肿瘤干细胞的研究进展

课程考核论文课程名称：肿瘤干细胞的研究进展成绩：肿瘤干细胞的研究进展摘要：肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力和分化潜能，能产生异质性细胞的细胞。

本文简要阐述了肿瘤干细胞的来源、分离技术及鉴定，并对以肿瘤干细胞分化、临床应用前景和问题进行了综述。

关键词：肿瘤、干细胞、应用肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)理论认为，肿瘤组织中绝大多数细胞增殖能力有限，不能自我更新，不会导致肿瘤的复发、转移；CSC只占肿瘤细胞中的极少部分，却是肿瘤发生、发展的关键。

CSC研究有可能阐明肿瘤的发生机制，使肿瘤治愈，从而引发肿瘤学领域的革命性变革，意义重大。

本文拟就CSC 的起源和鉴定等作一简要综述。

一、肿瘤干细胞的来源肿瘤干细胞起源目前有两种学说：(1)由于正常干细胞突变形成肿瘤干细胞；(2)一些已经开始分化的原始细胞或成熟细胞去分化变为幼稚细胞并具有分裂能力。

Sell 认为恶性肿瘤的产生和发展是由于干细胞的分化受阻，而不是成熟细胞的去分化；干细胞是起始事件或“第一次打击”(即获得永生性)突变的靶标，干细胞本身具有永生性，只需获得异常增殖的突变即可；体细胞的突变不会形成肿瘤，是因为成熟细胞的半衰期短，一个正常细胞形成转化细胞至少需要几年至几十年，在促进事件或”第二次打击”(即获得异常增殖能力)，细胞通常早已死亡。

尽管缺乏直接的实验证据，但也有研究人员认为CSC是正常SC同其他细胞融合的结果。

因为骨髓细胞容易与其他类型的细胞发生融合，Marx等_6认为，Houghton等在胃上皮细胞观察到的骨髓细胞是骨髓细胞与上皮细胞融合所形成的。

细胞融合因子CD 是乳腺癌干细胞的阳性标记，暗示CSC可能具有与其它细胞融合的能力。

Bjerkvij等观察到在病理条件下，SC和已经出现肿瘤相关基因突变的细胞发生融合，这种融合后的细胞具有sC的特性。

胚胎干细胞是指胚胎内细胞团或原始生殖细胞，具有发育全能性，在理论上可以诱导分化为机体内所有类型的细胞，在体外可以大量扩增、筛选、冻存和复苏而不会丧失其原有的特性。

有研究人员认为肿瘤中存在一些具有增殖和分化潜能的细胞，该细胞与正常组织细胞有着相似的自我更新途径，可能是正常SC分化停滞的结果。

Karoubi[8 研究证实肺腺癌与正常肺组织均表达共同的胚胎SC标记物OCT4A和OCT4B，提示CSC是胚胎SC起源的可能。

二、肿瘤干细胞的分离与培养肿瘤干细胞的分离及体外培养是进行肿瘤干细胞生物特性研究的首要步骤。

目前还没有很成熟或经典的分离方法，不少实验室通过各种不同的途径完成了这一工作，归纳起来主要是利用肿瘤干细胞表面分子标记物和生物特性实现的。

肿瘤干细胞的分离方法主要有2种，一种是荧光激活细胞分选法(fluorescence—activated cell sorting，FACS)，因为实际分离过程中要使用流式细胞仪，所以也称为流式分选法；另一种是磁性激活细胞分选法(magnet—ic-activated cell corting，MACS)。

荧光激活细胞分选法中使用了经荧光素标记的抗体，可以通过调节电压，用流式细胞仪将与抗体结合和未结合的细胞分离开。

已采用该方法从乳腺癌、肝癌、大鼠胶质瘤等肿瘤中分离得到了肿瘤干细胞。

另外有些肿瘤干细胞表面存在一些特异的膜蛋白，如CD117、CD133、CD34、CD44、CD24等，用不同激发波长的荧光素标记的单克隆抗体标记单细胞悬液后，可用FACS分选到肿瘤于细胞，如AML干细胞。

FACS法收集到的肿瘤干细胞纯度较高，但为了肿瘤干细胞的后续培养，要求无菌的实验条件。

肿瘤干细胞与包被有相应特异分子标记物的单抗结合，经过磁性分离柱，与磁珠结合的细胞吸附在分离柱上，细胞表面无无特异分子标记物的肿瘤细胞则被洗掉。

通过MACS法分离了多种肿瘤干细胞，如以抗CD133抗体包被的免疫磁珠分选到Hep一2细胞系中的肿瘤干细胞。

MACS法分选得到的肿瘤干细胞纯度较低，但对细胞的生理功能影响较小，在后续培养中成活率较高f9]。

三、肿瘤干细胞的特性与鉴定3.1 肿瘤干细胞的生物学特性3.1.1 肿瘤干细胞具有干细胞的特性：肿瘤干细胞的概念首先是基于肿瘤细胞和正常干细胞之间的相似性而提出的。

肿瘤组织中存在一小群具有干细胞性质的细胞群体，它们与干细胞一样，均有自我更新能力和多向分化的潜能，以及相似的生长调控机制。

肿瘤干细胞具有自我更新的能力，因此在体外缺乏生长因子的条件下仍然生长迅速；它们表达某些干细胞的标志，如CD133、CD90、CD44、ABCG 等，表达调节干细胞自我更新、多向分化和增生路径的相关因子，如Wnt／13一cate—nin，Notch，Hedgehog ／SMO，Bmi，以及Oct3／4。

3.1.2 肿瘤干细胞具有肿瘤细胞的特性：除了具有干细胞的性质，CSCs还具有肿瘤细胞的性质。

这是肿瘤干细胞不同于正常干细胞的根本所在。

肿瘤干细胞的染色体核型为多倍体，而正常千细胞为二倍体细胞。

并且肿瘤干细胞在接种后具有高成瘤和高转移的特性。

在目前的文献报道中，最低100个CSCs就能在NOD／SCID鼠成瘤…，这种能力是一般肿瘤细胞所不具备的。

3.2 肿瘤干细胞的鉴定3.2．1 TSC的鉴定分离出来的细胞均需通过鉴定，确定是否为我们研究所需的TSC。

目前尚难从形态学鉴定TSC，只能从功能学角度来分析TSC。

TSC的功能学鉴定内容包括自我更新和多向分化能力，但TSC的最终确定必须考察其致瘤性。

TSC的鉴定包括体内和体外实验两个方面。

3.2．2 体外实验体外实验包括细胞球培养法和克隆形成实验。

研究发现，任脑肿瘤，乳腺癌，前列腺癌等实体瘤组织中，TSC在含生长因子的SFM(无血清维持干细胞未分化状态，添加的生长因子则能促进TSC的增殖)中能快速增殖形成细胞球，且将细胞球打敞重悬制成单细胞悬液，能够连续传代形成细胞球，此培养特性反映了细胞的自我更新能力和无限增殖能力。

细胞球细胞住不同诱导条件下可分化为不同细胞，反映1r TSC的多向分化潜能。

最近，Zhong等报道，人视网膜母细胞瘤组织中存在能够形成非黏附性细胞球样的未分化细胞，具有无限增殖能力，在体外诱导下可形成不同的视网膜细胞，并且注入SCID小鼠眼内可诱发肿瘤形成。

克隆形成实验可反映TSC的自我更新能力和无限增殖特性，并且间接反映细胞的致瘤能力；而其他肿瘤细胞不具有形成克隆或连续形成克隆的能力。

Gou等…在含有多种生长因子的无血清DMEM／F12培养基中培养人胰腺癌细胞株PANC一1，10到14天后形成细胞球，将其打敞制成单细胞悬液利用克隆形成实验检测到其体外高度增殖能力，并用RT—PCR检测r多种蛋白mRNA表达量，结果提示L Y6E(淋巴细胞抗原6复合体E)、TACSTD1(肿瘤关联钙信号转导因子1)和CD44可作为胰腺癌f：细胞的表面标志进行表型分离。

2．2体内实验体外实验虽可定程度L反映TSC的生物学功能，但最终需通过动物体内实验以确定其致瘤能力。

动物实验的一般方法是将分离纯化的细胞异种移植到具有免疫缺陷的小鼠身L，观察能否形成肿瘤以及肿瘤体税大小和形成所需时问，从而判断致瘤能力的大小。

所选免疫缺陷小鼠丰要何裸小鼠、SCID小鼠、NOD／SCID 小鼠等，但裸小鼠和SCID小鼠仍然具仃一定的免疫功能，会造成异种移植肿瘤形成的差异，故NOD／SCID是目前最为理想的研究TSC致瘤能力的动物模型。

最近，Dalerba等l1 从人结肠癌组织中分离出免疫表型为(EpCAM) g ／CD44 的肿瘤细胞异种移植到NOD／SCID小鼠身上，成功诱发肿瘤形成。

动物致瘤成功除与细胞的致瘤能力有关以外，还与接种途径与部位、动物种类等因素有关。

如John等”。

将人结肠癌CD133 细胞经肾下被膜移植到预先经放射线照射的NOD ／SCID小鼠身J：成功诱发肿瘤，建立r值得信赖的人结肠癌异种移植模型。

四、肿瘤干细胞研究在临床治疗上的启示肿瘤干细胞理论对治疗观念的更新有重要的意义。

首先，传统治疗的对象是肿瘤的整体。

通过手术消减瘤体，药物杀灭肿瘤或抑制生长，均是这一理念的体现。

但大多数肿瘤细胞并无肿瘤源性，其生长依赖于少量干细胞样的细胞。

而目前的治疗并未有效地攻击这些细胞。

其次，许多化疗药物靶向正在分裂的细胞。

但干细胞大多处于休眠状态，即处于有丝分裂的静止期，偶尔进行分裂。

这可能使肿瘤干细胞与其它肿瘤细胞对化疗药物的敏感性上存在着差异。

Costell等证实，CD34 CD38。

白血病细胞对柔红霉素的敏感性明显低于CD34一CD38 肿瘤细胞。

Cuzman等研究表明人自血病干细胞对阿糖胞苷的抵抗力强于其它白血病细胞。

这些现象可能与干细胞上的多种运载蛋白(如ABC运载蛋白)的功能相关j。

上述因素均降低了疗效，导致肿瘤复发。

对肿瘤的新认识，可促使新的治疗方法出现。

将治疗的重心转向肿瘤干细胞，在信号途径的研究中寻找新的诊治靶点是方向之一。

需要注意的是，对于血液系统、肝脏、肠道、中枢神经系统等重要器官，其治疗既要面向肿瘤干细胞，又要保护正常的干细胞。

这一思路的可行性在于，已有研究观察到个别化疗药物既可杀灭白血病干细胞而又不破坏正常的造血干细胞。

而另外一些器官，如子宫、乳腺及前列腺等，暂时可不考虑正常干细胞的保护问题，应成为优先研究的方向。

从肿瘤干细胞理论考虑治疗问题，诱导分化亦是思路之一。

设法改变微环境，诱导肿瘤细胞向正常细胞分化可以达到治疗的目的。

目前，诱导分化的方法大多是对肿瘤细胞进行化学干预。

如维甲类化合物对人类白血病有良好的分化诱导作用。

但化学药物的毒副作用、药物耐受等等都是亟待解决的问题。

而寻找正常组织内诱导干细胞分化的物质亦是待探索的领域之一。

五、展望传统治疗策略的制定是将肿瘤组织看为一个整体来进行的，忽略了肿瘤组织内存在各种结构、功能不一的细胞亚群这一事实。

由于肿瘤干细胞在肿瘤复发中具有的关键性作用，以及肿瘤干细胞对多种治疗手段具有更强的保护机制，这些新的情况要求我们在肿瘤治疗领域的研究开始转向探讨如何清除肿瘤组织内的肿瘤干细胞，而不仅仅满足于肿瘤细胞杀伤率的提高。

下阶段几个方面的研究是非常重要的：(1)找到更有效的肿瘤干细胞特异性治疗靶点。

(2)如何在清除肿瘤干细胞的同时尽可能不影响正常组织干细胞。

(3)阻止肿瘤组织内其他的分化肿瘤细胞转变成为肿瘤干细胞。

一旦肿瘤干细胞的生物学特性及其致瘤机制得到了详尽阐明，临床肿瘤防治的方式必将得到根本性的改变，CSC将成为人类癌症治疗的新靶标。

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