磁珠富集与液相色谱-质谱联用结合筛选枳壳中脂肪酶抑制剂

Vol.33高等学校化学学报No.122012年12月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2692~2696磁珠富集与液相色谱鄄质谱联用结合筛选

枳壳中脂肪酶抑制剂

陈　锥1,陶　益1,王　怡2,王　毅1

(1.浙江大学药物信息研究所,杭州310058;2.天津中医药大学中医药研究院,天津300193)

摘要　提出了一种磁珠收集与液相色谱⁃质谱联用(LC⁃MS)结合用于快速筛选中药提取物中的脂肪酶抑制剂的方法.通过制备键合脂肪酶的磁珠,将其与枳壳总黄酮孵育后,筛选出枳壳中脂肪酶的配体.通过LC⁃MS 分析发现,4个化合物均是潜在的脂肪酶抑制剂,鉴定其分别为柚皮苷㊁新橙皮苷㊁橙皮苷和枸橘苷.对4个化合物进行了体外脂肪酶抑制活性验证.研究结果表明,新橙皮苷㊁橙皮苷和枸橘苷具有显著的脂肪酶抑制活性,IC 50分别为48.04,52.45和46.18μg /mL,其中枸橘苷具有脂肪酶抑制活性为首次报道.结果表明,磁珠富集与LC⁃MS 集成技术能够用于快速发现中药活性成分.

关键词　脂肪酶;磁珠富集;枳壳;配体筛选

中图分类号　O629 文献标识码　A doi :10.7503/cjcu20120436S

收稿日期:2012⁃05⁃04.

基金项目:国家 重大新药创制”科技重大专项课题(批准号:2012ZX09304⁃007)和国际科技合作项目(批准号:2009DFB30510)资助.

联系人简介:王　毅,男,博士,副教授,主要从事中药药效物质快速发现技术方面的研究.E⁃mail:mysky@ 脂肪酶是催化体内三酰甘油水解的关键酶.食物中的脂肪在胰脂肪酶和胃脂肪酶的作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸,在肠道内被吸收,然后在体内重新合成脂肪,造成脂肪堆积,最终可导致肥胖[1,2].因此,脂肪酶抑制剂可通过抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用,达到减少脂肪吸收㊁控制和治疗肥胖的作用[3,4].临床用于治疗肥胖的药物,如奥利司他等是典型的脂肪酶抑制剂[5,6].迄今,人们已经从植物中发现了很多天然的脂肪酶抑制剂[7],如何快速筛选出新的脂肪酶抑制剂成为目前研究的热点.

常规的脂肪酶抑制剂筛选方法为均相溶液酶法,即以溶液酶作为酶源,与抑制剂共同孵育一段时间后,通过相关指标来检测溶液酶的活性,从而评价抑制剂对酶活性的抑制效果.如Nakai 等[8]选择4⁃甲基伞形酮油酸酯作为底物,将酶与底物孵育后,通过分光光度法评估待测物对脂肪酶的抑制活性.这种方法需与活性追踪分离等方法相结合,才能从混合物中筛选出活性化合物,因此需要较长的研究周期.近年来,采用固相酶法筛选活性化合物引起人们的关注.该方法是将酶或靶标蛋白固定在某种合适的载体上,通过筛选等方式富集和分离与酶特异性结合的配体[9].磁性颗粒作为一种酶或靶标蛋白的固定载体[10,11],已用于筛选具有酶抑制活性的化合物,如Marszałł等[12]使用键合黑色素的磁珠筛选先导化合物;Liu 等[13]使用键合牛血清蛋白(BSA)的磁性纳米氧化铁颗粒从野葛花中筛选BSA 的配体;Qing 等[14~16]使用键合人血清白蛋白(HSA)的磁珠从穿山薯蓣和黄山药中筛选可与HSA 结合的薯蓣皂苷,还在磁珠表面键合α⁃葡萄糖苷酶和蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B),并从石榴皮中筛选出了α⁃葡萄糖苷酶和PTP1B 的抑制剂;Yasuda 等[17]制备出表面包被SIRT6的磁性颗粒,并从胡芦巴种子提取物中筛选出SIRT6抑制剂.但迄今采用脂肪酶键合磁珠筛选脂肪酶抑制剂的研究仍鲜见报道.

本文选择脂肪酶作为筛选靶标,采用磁珠收集与液相色谱⁃质谱联用(LC⁃MS)结合的方法从枳壳提取物中筛选潜在的脂肪酶抑制剂,为快速发现中药药效物质提供了一种新的研究思路.

1　实验部分

1.1　试剂与仪器1.1.1　样品与试剂　枳壳总黄酮提取物购自长沙康尔佳制药集团有限公司;脂肪酶(提自猪胰酶)㊁1⁃乙基⁃3⁃(3⁃二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)㊁2⁃(N ⁃吗啡啉)乙磺酸(MES)㊁N ⁃羟基琥珀酰亚胺(NHS)㊁4⁃甲基伞形酮油酸酯和柚皮苷均购自Simga 公司;羧基磁珠(粒径1.05μm,浓度10mg /mL,密度1.8g /cm 3)购自Invitrogen 公司;橙皮苷和新橙皮苷购自上海融禾医药科技发展有限公司;枸橘苷

购自上海同田生物技术股份有限公司;其它试剂均为分析纯.1.1.2　实验仪器　Agilent 1100型液相色谱系统(美国安捷伦科技有限公司),包括二元高压泵㊁自动进样器㊁柱温箱和二极管阵列(DAD)检测器;Finnigan LCQ Deca XP plus 离子阱质谱仪,配有电喷雾(ESI)电离源和Xcalibur 1.3工作站(美国Thermo Finnigan 公司);Spectramax M2酶标仪(北京九宇鑫

泰生物技术有限公司);FTIR⁃4100型傅里叶变换红外光谱仪(日本Jasco 公司).1.1.3　LC⁃MS 分析条件　Agilent SB⁃C 18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm).流动相A:水(含体积分数为0.1%的甲酸);流动相B:乙腈.洗脱梯度:B 相在0~50min 从10%线性升到20%;50~65min,线性升到55%;65~75min,线性升到60%;75~90min,线性升到95%.流速1mL /min,柱温30℃,进样量20μL,UV 扫描范围为190~400nm.

质谱采用负离子模式检测,喷雾电压4.5kV,源内裂解电压15V,加热毛细管温度为350℃,鞘气和辅助气均为氮气,流量分别为9和3L /min.扫描方式为一级㊁二级全扫描,扫描质荷比范围m /z 100~2000.1.2　实验过程1.2.1　键合脂肪酶磁珠的制备　参照文献[18]方法,取100μL 羧基磁珠(10mg /mL),用等体积的25mmol /L MES 溶液(pH =6.0)清洗2次,振荡混匀10min 后弃去上清液.把EDC 快速溶解在冷的25mmol /L 的MES 溶液(pH =6.0)中至浓度为50mg /mL.用25mmol /L MES 溶液(pH =6.0)配制50mg /mL 的NHS 溶液.在清洗后的磁珠上加入50μL EDC 溶液和50μL NHS 溶液,混合均匀,在室温下缓慢倾斜旋转孵育30min.孵育后,将其置于磁铁上4min,移除上清液,使用100μL MES 溶液(25mmol /L,pH =6.0)清洗2次.在活化后的磁珠上,加入60μL 溶解在25mmol /L MES 溶液(pH =6.0)中的脂肪酶(1mg /mL),加入40μL 25mmol /L MES 溶液(pH =6.0)至最终体积为100μL,振荡混合均匀,于4℃缓慢倾斜旋转孵育过夜.孵育后,将其置于磁铁上4min,移除上清液.使用300μL Tris 溶液(50mmol /L,pH =7.4,含0.25%BSA)冲洗包被的磁珠3次,将包被的磁珠重新分散在PBS 缓冲液中.同时设置空白对照组,即制备未键合脂肪酶的空白磁珠用于筛选,其余操作同上.

1.2.2　红外光谱分析　采用傅里叶变换红外光谱测定空白磁珠㊁脂肪酶及键合脂肪酶的磁珠的红外光谱,表征其性状.1.2.3　枳壳中脂肪酶抑制剂的筛选与鉴定　称取10mg 枳壳总黄酮,加入1mL Milli⁃Q 超纯水,超声15min,以10000r /min 转速离心5min,吸取上清液备用.取20μL 上清液,加入180μL 脂肪酶磁珠分散的PBS 溶液(5mg /mL)中,振荡混匀,孵育1h.然后将其置于磁铁上,使磁珠与溶液分开,弃去上清液,使用300μL Milli⁃Q 水清洗3次,每次振摇15min.最后使用含10%(体积分数)乙腈的PBS 溶液,使脂肪酶变性,将配体洗脱下来,置于磁铁上静置后吸取上清洗脱溶液用于LC⁃MS 分析.同时设置空白对照,将空白磁珠与枳壳总黄酮孵育,其余操作同上,吸取最后的上清洗脱溶液用于LC⁃MS

分析.

1.2.4　体外脂肪酶抑制活性验证　参照文献[19]方法,对具有脂肪酶结合能力的4个配体化合物进行体外脂肪酶抑制活性验证.其中,底物4⁃甲基伞形酮油酸酯浓度为0.1mmol /L,脂肪酶浓度为1mg /mL,缓冲液使用13mmol /L Tris⁃HCl,150mmol /L NaCl 和1.3mmol /L CaCl 2配制,并用HCl 调节pH 值为8.0.3962　No.12　陈　锥等:磁珠富集与液相色谱⁃质谱联用结合筛选枳壳中脂肪酶抑制剂