Lowry’s法(Folin-酚试剂法)

原理
1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷 钼酸）起蓝色反应。
1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中 加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
原理
第一步：双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)
能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这 个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩 脲反应。
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
怎样测定血清中蛋白质的含量
蛋白质含量测定的常用方法比较
方法
灵敏度
优点
凯氏定氮法
0.2~ 1.0mg氮 干扰少， 准确
紫外吸收法
50～100mg 快速简便 无损样品
40
0.60 2.0
80
0.40Βιβλιοθήκη Baidu2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
实验目的
1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理 及其实验操作技术。
2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线 求样品溶液中待测定物质含量的方法 。
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与 碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白 质- Cu2+复合物。
原理
第二步：Folin-酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其
磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈 蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质 中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显 色反应。
即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或 色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸， 生成蓝色的化合物。
原理
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白 质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标 准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品 中蛋白质的含量。
样品
健康人血清
试剂
1、牛血清白蛋白标准液（200μg/ml） 2、碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3、Folin-酚试剂
Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂 是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶 液。
故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后， 必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生 在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
蛋白样品 混匀，
碱性铜试剂
放10min
注意事项
加酚试剂
然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血 清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的 微克数(μg/ml)。
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
考马斯亮蓝法 （Bradford）法 双缩脲法
1～5ug 1～20mg
灵敏、简 便、快速
干扰相对 少，较快
Lowry法
20～250ug 灵敏度高
缺点 操作复杂，费时
灵敏度低 干扰物较多 不同蛋白质测定时 有较大的偏差 灵敏度低
干扰物质多、费时、 操作严格计时
选择测定方法时应考虑
1、实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 2、蛋白质的性质； 3、溶液中存在的干扰物质； 4、测定所花费的时间等。
仪器和器材
1、V-1100分光光度计 2、恒温水浴箱 3、试管6支、试管架 4、加样枪、加样枪架 5、坐标纸
操作
试剂（ml)
1
牛血清白蛋白
-
标准液
样品液（稀释300倍） -
蒸馏水
1.0
碱性硫酸铜
2.0
蛋白质浓度（ g/ml） 0
2
3
4
5
6
0.20 0.40 0.60 0.80
-
0.80 2.0
2s混匀
水浴 10min
放至 室温
比色
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必 须精确控制时间。
– 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计 时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试 剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。
– 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则 第1支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟 后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加 第3支试管，以此类推。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！