体外培养细胞转化

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格里菲斯体外转化实验过程

格里菲斯体外转化实验是一种常用的分子生物学技术，用于将外源DNA导入到细菌细胞中。

这种方法是由赫伯特·W·格里菲斯于1928年首次描述的，后来被称为“格里菲斯实验”。

以下是格里菲斯体外转化实验的基本步骤：1.准备接受细胞：首先，需要选择合适的宿主细胞，通常使用大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌。

这些细菌通常是在培养基中生长并具有较高的转化效率。

2.制备DNA样品：接下来，需要准备含有外源DNA的样品。

这些DNA样品可以是纯化的质粒DNA、线性化的DNA片段或基因组DNA。

DNA样品通常在实验室中通过DNA提取、PCR扩增等方法获得。

3.制备质粒DNA：如果使用质粒DNA作为外源DNA，需要将质粒DNA经过适当的处理（如线性化）以提高转化效率。

4.转化实验：将目标细菌细胞与外源DNA混合，并将其暴露于特定的条件下，使DNA能够进入细胞内。

通常，这个过程需要通过热激冲（heat shock）、电穿孔（electroporation）或化学法（如钙离子诱导法）等方法来实现。

5.恢复生长：转化后的细菌需要在适当的培养条件下进行恢复生长，以使转化的DNA在细菌中复制和表达。

这通常涉及将细菌转移到富含培养基的琼脂平板上进行培养。

6.筛选与鉴定：为了确定转化是否成功，通常会使用选择性培养基或基因标记来筛选转化细胞。

成功的转化通常会导致表达外源基因或表型改变，可以通过PCR检测、酶切分析、蓝白斑筛选等方法来鉴定。

总的来说，格里菲斯体外转化实验是一种常用的方法，用于将外源DNA导入到细菌细胞中，并使其在细菌中复制和表达。

通过这种方法，研究人员可以研究基因功能、基因调控、蛋白表达等多个方面的生物学问题。

低密度脂蛋白对体外培养的肾小球系膜细胞表型转化的影响

脂蛋白对体外培养的肾小球系膜细胞表型转化的影响
姜晓刚王旭粘洪晓张丽。孔灵玲李永华崔文朱任之
（理学教研室莱阳市第二人民医院中医学教研室营养学教研室兰州大学）病
提要目的通过低密度脂蛋白（Ｌ的刺激，ｕ））观察ＬＬ对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表型转Ｄ化的诱导作用。方法采用不同浓度的ＬＬ０２，０１０１０ｇｍ１Ｄ（，５５，０，５ｔ／）￣刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞的水平，以台盼蓝染色检测ＬＬ对系膜细胞的毒性作用，Ｔ比色法检测细胞增殖，ＤＭＴ透射电镜观察系膜细胞的形态学变化，免疫细胞化学染色及Ｗｅｅｌ检测ａＳｓｒｂｔｔｎｏ — ＭＡ、ＴＦＩ型胶原及ＦＣＧ、ＶＮ的表达。结果在ＬＬ作用下，置显微镜下细胞变为长梭形，Ｄ倒透射电镜下细胞表面微绒毛减少。免疫细胞化学染色及Ｗｅｔｒｌ显示ａｓｎｂｔｅｏ一、Ｔ、ＶＣＧＦＩ型胶原及ＦＮ表达增强。结论在ＬＬ刺激下，Ｄ系膜细胞可以发生表
型转化。
关键词低密度脂蛋白；系膜细胞；型转化；表纤维化肾小球硬化是多种肾脏疾病终末期的最终归孔底时换无血清ＲＭＩ６０Ｐ４培养液培养２ｈ使多１４，
数细胞同步于静止期后分为下列各组：１正常对照（）组（Ａ组）（）５ｇｍｌＤ，２２ｔ／Ｌ组（￣ＬＢ组）（）０￣／，３５ｔｍｌｇＬＬ组（ＤＣ组）（）０ｔ／Ｄ组（组）（），４１０￣ｍｌＬＬｇＤ，５１０ｇｍｌＥ组）于培养后２ｈ３ｈ和４ｈ收集５ｔ／组（￣，４，６８与肾脏纤维化的关系成为肾脏病学研究中的热点，细胞，台盼蓝染色，进行活细胞计数。但多集中于肾小管上皮细胞与肾间质的关系上２，２Ｊ细胞增殖水平测定：实验步骤同上，细胞同步后而对其能否促进体外培养的ＭＣ发生表型转化则分为５，Ｓ组并设阴性对照组（不加刺激因素，加入等缺乏研究。本实验拟用低密度脂蛋白（ｏｅｓｙ１ｗｄｎｉ量培养液）空白对照组（加细胞，入等量培养ｔ及不加ｌｏｒｔｎｕ））ｉｐｏｉ，Ｌ作用于体外培养的ＭＣ，ｐｅｓ于细胞水液）接种于９孔培养板，，６于孵箱中培养２ｈ４ｈ和４、８平观察其能否诱导ＭＣ发生表型转化及其对细胞７ｈ，Ｓ２后加入ＭＴ１ｔ／Ｌ３℃继续培养４，Ｔ０孑，７Ａｈ终止生长和功能的影响。培养，吸弃孔内上清液，加入ＤＯ０／Ｌ振荡ＭＳ９ｔ孑，Ａ１材料和方法１ｍｎ充分溶解结晶物，０ｉ，于酶联免疫检测仪上选择１１实验材料．４０ｍ波长，定各孔吸光度Ａ值。９ｒｉ测胎牛血清（杭州四季青生物公司）胰蛋白酶（，西细胞形态学观察：倒置相差显微镜观察细胞表安华美生物公司）小鼠抗大鼠ａＭＡ单克隆抗型转化过程中的形态变化，， —Ｓ透射电镜观察其超微结体，兔抗大鼠ＣＧ、Ｎ、ＶＴＦＦＩ型胶原单克隆抗体，构改变。ＳＢＡＣ试剂盒及Ｗｅｅｌｔｇｓｒｂｔｎ检测试剂盒（ｔｎｏｉ武汉免疫细胞化学染色：将盖玻片预先置于６孔培博士德生物公司）ＬＬ中国医学科学院基础医学养板内，，Ｄ（然后将ＭＣ以５０个／ｌＳ ×１ｍ接种于６孔板研究所生化室）ＲＭＩ６０ＧＢＯ公司），Ｐ４（ＩＣ１。内，以含１％ＦＳ的ＲＭＩ６００ＣＰ４培养液培养２ｈ１４，１２实验方法：．换无血清培养液使多数细胞同步后，将其进行同上细胞培养：大鼠肾小球ＭＣ引自中山大学医学分组，Ｓ培养７后，ＳＢｄ行ＡＣ法免疫细胞化学染色。院，经鉴定后用于本实验。实验中肾小球ＭＣ细胞以已知阳性结果为阳性对照，ＰＳ代替一抗为阴Ｓ以Ｂ株以含１％胎牛血清（０Ｃ）ＲＭＩ６００１％ＦＳ的Ｐ４培性对照。结果以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性信１养液，３ ℃ ，％Ｃ２和孵箱内培养。每２ｄ号，置７５Ｏ饱～３阴性为无着色。高倍镜下（０ ×４０倍）观察２００换液和传代。当细胞长至贴壁８％～９％且台盼个细胞，出ａＭＡ染色阳性的细胞数。００数 —Ｓ蓝染色活细胞达９％以上时，含１％ＦＳ的Ｒ．５将０ＣＰＷｅｔｒｌｔ定ａ一ｓｅｎｂ测ｏ、ＴＣＧＦ蛋白表达：ＭＩ６０４培养液完全吸出，１换成由不含胎牛血清的收集经不同浓度ＬＬ刺激的生长状态良好的培养ＤＲＭＩ６０Ｐ４培养液配制的不同浓度的ＬＬ０２，７的ＭＣ，１Ｄ（，５ｄＳ加细胞裂解液后离心，取上清，测定蛋白５，０，５ｔ／）继续在孵箱内培养，０１０１０ｇｍ１，￣中间换液浓度。加上样液于１％ＳＳ聚丙烯酰胺凝胶进行０Ｄ一及传代时继续用上述因素刺激。电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上，％脱脂奶粉５细胞毒性实验：取消化后的ＭＣ以每孔５０Ｓ ×１封闭，加小鼠／兔抗大鼠ａＭＡ或ＣＧ —ＳＴＦ一抗孵个／ｌｍ接种于１孔培养板，４后细胞接近于铺满育，２２ｈ４ ℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠／兔

一、肿瘤细胞体外培养的重要性

5．培养基
在癌细胞建系中，选择性培养基的应用是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细胞生长的关键技术改进。选择培养基是针对特殊细胞生长的营养要求设计的。针对癌细胞的特点，选择性培养基应含少量血清。
血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因此用低或无血清培养基为好。改良RPMI-1640培养基可提高癌细胞存活。
在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中 EGFR的含量极高，Artrazeneca公司的研究人员于1998年率先提出通过开发阻断EGFR的药物，
可以抑制肿瘤的生长，这种全新的疗法就是现在
的靶向性疗法，它没有毒副作用，不会杀死正常
细胞，按照这种思路，基因技术公司开发出一种治疗晚期乳腺癌的药物Herceptin，并于1998年获准上市。Herceptin是一种单克隆抗体药物，靶向HER-2，这种药物能使只有5个月寿命的晚期乳腺癌病人继续生存。为什么Herceptin成功获准，
由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅）的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。
Astrazeneca公司的肺癌药Iressa等都是靶向药物，靶 EGFR，但成功的只有 Herceptin。Iressa 只在 1 0 ℅ 肺癌患者中有神奇作用，但在大规模的临床试验中90℅ 人无效。花3亿美元，10年时间，未获批准。
肿瘤发生发展结局的机理研究进入分子水平，人类最终认识肿瘤才可以征服肿瘤。若癌变的始发变化
是基因活动的调控失常，癌变就具有潜在的可逆行，就可以为肿瘤治疗开辟一个完全新的途径—控制调控机制；若癌变的本质是基因突变，那就意味着癌变不可逆，只有了解其突变的部位，只有通过基因治疗，而所有这种机理的研究，其中一个重要的手段是通过肿瘤细胞的体外培养进行研究。虽然体外培养不能完全反映体内情况，但为单因素、多因素研究提供模型。

MMT

实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间接反映活细胞数量。

ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其OD值

预பைடு நூலகம்结果：

淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等）

培养细胞的细胞生物学(体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生

培养细胞的细胞生物学（体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。

因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。

实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。

且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。

细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。

恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。

2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。

细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如 Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。

除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。

另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。

2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。

t淋巴细胞转化实验报告

t淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验是一种体外培养方法，用于研究免疫细胞对不同物质的反应，包括抗原、细菌、病毒等。

本实验采用人体外周血淋巴细胞作为材料，通过添加激动剂使其转化为体外培养的淋巴母细胞，然后进行免疫学研究。

本报告将对本实验的过程和结果进行描述和分析。

实验步骤1.收集外周血从正常成年人的静脉血收集外周血，将其分装到离心管中。

用 PBS 冲洗红细胞，使淋巴细胞纯化后采集上清液。

2.细胞数计数采用血细胞盘进行计数，每个实验需要约 4-6万个淋巴细胞，取相应数量的细胞用1640 培养基含有 10% 胎牛血清的细胞密度中稀释。

3.淋巴细胞培养将稀释的淋巴细胞在细胞密度2 × 10^5/ml 的情况下播种在 96 或 48 孔板的深孔中，然后加入不同的激动剂，如激活剂、抑制剂、细胞因子等，同时添加乙酰溴芬酸作为负对照组。

4.腺病毒载体转染在淋巴细胞培养的第 2，3 天，加入适量的腺病毒载体（MOI 为 50），接种24 h 后用媒介液冲洗并更换新的培养液，然后让细胞继续培养。

5.淋巴细胞功能检测对于 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，通过检测它们的增殖和检测分泌的细胞因子的表达来评估激动剂的效应。

在体外转化过程中，通过荧光PCR技术检测核因子-κB 和JAK/STAT 信号通路的激活。

实验结果本实验采用血细胞盘计数，每个实验需要约 4-6 万个淋巴细胞。

将这些细胞培养在96 或 48 孔板的深孔中，添加不同的激动剂，保持在合适的细胞密度。

添加适当的激动剂，可以在淋巴细胞转化的过程中发现一系列的细胞反应，如细胞增殖，细胞因子的分泌等。

实验分析本实验是一项重要的免疫学研究方法，可以用于检测免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞）对外来物质的反应。

适当地添加激动剂，可以诱导免疫细胞在体外转化成淋巴母细胞，从而在体外模拟免疫反应过程。

在本实验中，采用了血细胞盘计数，这是一种传统的细胞计数方式。

肿瘤细胞体外培养的重要性

癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因
素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、基因调节包括细胞周期基因和癌基因、cAMP 和cGMP浓度（前者对细胞增殖负调节，而后者为相反）。
正常细胞周期的G1期有一个特殊的调节点—R点，在生长条件不适宜情况下，细胞不能通过调节点而不增殖，细胞通过G1期进入M期前受一种不稳定蛋白质调节通过R点启动DNA的合成，例如抑癌基因 P53最重要的生物学功能就是通过调控细胞周期监测点来维持基因组的稳定性，当细胞DNA受损时，P53 诱导细胞周期终止或凋亡，而P53突变或缺失使P53 功能失活则导致基因组紊乱，产生细胞转化。
由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅）的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。
肿瘤对化疗和放疗抗性的一种机制是由于P53突变或P53的缺失，人类癌50 % P53 突变
Non small cell lung
60 %
Colon
50 %
Breast
40 %
Head and neck
60 %
Ovarian
60 %
②制备单克隆抗体，主要是靶向表皮生长因子 EGF受体EGFR和HER-2。80年代研究人员发现，
当前较有前景的靶向治疗
①现在发展的基因工程腺病毒（ONYX015）因删除了E1B 55KD蛋白而可以选择性的溶解P53突变或缺失的肿瘤细胞，此类肿瘤细胞占50℅，也就是腺病毒 ONYX-015可达到50℅的靶向治疗药物的效果，目前已在头颈部肿瘤中进行Ⅱ期临床试验。
当前较有前景的靶向治疗
一、肿瘤细胞体外培养的重要性
恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括癌细胞系和转化细胞系。转化细胞系可以是恶性转化细胞和一般转化细胞两种。

鸡骨髓源树突状细胞体外转化培养

关键词：鸡；树突状细胞；新城疫病毒中图分类号：￥８５２．６５．５文献标识码：Ａ
文章编号：１００５ — ８５６７（２０１７）０１－００３４ — ０３
ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓｉｎＶｉｔｒｏ
ＩＬ．４．ａｎｄｔｈｅｎｗｅｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｈａｔｔｃｈｉｃｋｅｎｂｏｎｅｍａ￣ｏｗ
ＨｅＪｉｎｇｙｉ，ＬｕｏＣｈｅｎｇｌｏｎｇ ’
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＢｒｅｅｄｉｎｇ＆ＧｕａｎｇｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，
ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｇｒａｄｕａｌｌｙｒｏｇｗｎ的ｍｈｅｔｒｏｕｎｄｂａｌｌｔｏｈｅｔｓｈａｐｅａｆｔｅｒ４ｄａｙｓｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇ．ｎｄａｈｅｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｈｏｒｔａｎｄｓｏｍｅｓｒｅｔｔｃｈｅｄｏｕｔｉｎ４０ｔｉｍｅｓｏｆｈｅｔｌｅｎｓａｔｆｅｒ６ｄａｙｓｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄｈｅｔｅｅｌｌｖｏｌｕｍｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｈｅｔｓｈａｐｅｂｅｃａｍｅｍａｔｕｒｅａｔｆｅｒｈｅｔＮＤＶｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｏｓｕｍｕｐ．ｈｅｔｍｅｔｈｏｄｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｌａｒｇｅｎｍｂｕｅｒｏｆｃｈｉｃｋｅｎＤＣｓｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．

IL-1β对体外培养MRC-5细胞增殖、表型转化的影响

IL-1β对体外培养MRC-5细胞增殖、表型转化的影响张和;金龙腾;林立;虞秀飞;王丽;李昌崇【摘要】目的探讨外源性白介素-1β(IL-1β)对体外培养的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)表型转化的影响.方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),以不同浓度IL-1 β(0、0.1、1、5、10ng/ml)刺激48h和同一浓度(10ng/ml) IL-1β刺激不同时间(0、24、48、72h);采用CCK-8法检测细胞增殖情况,半定量反转录聚合酶链式反应法(RT-PC R)、Western blot检测细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白水平.结果 IL-1β以浓度和时间依赖性方式调节MRC-5细胞α-SMA mRNA和蛋白表达.结论 IL-1β可能通过促进肺成纤维细胞增殖和肺成纤维细胞-肌成纤维细胞的细胞表型转化,促进气道炎症后的重塑进程.%Objective To observe the effect of cell proliferation and phenotypic differentiation on MRC -5 stimulated with IL - 1(5 in vitro. Methods MRC - 5 were cultured in vitro after stimulation either with different concentrations (0 ,0. 1,1,5 , lOng/ml) of IL - 1 β for 48h, or with the same concentration (l0ng/ml) for different time (0, 24, 48, 72h). Then cell proliferation, the expression of a -SMA - mRNA and protein were detected by CCK - 8 cell proliferation assay, semi - quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT -PCR) and Western blot. Results IL - lβ induced cell proliferation, the gene expression and protein production of a -SMA on MRC -5 in vitro. Conclusion Lung fibroblasts may play an important role in the process of airway remodeling after inflammao-tion, by the means of upgrading cell proliferation and phenotypic differentiation after simulation of IL - lβ.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2013(042)002【总页数】4页(P37-40)【关键词】细胞表型转化;α-平滑肌肌动蛋白;白介素-1β;肺成纤维细胞【作者】张和;金龙腾;林立;虞秀飞;王丽;李昌崇【作者单位】325027 温州医学院附属育英儿童医院呼吸科;325027 温州医学院附属育英儿童医院呼吸科;325027 温州医学院附属育英儿童医院呼吸科;325027 温州医学院附属育英儿童医院呼吸科;325027 温州医学院附属育英儿童医院呼吸科;325027 温州医学院附属育英儿童医院呼吸科【正文语种】中文支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病，气道重塑是慢性哮喘的主要病理生理特征之一，重塑的病理改变最终导致气道高反应性(AHR)、持续性气流阻塞、不可逆的肺功能损害。

高中生物体外转换实验

一、噬菌体侵染细菌的实验（赫尔希和蔡斯）1、实验材料：（1）T2噬菌体是一种专门寄生在大肠杆菌体内的病毒。

（2）T2噬菌体的结构和化学组成：T2噬菌体的头部和尾部的外壳都是由蛋白质构成的，头部内含有DNA，如图所示（3）T2噬菌体增殖的特点T2噬菌体侵染大肠杆菌后，会在自身遗传物质的作用下，利用大肠杆菌体内的物质来合成自身的组成成分，进行大量增殖。

T2噬菌体侵染大肠杆菌的过程吸附→注入→复制（合成）→组装→释放①吸附→T2噬菌体利用尾部的末端吸附在大肠杆菌表面②注入→T2噬菌体将DNA注入大肠杆菌细胞中，T2噬菌体的蛋白质外壳则留在大肠杆菌细胞的外表面③复制（合成）→在大肠杆菌体内T2噬菌体，以自身DNA为指导，利用大肠杆菌体内的物质合成自身的DNA 和蛋白质④组装→新合成的DNA和蛋白质外壳，组装出很多个与亲代相同的子代噬菌体2、体内转化实验中细菌数量变化曲线分析在肺炎链球菌体内转化实验中，将加热致死的S型细菌与R型细菌混合后注射到小鼠体内，小鼠体内S型活细菌，R型活细菌数量的变化情况：1、R型活细菌数量变化（1）、ab段：小鼠体内还没形成大量的抗R型活细菌的抗体，固该时间段内活细菌数量增多。

（2）、bc段：小鼠体内形成大量的抗R型活细菌的抗体，故使R型活细菌数量减少。

（3）、cd段：c点对应时间点之前，已有少量R型活细菌转化为S型活细菌，S型活细菌能降低小鼠的免疫力，使小鼠对R型活细菌的杀伤力减弱，导致R型活细菌大量繁殖，所以cd段R型活细菌数量增多。

2、S型活细菌数量变化少量R型活细菌获得了S型细菌的DNA，并转化为S型活细菌，S型活细菌有多糖类荚膜的保护，能在小鼠体内增殖，而且随着小鼠免疫力的降低，小鼠对S型活细菌的杀伤力减弱，S型活细菌增殖加快，数目增多。

肺炎链球菌转化实质是：S型细菌的DNA片段整合到R型细菌的DNA中，使受体细胞获得了新的遗传信息，即发生了基因重组。

肺炎链球菌转化效率：主要与DNA纯度有关，纯度越高转化效率就越高。

淋巴细胞转化实验

LOGO
细胞数/ml＝细胞数＝
4大格中细胞总数大格中细胞总数 4
×104 ×稀释倍数
ConA的倍比稀释的倍比稀释
Original sample tube Original sample tube
tube 1
tube 2
220µL
220µL
450µL
220µL
440µL
10ug/ml
5ug/ml
LOGO
实验流程－－结果观察－－结果观察
Kit-8)法原理同ＭＴＴ（三）CCK-8(Cell Counting Kit-8)法:原理同ＭＴＴ CCKＭＴＴ的升级替代产品的升级替代产品，法。是ＭＴＴ的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。的毒性低。掺入法： TdR即胸腺嘧啶核苷即胸腺嘧啶核苷，（四）3H-TdR 掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA 合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA 合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA 合成的原料。细胞合成的DNA越多， DNA越多合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR 就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。 MTT比较就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。
分离人外周血单个核细胞（分离人外周血单个核细胞（PBMC））分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术分离人淋巴细胞磁珠分离，流式细胞术) 磁珠分离淋巴细胞转化试验
LOGO
实验流程－－PBMC的分离－－的分离
基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞 1.092 （淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090； 1.075 Ficoll比重为1.077±0.001。 Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于比重为1.077 分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。悬浮于血浆和分层液的界面层中。

淋巴细胞转换实验报告

一、实验目的本次实验旨在通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，观察并分析淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，从而了解细胞免疫的功能和状态。

二、实验材料1. 实验试剂：- 外周血采集管- RPMI-1640培养基- 胎牛血清- 植物血凝素（PHA）- 青霉素-链霉素溶液- 0.25%胰蛋白酶- 台盼蓝染液- 计数板- 显微镜2. 实验仪器：- 酶标仪- 培养箱- 水浴箱- 移液器- 微量离心机三、实验方法1. 外周血采集：采集受试者外周血，将采集管置于室温下静置2小时，使红细胞自然沉降。

2. 淋巴细胞分离：将上层血浆转移至新的离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10分钟，然后加入胎牛血清终止消化。

3. 淋巴细胞洗涤：将消化后的细胞悬液离心洗涤，去除未结合的细胞碎片和红细胞。

4. 淋巴细胞培养：将洗涤后的淋巴细胞悬液转移至培养瓶中，加入适量的RPMI-1640培养基和PHA，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时。

5. 淋巴细胞计数：培养结束后，用台盼蓝染液对淋巴细胞进行染色，计数活细胞数量。

6. 淋巴细胞转化率计算：计算转化细胞的数量与总细胞数量的比值，即为淋巴细胞转化率。

四、实验结果1. 淋巴细胞数量：实验组淋巴细胞数量显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞增殖。

2. 淋巴细胞转化率：实验组淋巴细胞转化率显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞转化。

五、实验分析1. 淋巴细胞转化实验结果显示，PHA刺激可以显著促进淋巴细胞增殖和转化，这与淋巴细胞在免疫反应中的作用相符。

2. 实验结果表明，淋巴细胞转化率可以作为评价机体细胞免疫功能的一个重要指标。

六、实验结论本次实验通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，成功观察到了淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，为研究细胞免疫功能提供了实验依据。

七、实验注意事项1. 实验过程中，需严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。

草鱼头肾淋巴细胞体外转化培养影响因素的研究

收稿日期:2001-09-03基金项目:广东省高教厅攻关课题(600264)作者简介:唐　玫(1964-),女(汉族),安徽合肥人,工程师,硕士.文章编号:1000-5463(2001)04-0005-04草鱼头肾淋巴细胞体外转化培养影响因素的研究唐　玫1,马广智2(1.华南师范大学生物技术研究所,广东广州510631;2.华南师范大学生物学系,广东广州510631)摘要:从草鱼(Cteno pharyngo den idellus )头肾中分离淋巴细胞,利用DME M 培养液,采用MTT 比色法,测定草鱼头肾淋巴细胞在体外受特异有丝分裂原植物凝集素(PHA )刺激下发生的转化率,研究在细胞培养过程中不同因素对淋巴细胞转化率的影响,以期建立一种较可靠的鱼类免疫学研究技术.实验表明,头肾淋巴细胞体外增殖受PH A 浓度、小牛血清浓度及温度条件影响.PHA 的最佳质量浓度为80mg /L ,小牛血清的最佳体积分数为15%,最适温度范围是28-30℃.实验结果还表明,采用MTT 比色法测定鱼类淋巴细胞体外转化率是一个既方便又可靠的方法.关键词:草鱼;头肾;淋巴细胞;转化率中图分类号:Q256;S942 文献标识码:A 鱼类的肾脏分为头肾(Pr onephros )、中肾(Mesonephros )和后肾(Opisthonephr os )3部分.在肾脏的发育过程中,头肾失去排泄功能而成为重要的免疫器官[1].头肾中存在大量淋巴细胞,离体培养淋巴细胞受到特异有丝分裂原植物细胞凝集素(PH A )的刺激后,可产生免疫应答,刺激淋巴细胞转化[2].由于这种转化是与机体的免疫机能有关的,因此,淋巴细胞转化率被用作评价机体免疫功能的指标.建立鱼类头肾淋巴细胞体外转化的实验方法,对研究鱼类免疫功能是非常有意义的,此方法已作为哺乳动物免疫功能的常规检测方法,在鱼类免疫研究中,不同因素对头肾淋巴细胞的免疫应答转化效应的影响尚未见报道.本文研究从草鱼(Ctenopharyn -goden idellus )头肾分离淋巴细胞,探讨PHA 质量浓度、小牛血清体积分数及培养温度对鱼头肾淋巴细胞体外转化率的影响,以期建立一种方便可靠的鱼类免疫学研究技术.1　材料与方法1.1　实验动物草鱼购自广州南海鱼场,平均体质量为50-70g ,实验前均在室内养殖池中静养15d 以上.1.2　试剂与仪器基础培养基:采用DME M 培养基(购自Sigma 公司),内含有HEPE S 15mmol /L ,青霉素100单位/mL ,连霉素100μg /mL .MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol -2-yl )2,5-diphenyltetrazolium ]:购自Sigma 公司,用PB S 配制成5g /L ,新鲜配制,滤菌后备用.2001年11月 Nov .2001 华南师范大学学报(自然科学版)J OURNAL OF SOUTH CHINA NORM AL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION ) 2001年第4期　No .4,2001PHA(植物细胞凝集素):购自广州医药工业研究所.酶标仪:BIO-550型,波长570nm.1.3　草鱼头肾淋巴细胞的分离参照Sovenyi等[3]的方法稍加改动.将草鱼用体积分数为70%的酒精体表消毒,在无菌条件下取出头肾,在Hank氏液中用剪刀剪碎后,轻轻吹打,100目尼龙网过滤后,制成细胞悬液,用Hank氏液洗涤2次,加入基础培养基,使细胞最终含量为2×106个/mL.1.4　实验方法采用MTT比色法,测OD570值,以刺激指数(Stimulation index,SI)[4]判断淋巴细胞转化程度.SI=试验孔OD均值/对照孔OD均值.1.4.1　不同质量浓度的PHA对草鱼头肾淋巴细胞体外转化的影响在完全培养液中头肾淋巴细胞用含体积分数为15%小牛血清的DMEM培养基进行培养,在96孔细胞培养板上进行,培养共分8组,每组12孔,PHA质量浓度分别为0(对照组)、5、10、20、40、80、160、320mg/L,置于28℃,5%CO2培养箱,培养66h后,加入5g/L的MTT10μL,再培养4h,终止培养,小心吸去培养液,加入二甲基亚砜100μL,溶解由细胞代谢MTT而产生的蓝色沉淀,在酶标仪上(吸收波长为570nm)测吸光值(OD570).1.4.2　不同体积分数小牛血清对草鱼头肾淋巴细胞体外转化的影响实验分8组,每组细胞转化的刺激因子PHA的最终质量浓度为80mg/L,小牛血清的体积分数为0(对照组)、2%、4%、8%、10%、15%、20%、25%,置28℃,5%C O2培养箱中,其它步骤同上,72h后测吸光值.1.4.3　不同温度对草鱼头肾淋巴细胞体外转化的影响实验在PHA质量浓度(80mg/L)和小牛血清体积分数(15%)保持一定的条件下,细胞分别放置14、18、25、30、35和37℃培养箱内培养,每一温度设一对照组,对照组为不加PHA的培养液培养.其它步骤同上,72h后测吸光值.2　结果与分析2.1　不同质量浓度PHA对草鱼头肾淋巴细胞体外增殖的影响实验结果表明,头肾淋巴细胞在体外增殖程度与PHA的质量浓度在一定范围内呈正相关(图1).当PH A的质量浓度偏低(5、10mg/L)时,对淋巴细胞基本上无促进增殖作用,随着质量浓度的增加,PHA的刺激作用逐渐增强,80mg/L时刺激指数达到最大,与对照组比较有明显差异(P<0.05),但增加到320mg/L时,增殖效果明显下降.分析原因可能是PHA质量浓度过大,对淋巴细胞体本身已构成伤害.邵健忠等[7]的研究也表明体外PHA质量浓度为100 mg/L时对草鱼白细胞有较高的毒性.2.2　不同体积分数小牛血清对草鱼头肾淋巴细胞体外增殖的影响实验结果表明在无血清和低体积分数血清(0-4%)情况下,头肾淋巴细胞在体外尽管有刺激因子存在也不增殖,显微镜观察发现只有少量细胞有变形现象,但存在大量死亡细胞.当体积分数为8%时,细胞开始增殖,达到15%时,PHA的刺激指数最高(图2).这表明头肾淋巴细胞受到PHA的刺激后可被激活,但在缺乏小牛血清或小牛血清体积分数较低时,细胞没有发生分裂,并且大量细胞死亡.可能是因为小牛血清除可提供细胞增殖所需的养份,还含有很多种不可缺少的能维持细胞生长增殖的成分.随着体积分数升高,细胞有足够的营养和多刺激因子的作用开始增殖,当小牛血清达到15%时刺激指数达到最大,可见小牛血清在维持草6鱼头肾淋巴细胞生命及增殖过程中是必不可少的.这与李亚南等[5]的草鱼外周血淋巴细胞体外转化实验的结论相一致.图1　不同PHA 质量浓度对草鱼头肾淋巴细胞体外转化的影响Fig 1　The effect of concentration of PHA on lymp hocytetransformation of head kidney in vitro　a P <0.05,compared with controlgroup 图2　不同体积分数小牛血清对草鱼头肾淋巴细胞体外转化的影响Fig 2　The effect of concentration of NCS on lymphocyte transformation of head kidney in vitro b P <0.01compared with controlgroup2.3　不同温度对草鱼头肾淋巴细胞体外增殖的影响从图3可看出,温度变化对草鱼头肾淋巴细胞的体外转化也有很大的影响,当PHA 和小牛血清的含量处于最佳时,14-18℃培养的细胞增殖程度与对照组无显著差异,对细胞的刺激指数保持在一个较低的水平,温度上升到25-37℃时,细胞增殖程度与对照组有显著差异,而且随着温度的变化有一个上升后又下降的趋势,刺激指数在30℃时达到最大.温度过高(35-37℃)时刺激指数开始下降.分析原因,低温时可能是细胞对PHA 的刺激敏感性较低或细胞的自身代谢能力较低而使得细胞的增殖能力较低,温度适宜时,刺激作用随温度升高而加强,当超出鱼类细胞培养的适宜温度时,刺激作用又开始下降.杨先乐等的研究也表明,草鱼的免疫应答反应存在一个适宜温度范围,当温度处于适宜范围内,草鱼的免疫应答处于较高水平,而当温度超出了它的适宜生长温度,其免疫应答反而呈下降趋势.但他认为在适宜生长温度范围内,免疫应答一般不再随温度的变化而变化[6].这一最适温度与哺乳动物的相比是有差异的,哺乳动物淋巴细胞体外转化的最适温度为37℃.图3　不同温度对草鱼头肾淋巴细胞体外增殖的影响Fig 3　The effect of temperature on lymphocyte trans formation of headkidney in vitro a P <0.05,b P <0.01compared wit h controlgroup 3　结论头肾淋巴细胞体外转化实验是研究鱼体免疫能力及药物或毒物对鱼免疫力影响的重要手段,因此获得体外最佳转化实验条件是非常有意义的.从本实验研究表明,在头肾细胞的体外转化培养中,PHA 、小牛血清、培养温度是重要的因素,这3个因素在草鱼头肾细胞培养过程中的最佳值是PHA 为80μg /mL ,温度为30℃,小牛血清体积分数为15%.除此之外,其它因素如pH 、培养时间、培养细胞的起始浓度等也都会影响体外细胞的增殖情况,值得进一步研究.目前对鱼的免疫细胞体外培养条件的研究国内外均有少量报告,多局限于单因子的研究,对于血7清浓度的作用结果大致相同,最适温度在20-32℃.但对于PHA质量浓度的作用,不同学者的研究差距较大,Ya mamoto等(1973年)培养肾脏细胞采用的PHA最终质量浓度为60mg/L[2];李亚南等(1996年)在研究不同质量浓度PHA刺激草鱼外周血淋巴细胞体外转化时,认为最适剂量为500mg/L[5],而邵健忠等(2001年)结果显示,质量浓度为100mg/L的PHA对草鱼白细胞有较高的毒性,能使细胞在短时间内死亡[7].这可能与不同年龄的鱼对PH A的敏感性不同或与不同厂家生产的PHA质量、纯度不同有关,具体原因也值得做进一步深入研究.自1983年,Mosman利用MTT比色法测定哺乳动物淋巴细胞转化率获得成功,此种方法逐渐被推广应用.楠田等(1996年)采用MTT比色法测定鱼师(Se riola quinqueradiata)的离体淋巴细胞转化率,获得了良好的结果[8].本研究结果也证明了采用MTT比色法对草鱼头肾淋巴细胞转化率的测定具有操作简便、客观、结果重复性好的特点.参考文献:[1]　张永安,孙宝剑,聂　品.鱼类免疫组织和细胞的研究概况[J].水生生物学报,2000,24(6):648-654.[2]　Yamamoto K,Ojima Y.A PHA-culture method for cells from the renal tissue of teleosts[J].Jpn J Glenet,1973,48(3):235-238.[3]　Soven yi J F,Kusuda R.Kinotics of in vitro phagocytosis by cells from head-kidney of common carp[J].Cyprinuscarp io Fis h Path,1992,22:83-92.[4]　沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科学技术出版社,1998.302.[5]　李亚南,陈全震,邵健忠,等.草鱼外周血淋巴细胞体外转化诸因素的研究[J].海洋与湖沼,1996,27(4):380-385.[6]　杨先乐,左文功.水温与草鱼免疫应答关系的研究[J].动物学报,1997,43(1):42-48.[7]　邵健忠,项黎新.PHA体外诱导草鱼白细胞产生γ-干扰素的研究[J].海洋与湖沼,2001,32(2):117.[8]　楠田理一,赤松纪彦.MTT比色定量法を用ぃづリのリンパ球の增殖能の测定[J].水产增殖,1996,44(4):433-437.STUDIES ON SOME ELEMENTS OF TRA NSF ORMATION OF LYMPHOC YTES FR OM HEAD-KID NEY OF GRASS C ARP(CTENO PHARYNGO DEN IDELLU S)TANG Mei1,MA Guang-zhi2(1.Biotech R es earch Ins titute of South China Normal Universit y,Guangzhou510631,China;2.Department of Biology,South China Normal Universit y,Guangzhou510631,China)A bstract:Lymphoc ytes were separated from head-kidney of grass carp(Ctenopharyngoden idellus)and incubated in DME M medium.Stimulation indexes of lymphocytes from the head-kidney stimulated by PHA were deter mined by MTT colorimetry.The influence of the concentration of PHA(5,10,20,40, 80,160,320mg/L),concentration of calf serum(CS)(2%,4%,8%,10%,15%,20%,25%) and temperature(14,18,25,30,35,37℃)on the stimulation indexes were studied.The aim was to set up a method in investigation fish immunity.The r esults showed that the optimum concentration of PHA was80mg/L,the optimum concentration of CS was15%and the optimum temperature was30℃.The result also sho wed that the MTT colorimetry was suitable for measuring the transfor mation of lymphocytes from head-kidney in grass carp.Key words:grass carp(Ctenopharyngoden idellus);head-kidney;lymphocyte stimulation index【责任编辑　黄玉萍】8。

淋巴细胞转化实验报告

一、实验目的本实验旨在了解淋巴细胞转化的基本原理，掌握淋巴细胞转化实验的操作方法，并通过对实验结果的分析，评估机体细胞免疫功能。

二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到某些刺激物（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）的作用下，发生增殖、分化，转化为淋巴母细胞的过程。

淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法之一。

通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。

三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 试剂与耗材：植物血凝素（PHA）、小牛血清、培养液、显微镜、计数板、移液器、离心机等。

四、实验方法1. 采集小白鼠血液，分离淋巴细胞。

2. 将分离得到的淋巴细胞加入含有PHA的培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48小时。

3. 培养结束后，收集细胞，用固定液固定细胞，进行染色。

4. 在显微镜下观察淋巴细胞形态变化，计数淋巴母细胞数量。

5. 计算淋巴细胞转化率。

五、实验结果1. 观察到淋巴细胞在培养过程中，部分细胞体积增大，核染色质疏松，核仁明显，胞浆丰富，呈嗜碱性，符合淋巴母细胞特征。

2. 计算淋巴细胞转化率，本实验中淋巴细胞转化率为60.2%。

六、实验讨论1. 淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法，通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。

2. 本实验中，淋巴细胞转化率为60.2%，说明小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。

3. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。

七、结论本实验通过淋巴细胞转化实验，成功观察到了淋巴细胞在体外培养过程中的转化现象，并计算出淋巴细胞转化率。

结果表明，小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。

八、注意事项1. 实验操作过程中，应严格遵循无菌操作原则，防止污染。

2. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。

3. 实验结果的分析应结合临床实际情况，综合评估机体的免疫功能。

体外培养的细胞生物学特点

生物学特点
体外培养物的细胞生物学特点
总的：
与体内仍有相似-体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系但有不同相对孤立、相对单一失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显
体外培养物的细胞生物学特点
与体内仍有相似-体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系体外培养单个细胞也能生存和增殖但单个细胞不是细胞永久存在的形式, 培养的细胞之间仍有在形态和机能上的相互依存关系
细胞的粘附、贴壁和铺展
5.培养液的温度低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁
促进细胞粘附的成分
铺展
铺展（伸展） (spread)
进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为铺展状况制约细胞的分裂增殖活动
过程，细胞先由圆形变为
圆饼形(放射状铺展细胞) 逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞
极性细胞就是各种有机体细胞
○ 当再加入血清细胞又生长
说明血清可消除密度抑制
(2)转化细胞的密度抑制降低
①用此培养液 3T3细胞不再分裂增殖 ②当再加入10％血清， 3T3细胞可再增殖表示血清可消除密度抑制 ③但当用此培养液，于转化的3T3细胞 (SV3T3) 却生长良好表示转化细胞密度抑制降低 (血清需要降低)
说明：转化细胞的密度抑制降低. 可生长至较高的密度
主要表现
失去原有组织结构和细胞形态如：肌肉细胞—纤维化分化减弱或不显出现类似‚返祖‛现象：细胞趋向单一化或获得不死性或变成具有恶性性状的细胞群因此要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体
培养细胞的主要的生物学特点
1.去分化
2. 贴壁和铺展
3. 接触抑制和密度依赖性
去分化

医学免疫学实验：T 淋巴细胞转化试验

T 淋巴细胞转化试验一、实验目的学习并掌握T淋巴细胞转化方法。

二、实验原理T 细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。

淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。

淋巴细胞转化试验结果的读取可以有形态计数法、MTT 法和同位素法三种。

MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。

MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。

小鼠脾细胞受到ConA（刀豆蛋白A）作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸-异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570 nm。

根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

三、实验材料1. ICR 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）2. RPMI 1640 培养液，Hank's 液3. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI 1640 液配成1 mg / ml，分装小瓶，冷冻保存4. MTT (1mg/ml, 溶于pH 7.2 的PBS 中)5. 2.5%碘酒、75%酒精6. 无菌尖吸管和刻度吸量管7. 无菌解剖器械8. 96 孔平底培养板9. 5% CO2 培养箱（美国NAPCO 公司产品）10. 酶标测定仪（美国BioRad 公司产品）四、实验步骤1. 小鼠脾细胞悬液的制备：取一个灭菌的平皿，加入5 ml Hank's 液。

颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。

取出100 μl用于计数。

将其余细胞悬液移入一离心管中，离心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10 min）弃去上清，用RPMI 1640 培养液稀释，制成2.5 × 10^6 / ml 的脾细胞悬液，然后加入ConA 使每孔最终浓度为2 μg / ml，同时做不加ConA 的阴性对照孔。

晶体上皮细胞体外培养及转化的研究

难治性青光眼属眼科领域最为棘手的问题．包括新生血管性青光眼、晶体或人工晶体眼、症性无炎青光眼、虹膜角膜内皮综合征、皮植入继发性青光上眼、角膜移植术后或视网膜玻璃体术后继发青光眼、
角膜缘周围结膜广泛瘢痕形成的青光眼、多次小梁手术失败以及长期依赖佩戴接触镜的青光眼患者ｌｌｌ房水引流物植入术已经被成功地应用于难治性青光
眼的治疗Ａｍｄ青光眼房水引流阀由一ｓａｔｈｅｉｓｃ管ｌｉ联结于椭圆形聚丙烯板所组成．聚丙烯板的前表面
积为１４２３８ｍｍ（ｍｍ￣６ｍ．门由两片对压力敏１１ｍｅ青光眼阀治疗难＇性青光眼的作用和现状．Ａｍｄ冶
因常为术前患眼接受过多次手术（角膜内皮已存在
损害）术后长期前房迟缓形成．引流管与角膜内皮接
膜失代偿１．麻痹性内斜视伴有复视（眼术后３个
月）１眼。３讨论
触．持续的前葡萄膜炎症反应。本组发生ｌ麻痹性例斜视复视考虑为术后筋膜囊与眼肌周围组织过度炎症反应组织增生，导致局部瘢痕组织挛缩．响眼外影肌的运动而引起斜视及复视本组ｌ新生血管性例青光眼术后眼压持续不降可能与管内段阻塞有关临床实践证明Ａｍｄ引流阀植入术可作为对难ｈｅ
３１）ｍＨ．．１ｍｇ末次随访（５８＋．７ｍｇ其中１１．４１）ｍＨ。５只

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体外培养细胞转化
体外培养细胞转化
体外培养细胞转化
第二节诱变因素的选择
本节内容: 一、诱变剂的选择二、细胞的选择三、目前常用的细胞种类
体外培养细胞转化
一、诱变剂的选择
要根据体外培养的细胞而定，这可能与细胞对某种诱变剂的敏感及其特异受体的存在有关，因此，实验时要根据细胞特性来选择合适的诱变剂。
第12章体外培养细胞的转化
体外培养的细胞，有时会发生自发转化，但这种自发产生的转化时间长，转化率极低，需用大量细胞，必须用人工诱发的方法。
人工诱发体外培养细胞转化，转化细胞所需时间短，转化率较高，这对研究癌变原理，研究可疑致癌因素的作用有很大的实用价值。
体外培养细胞转化
第一节基本概念和原理
阴性。（3）、体外传代细胞系最好选用已失去二倍体核
型，已获无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致瘤性的细胞系。
体外培养细胞转化
三、目前常用的细胞种类
(一)原代细胞：动物细胞以叙利亚幼地鼠和金黄色地鼠胚胎纤维细胞或幼地鼠肾细胞为佳；人源细胞取自胚胎、小儿包皮及成人真皮纤维细胞和淋巴细胞等。
体外培养细胞转化
四、细胞转化的基本过程
１.诱发(Initiation)阶段２.DNA的损伤与修复阶段
３.“转化灶”的产生
体外培养细胞转化
１.诱发(Initiation)阶段
诱变剂直接接触细胞（6小时以上最高不超过24 小时），诱变剂种类多如：
物理因素：如放射线、温度、电磁波、药物等化学因素：如甲基胆蒽、土醌80、7.12—二甲基
诱变处理和转化阶段
传代所需倍增代数
用致癌剂处理
1
DNA突变的固定和表达
6
筛选和突变克隆形成（转化灶）
12
克隆生长达2×106细胞（克隆扩大培养）
12
传代、克隆再生长，以备研究需要
2
克隆化（纯化）冻存
24 共57代（约三个月）
体外培养细胞转化
二、转化灶的分离
1、刮除法(1)先在有转化灶的瓶壁上用记号笔圈出记号，倒掉培养基。
(3)用完全培养基混匀沉淀细胞接种，37℃ 5% CO2培养。数日后，转ห้องสมุดไป่ตู้细胞迅速增殖成新的细胞群。
转化：只是遗传特性、生长特性、生物学性状改变，但无致瘤性
恶变：是细胞癌性变，有致瘤性
体外培养细胞转化
三、细胞转化的方式
１．细胞自发转化：体外培养的细胞在无任何诱变剂存在的条件下，细胞自发出现的转化现象。
２．人工诱发转化(人工诱变)：在体外培养的细胞中，常因化学、物理和生物等各种致癌因素的影响，而使细胞发生转化，转化周期大大缩短，转化率高。
NO1658)； 6、Rat-1； 7、PC-12（ATCC、CRL、 NO1721）； 8、CHO细胞系；9、V79细胞系
体外培养细胞转化
第三节细胞的转化和转化灶的分离纯化
本节内容: 一、细胞的转化二、转化灶的分离三、转化细胞的筛选
体外培养细胞转化
一、细胞的转化
表１２-１诱发突变细胞的细胞转化过程
苯醌(DMBA)、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌(MMS)、乙基甲磺酸(EMS)、乙基亚硝基脲(ENC)、甲基硝基亚硝基胍类化合物等；生毒物、因多素发，瘤如病毒毒素(P、oli黄om曲a)霉、素逆、转病病毒毒S等V40、EB病促癌剂(Promotor) ：如TPA
体外培养细胞转化
２.DNA的损伤与修复阶段
(5)成单层后，再用消化传代法进行扩大培养。
体外培养细胞转化
2、加套消化法(1)先在瓶壁上用记号笔圈出转化灶，弃掉瓶内培养液，选生长状态良好的转化灶，用小不锈钢环或玻璃环或硅橡胶圈，沾少许无菌明胶(不用亦可)套在转化灶上。
(2)向圈中滴入0.25%胰蛋白酶充分消化后，用弯头吸管把胰蛋白酶与细胞一同吸出，加入3倍新鲜完全培养基混合后，立即低速离心弃上清。
人胃上皮细胞人淋巴细胞
适宜用SV40病毒转化；适宜用EB病毒转化；
地鼠肾细胞
适宜用多发病病毒(Polioma)转化；
C3H小鼠胚纤维细胞适宜化学致癌物转化。
体外培养细胞转化
二、细胞的选择
选用细胞的原则为：（1）、体外容易培养和传代，克隆形成率高，并
能建立细胞系。（2）、细胞本身无自发转化能力，动物致癌试验
修复过程中发生修复错误，引起DNA结构的改变，细胞发生了遗传性改变。
体外培养细胞转化
３.“转化灶”的产生
进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分(大约5%左右)，这些细胞称为癌前细胞(Precancerous Cell)，均散在未受损伤的细胞中，随着细胞的继续培养，那些未受损伤的正常细胞由于接触抑制的限制而停止运动，细胞分裂消失，但那些散在的癌前细胞由于失去了接触抑制，加上生长繁殖速度变快，而进行持续不断的分裂增殖，由于在局部癌前细胞的数量增多而堆积，呈厚厚的多层排列，最后形成了明显可见的“转化灶”(Focus)，常见有灰白细胞堆积中心点和放射排列的灶（见书后照片）
体外培养细胞转化
(二)传代细胞系 1、C3H/10T1/2(ATCC、CCL、NO226) 2、3T3-Swiss albsho(ATCC CCL NO92) 3、BALB/3T3(ATCC CCL NO163)等 4、BHK21(ATCC CCL NO10) 5、NIH/3T3-Swiss Mouse(ATCC、CRL、
(2)再用胶皮刮(或用加热的微型电烙器具)在倒置显微镜下去除未发生转化的圈外正常细胞。
(3)向瓶内加入PBS洗去刮下的细胞，再用0.25％胰蛋白酶 (或0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA1:1混合)置室温消化。
(4)待被消化的细胞略有松动时，翻转瓶底，继续消化，至细胞松散时，弃去消化液，加入新鲜的10%小牛血清的培养基，中止消化，并反复用吸管吹打分散，制成细胞悬液，分瓶培养。
本节内容: 一、细胞转化的基本概念二、细胞转化与恶变的区别三、细胞转化的方式四、细胞转化的基本过程
体外培养细胞转化
一、细胞转化的基本概念
细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式，由限定性细胞系转变成连续性传代细胞系，获得了永生化。
体外培养细胞转化
二、细胞转化与恶变的区别