热，使其达到稳定的工作温度。
3. 校准光程使用标准样品校准紫外分光光度计的光程，确保准确测量待测样品的吸光度。
4. 测定吸光度将待测样品倒入光度池，使用紫外分光光度计测量样品溶液在特定波长下的吸光度。
常用波长为280nm，其对色氨酸具有最大吸收峰。
5. 绘制标准曲线制备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液，分别测定它们的吸光度。
利用这些测定值绘制标准曲线，用于计算待测样品的蛋白质浓度。
6. 计算蛋白质浓度根据标准曲线，计算出待测样品的蛋白质浓度。
根据不同的光吸收系数和波长，可以得出不同氨基酸的摩尔吸光系数，再根据摩尔吸光系数进行计算。
紫外分光光度法的优势紫外分光光度法具有以下优势：1.灵敏度高：对浓度较低的蛋白质样品也能够进行准确测量。
2.快速便捷：测量过程简单，不需要复杂操作。
3.非破坏性：样品在测量过程中不受损伤，可以进行进一步的分析。
紫外分光光度法的局限性紫外分光光度法也存在一定的局限性：1.干扰物质：一些样品中可能含有其他吸收波长与蛋白质相近的物质，会对测定结果产生干扰。
2.重复性：在批量测定时，光度池的装填和清洗对结果的重复性有一定影响。
3.波长选择：根据不同蛋白质的吸收特性，选择适当的波长进行测量，否则会导致测定结果不准确。
生物分析实验六_紫外吸收法测定蛋白质含量
实验紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的1．掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2．学习紫外分光光度计的仪器原理及使用方法。
二、实验意义牛奶是大众化的奶制品，蛋白质含量较高，近年来中国乳制品出现了很多的食品安全问题。
针对这些问题，我们小组使用紫外分光光度计来测定常见牛奶品牌中蛋白质含量。
紫外分光光度计操作简单，有较好的灵敏度，可用于乳制品生产线上质量检测。
三、实验原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280纳米波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度值（O.D.280，或吸收值）与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
该法迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用。
本法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液内有时混杂有核酸，应予以校正，核酸强烈吸收波长为280纳米的紫外光，它对260纳米紫外光的吸收更强。
但是，蛋白质恰恰相反，280纳米的紫外吸收值大于260纳米的紫外吸收值。
利用它们的这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。
但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。
四、实验试剂和器材（一）、试剂：1.牛血清清蛋白溶液：购买市面上售卖的经过校正的结晶牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。
氯化钠溶液。
2.待测蛋白质溶液：10月份沃尔玛超市购买伊利纯牛奶3盒，该货架有这种产品70盒左右。
在正式实验开始前的周末去沃尔玛超市购买3盒伊利纯牛奶，规格250mL（牛奶保存环境为温度20摄氏度左右的室内，货架对面为酸奶冷柜）。
记录购买时间，牛奶在货架所放位置（靠近地面，货架中层，货架上层）。
生化实验-蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验实验一双缩脲法测定蛋白质含量一．实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。
二．实验原理在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应），颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。
在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于520nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
三．实验仪器及试剂容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿试剂：①标准酪蛋白溶液10mg/ml②双缩脲试剂: 溶解2.5g CuSO4·5H2O于100ml水中，加热溶解，取酒石酸钠10g、碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH溶液300ml混合，倒入硫酸铜溶液，加水至1000ml③小鼠肝脏蛋白原浆四．实验内容（1）取小试管7支，编号，按下表注入溶液（2）混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
（3）按表中第七管的数据加入溶液，在37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每100ml小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。
五.实验数据记录及结果分析绘制曲线如下：由图可知，当吸光度为0.107时，相对应的蛋白质克数为1.38 mg，则100ml 小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为1.38 g。
实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一．实验目的掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。
二．实验原理考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，结合物在595 nm波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。
三．实验仪器及试剂仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿试剂：①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。
紫外分光光度法测定蛋白质含量
紫外分光光度法测定蛋白质含量实验目的1、学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理。
2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。
实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm 附近（不同蛋白质的吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯—比尔定律。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一，测定的蛋白质与标准蛋白质中色氨酸、酪氨酸的含量不同，会造成一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质；其二，若样品中含有嘌呤、嘧啶（核酸）等吸收紫外光的物质，会产生较大的干扰。
核酸强烈吸收波长为280nm的紫外光，对260nm 波长的紫外光吸收更强，其与蛋白质不同，蛋白质在280nm处的吸收大于260nm 的吸收，故可利用这一性质，通过计算适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。
由于不同的蛋白质与核酸的紫外吸收不同，故测定的结果还是会产生一定的误差。
在测定工作中，可利用在280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度（mg·mL-1）=1.45A280—0.74A260其中A280、A260分别为蛋白质溶液在280nm与260nm 处测得的吸光度值。
Warburg 和 Chirstian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对于有核算存在时所造成误差做出了评价，并作出校正表。
A280与A260的比值为校正因子F，可从校正表中查出，同时可查出该样品溶液中混杂核酸的百分含量，将F值代入，再由经验公式直接计算该溶液的蛋白质浓度。
蛋白质浓度（mg·mL-1）=F * 1/d * A280* D其中d为石英比色池的厚度；D为溶液的稀释倍数。
紫外吸收法在蛋白质含量为20~100μg·mL-1范围内服从比尔定律，氯化钠、硫酸铵以及0.1mol·L-1磷酸、硼酸和Tris 等缓冲溶液都无显著干扰，但是，0.1mol·L-1乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲溶液在215nm 下的吸收较大不能应用，必须降至0.005mol·L-1才无显著影响。
生化实验 蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验实验一双缩脲法测定蛋白质含量一．实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。
二．实验原理在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应），颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。
在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于520nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
三．实验仪器及试剂容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿试剂：①标准酪蛋白溶液10mg/ml②双缩脲试剂: 溶解2.5g CuSO4·5H2O于100ml水中，加热溶解，取酒石酸钠10g、碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH溶液300ml混合，倒入硫酸铜溶液，加水至1000ml③小鼠肝脏蛋白原浆四．实验内容（1）取小试管7支，编号，按下表注入溶液（2）混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
（3）按表中第七管的数据加入溶液，在37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每100ml小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。
五.实验数据记录及结果分析绘制曲线如下：由图可知，当吸光度为0.107时，相对应的蛋白质克数为1.38 mg，则100ml 小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为1.38 g。
实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一．实验目的掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。
二．实验原理考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，结合物在595 nm波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。
三．实验仪器及试剂仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿试剂：①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。
山大生化实验报告 实验七 紫外吸收法测蛋白质浓度
实验七紫外吸收法测蛋白质浓度姓名：周超同组者：刘炳煜班级：11级生命基地学号：201100140067【实验目的】1、了解紫外吸收法测蛋白质浓度的原理2、熟悉紫外分光光度计的使用【实验原理】蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。
由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。
如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。
因此如溶液中存在核算时必须同时测定280nm及260nm的吸光值，方可通过计算测得溶液中的蛋白质弄浓度。
【实验材料】一、器材UV-9100型紫外分光光度计试管7个移液管摇匀器洗瓶二、试剂标准酪蛋白1mg/ml样品血清（稀释100倍）蒸馏水【实验步骤】一、直接测定法1、在紫外分光光度计上，将样品血清溶液小心盛于石英比色皿中，以水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280nm及A260nm）2、当A280nm/A260n m﹤1.5时，将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度：C=1.45A280nm-0.74A260nm式中C：蛋白质质量浓度（mg/ml）3、当A280nm/A260n m﹥1.5时，将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度：血清蛋白质量浓度（mg/ml）=（A280nm/6.3）×10二、标准曲线法取7支试管，按下表加入试剂。
加毕，混匀，用紫外分光光度计测A280nm，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，对1-7号作图，测样品管的A280nm，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
【实验结果】一、直接测定法1、C=（1.45A280nm-0.74A260nm）*2*100=72.4mg/ml2、C=[（A280nm/6.3）*10]*2*100=128.0 mg/ml二、标准曲线法C=0.403/0.8424*2*100=95.6mg/ml【结果分析】三种计算测定和计算方法得出三个数值：使用公式C=（A280nm/6.3）*10计算得到的数值准确性最差，因为实验数据不满足该公式的使用条件A280nm/ A260nm〉1.5。
紫外分光光度法测定蛋白质含量实验报告
紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。
二、实验原理1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。
本实验采用紫外分光光度法。
2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。
利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
三、仪器与试剂TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。
10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。
四、实验步骤1.绘制吸收曲线用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。
2.绘制标准曲线用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。
3.样品测定取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长280nm处测其吸光度，重复三次。
在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg·mL-1，测吸光度，重复三次五、数据处理与结果分析图1吸收曲线在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波长225nm处的吸收峰远大于280nm处，这是由于在波长250nm以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大，所以，蛋白的最大吸收波长应为280nm。
(完整word版)紫外吸收法测蛋白质含量
紫外吸收法测定蛋白质浓度一．目的1.了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理.2.熟悉紫外分光光度计的使用。
二．原理蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。
最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律：A=abc“A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。
紫外—可见吸收光谱法又称紫外—可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm~750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外—可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱,是带光谱。
紫外—可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成,如下所示：由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光，该单色光通过样品池对样品溶液吸收后,通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。
由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用,但核酸的最大吸收峰在260nm处。
如同时测定260nm的光吸收,通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。
以此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm处的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。
三．器材1.1800S型紫外可见分光光度计2.容量瓶100ml（×1）3.试管若干4.移液管若干5.吸水纸6.檫镜纸四．试剂1.酪蛋白标准溶液：1mg/ml2.样品液:血清稀释100倍五．操作（一）直接测定法在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以去离子水为对照，测定280nm及260nm两种波长的吸光度(A280nm 及A260nm）。
紫外吸收法测定蛋白质含量
1
0
4
2
0.5
3.5
3
1.0
3.0
4
1.5
2.5
5
2.0
2.0
6
2.5
1.5
7
3.0
1.0
8
4.0
0
பைடு நூலகம்蛋白质浓度 （mg/mL）
OD280nm
0
表1 蛋白质标准曲线制作
0.125
0.25
0.375
0.50
0.625
0.75
1.0
紫外吸收法测定蛋白质含量
一、实验目的
学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原 理；
熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用 方法。
二、实验原理
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨 酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光 的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此 波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
核酸%
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
OD280nm /OD260nm
0.846 0.822 0.804 0.784 0.767 0.753 0.730 0.705 0.671 0.644 0.615
校正因子 核酸%
0.656 0.632 0.607 0.585 0.565 0.545 0.508 0.478 0.422 0.377 0.322
蛋白质浓度（mg/mL）= F×OD280nm×D 式中：OD280nm为被测溶液在280nm紫外波长
下的光密度，D为溶液的稀释倍数。
OD280nm /OD260nm
紫外吸收法测定蛋白质含量
一、实验目的
学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原 理； 熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用 方法。
二、实验原理
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨 酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光 的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此 波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
4.00
5.00
0.595
0.278
20.00
注：通常纯蛋白质的OD280nm /OD260nm 约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。
六、思考题
1．紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白 质含量相比，有何缺点及优点？ 2．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？
参考答案
1．蛋白质测定的Folin-酚比色法（即Lowry 法）的定量范围为5～100μg蛋白质，灵敏度 高；但操作要费较长时间，且Folin试剂显色 反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起， 因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合 物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色 氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。 紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消 耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已 在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其 在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检 测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。
但该法的缺点是：（1）对于测定那些与标 准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大 的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测 定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 （2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外 光的物质，会出现较大干扰。例如，在制 备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混 杂有核酸，应予以校正
2．当样品中含有核酸类杂质，可以根据核 酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收， 而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收 的性质，通过计算可以适当校正核酸对于 测定蛋白质浓度的干扰作用。但是，因为 不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同 的，虽然经过校正，测定结果还存在着一 定的误差
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友情复叙
（1）、需要强调的是：紫外、可见分光光度法测定样品时都需要用一个“空白管”， 它主要是用于仪器校“零点”用。空白管一般又习惯称“零管”和“对照
管”。
（2）、能作为“零管”溶液的条件？一般要求是：被测定的溶质的溶剂作为零管溶 液，但是如果实验本身要求不高或所用溶剂与蒸馏水在某一特定的波长吸 光度差异很小（比较过），也可以直接用蒸馏水甚至自来水代替。
紫外分光光度法
测定蛋白质吸收光谱曲线
一 实验原理
蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨 酸）具有共轭双键结构能够产生π→π﹡及n→π﹡类型的电子跃迁， 因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280 nm波长处有一特征吸收 峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行 定性分析。
0 240 250 260 270 280 290 300 310
波长（nm）
吸光度(A)
吸光度(A)
图1、牛血清白蛋白在250—300 nm波长吸收光谱曲线图
牛血清白蛋白紫外吸收光谱曲线
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 240 250 260 270 280 290 300 310 波长（nm）
5-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作
以表1测定的波长为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标对应作图。然后分 别将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中吸收峰所 对应的波长即为蛋白质最大吸收波长，结果见图1。
图1 蛋白质的紫外吸收光谱曲线图
牛血清白蛋白紫外吸收光谱曲线 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
（3）、在特征吸收峰附近波长间隔尽量要小，否则会错过真正的特征吸收峰值。特 征吸收峰通常又称最大吸收峰，如蛋白质、核酸分别在280nm和260nm时的 吸收值最大。
（4）、在吸收光谱曲线及含量的测定中，要达到结果的准确性，除了自身的操作水 平外，还要保证分光光度计的波长精度(除校正外，还有厂质，所以 要写仪 器型号，厂名)，以及有关测定样品的溶剂，pH,离子强度，温度以及其他相 关条件的一致性,否则会给实验结果带来差异，既不一致性。
四 试剂及配制Leabharlann 4-1 牛血清白蛋白 [试剂纯,上海试剂有限责任公司]
牛血清白蛋白溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：
称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适 量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度 为1.0 毫克/毫升的溶液。
五 操作步骤与结果
5-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定
二 实验目的与要求
（1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。 （2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。 （3）、了解和掌握蛋白质的定性原理。
三 实验主要仪器与器材
3-1、实验仪器
（1）、 紫外分光光度仪 （2）、 混合器 （3）、 天 平
3-2、实验器材
（1）、 定容瓶 （2）、 烧 杯 （3）、 滴 管 （4）、 骨 勺 （5）、 称量纸 （6）、 剪 刀 （7）、 镊 子 （8）、 洗 瓶 （9）、 玻 棒 （10）、记号笔 （11）、标签纸 （12）、坐标纸
对测定波长的范围和间隔大小，可根据不同样品的实际情况和要求加以确定。
牛血清白蛋白标准品溶液在不同波长测定结果
表1 - 牛血清白蛋白样品溶液在250—300 nm波长吸光度结果表 波 长（nm） 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 277.5 吸光度 (A) 波 长（nm） 280.0 282.5 285.0 290.0 295.0 300.0 305.0 吸光度 (A)