放线菌抗生素的发酵与目的产物的提取实验报告

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取

一、实验目的

1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法

2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法

3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论

4、了解小型发酵罐的基本结构

5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养

6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；

7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。

8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术

二、实验原理

①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。

②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临

床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。

③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。

抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。

常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比

例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。

（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式2.10-1)

V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)

式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；

UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；

SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；

SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；

（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3) 式中：θ：供试品和标准品的效价比；

D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1

I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。

⑶求出Pr ：Pr = Ar×θ(式2.10-4)

式中：Pr：供试品实际单位数；

Ar：供试品标示量或估计单位

④甲醛滴定法测定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物，使NH3+上的H+游离出来，这样就可

用碱滴定NH3+放出的H+，从而计算出氨基氮含量。如样品中只含有某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果即可算出氨基氮的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质的水解程度，随着水解程度的增加，滴定值增加，当水解完全后，滴定值保持恒定。

甲基红的变色范围是PH4.4~6.2,意思是说:

1.其pH值在4.4~6.2区间时,呈橙色,

2.其pH值≦4.4时,呈红色,因是靠近酸性强的一边时的颜色,故又称之为酸色。

3.其pH值≧6.2时,呈黄色，因是靠近碱性强的一边时的颜色,故又称之为碱色

二、仪器与材料

（一）培养基

高氏一号培养基：

可溶性淀粉20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g

K2HPO40.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g

蒸馏水1000ml，PH 7.4，

发酵瓶培养基：

①淀粉3%,葡萄糖2%,黄豆饼粉2.5%,蛋白胨0.5% ,

酵母粉0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%,KH2PO4, 0.03%,

CaCO3 0.4%, PH 6.0。

②黄豆饼粉4g,淀粉10g,酵母粉0.25 g ,蛋白胨1.5g,

MgSO40.025 g, CaCO3 0.4g,(NH4)2SO40.3 g,

α-淀粉酶（105u/ml）0.01ml. 100ml PH7.4-7.6

③可溶性淀粉2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O 0.05g，FeSO4.7H2O 0.001g，

加蒸馏水至100ml，PH 7.4，

牛肉膏蛋白胨

牛肉膏(5.0g），蛋白胨（10.0g），NaCl（5g），蒸馏水（1000mL），pH 7.2~7.4 发酵罐培养基(2L)：

黄豆饼粉80g 淀粉200g

酵母粉 5 g 蛋白胨30g

MgSO40.5 g CaCO38g

(NH4)2SO4 6 g

Ɑ-淀粉酶（105u/ml）0.2ml

（二)流加补料

碳源：葡萄糖（10%）300ml,控制1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸铵（10%）250ml,控制16%

调PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH

（三)分析指标及方法所用试剂及溶液

①测残糖-DNS法

1.3，5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：将6.3g的3，5二硝基水杨酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶