细胞组织培养重点

体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。

细胞培养：培养物是单个细胞或细胞群。

细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。

器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法体内外细胞分化的差异：“反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。

不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。

（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）。

生存条件改变使分化阻抑。

脱分化或去分化：细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失去储存肝糖原能力）。

是基因突变所致培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。

细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。

细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。

细胞独立生存性差。

传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。

这一过程称为传代。

否则将影响细胞的继续生存。

组织培养细胞生命期：原代培养期传代期衰退期细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。

无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。

核型大多变成异倍体。

克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。

克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群冻存配方：向培养液中加入DMSO或甘油，封与安瓶，存于温度达-196℃液氮中长期储存连续细胞系：获得持久性增殖能力的细胞群体。

细胞获得永生性或称为恶性性，而获得不死性的细胞核型大多变成异倍体，接触抑制消失“一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。

与细胞倍增一代不是一个含义。

在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段：潜伏期：接种——经过——悬浮期（细胞质回缩，胞体呈球形）——贴壁初代培养细胞经过10~24h或更多连续细胞系和癌细胞系经过10~30min指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。

是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。

持续3-5天。

停滞期/平顶期：细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。

表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平。

特点：细胞不增殖,有代谢活动。

培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH 降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。

细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。

条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。

接触抑制：细胞相互接触抑制细胞运动的现象。

肿瘤细胞没有此现象培养细胞生存环境、条件和代谢：一、无污染环境二、温度：37℃耐低温不耐高温三、气体环境和pH：95%氧气+5%二氧化碳pH 7.2~7.4 耐酸不耐碱HEPES：防止pH迅速变动，维持pH恒定四、培养细胞生存所需基本物质1、糖2、氨基酸3、各种维生素4、促生长因子* ：血清*5、其他物质五、渗透压谷胺酰胺的作用：可促进各种氨基酸进入细胞膜。

所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；是合成3，2和一磷酸腺苷时所需物;是能源和碳的来源。

谷胺酰胺在溶液中不稳定，应放置在－20℃冰箱保存，用前加入培养液内。

已含有谷胺酰胺的培养液在4℃冰箱内可放置两周以上时重新加入原来量的谷胺酰胺。

增加难培养细胞成功率的物质：促生长因子：培养液除营养成分外，也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。

胰岛素(1~10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基酸；氢化可的松(10-8~10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率；其它物质：在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰、钼钒等。

培养基种类分为半固体和液体两类。

液体培养基又可分为合成、天然和无血清培养基血清的主要作用提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。

补充培养液中没有或量不足的营养成分。

含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。

提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。

有中和毒性物质保护细胞不受伤害。

提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。

饲细胞(Feeder cells)：也称为滋养细胞，用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但能存活和有代谢活动。

将其作为底物，其它细胞接种上面；饲细胞的代谢产物也有利于其它细胞生长。

用于特殊难培养细胞，注意避免用同源细胞。

体外培养细胞成功率分析成功的关键:培养物必须贴附在底物上细胞生长和增殖一、组织和细胞的供体年龄二、培养条件三、贴附底物四、培养方法：酶消化分离细胞培养中应培养哪些液体：水：不含内毒素和有机污染物最好用玻璃或石英蒸馏器制备的三蒸水放置不超过2周Hanks’平衡盐溶液：钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用D-Hanks培养基：合成培养基滤过消毒DMEM (高糖和低糖）低糖对肿瘤细胞有力。

增加了各成分的用量HamF12 和Mc-Coy5A 多用于难培养的细胞。

2-巯基乙醇作用：（1）能诱导细胞增殖；（2）避免过氧化物对培养细胞的损害。

生长培养液血清10%-20% 维持液血清2%-5%消化液：胰蛋白酶溶液：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。

胰酶溶液在pH8.0，温度为37℃时，作用能力最强。

注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力，故胰酶溶液常用无钙镁的D-Hanks’平衡盐溶液配制。

常用浓度为0.25% 或0.125%。

-20℃冰箱中保存EDTA·4Na 溶液：螯合二价离子，对细胞有一定的离解作用，而且毒性小。

常用工作液浓度为0.02%。

通常与0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1 混合使用（混合液）。

注意：使用EDTA 处理细胞后，一定要用Hanks 液冲洗干净EDTA 溶液配制：用无钙、镁的D-Hank’s 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，室温或4℃冰箱保存胶原酶溶液：对细胞间质等胶原具有很强的消化作用，常用于消化上皮组织、纤维性组织和癌组织等。

不受钙、镁影响。

常用浓度为0.1-0.3mg/mlpH 调整液：NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。

4℃冰箱或室温保存。

消毒：紫外线消毒、湿热消毒、干热消毒、滤过消毒、高压消毒冷冻保存要点：（1）冷冻过程要缓慢。

需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。

有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。

（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。

（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。

（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。

目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。

但是，有些细胞系不能用DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。

冻存特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。

也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。

（2）DMSO 稀释时会释放大量热量。

因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

（3）DMSO 必须是细胞培养级别的。

新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。

避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。

并可减少污染机会。

如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。

冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。

冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。

（2）解冻操作过程动作要轻。

由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。

一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到25－30ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除DMSO。

如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。

传代培养法细胞生长增殖形成单层后进行传代1、吸除培养瓶内旧培养液2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液，以能覆盖平底为限。

3、显微镜下观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大，立即终止消化4 吸出消化液，加入Hanks液吹打5 计数细胞大鼠大脑皮层神经组织细胞培养新生大鼠1-2日龄，碘酒、洒精消毒。

取出大脑，分离脑膜，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用D-Hank’s冲洗二遍。

剪碎，0.5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去残血加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水370C浴箱中消化20-25分钟。

终止消化离心洗涤1000转/分，5分钟弃上清。

吹打制成细胞悬液。

台盼兰染色计数后接种于事先涂好多聚赖氨酸培养板中。

37℃5%CO2培养2天后换生长培养液原代培养法1、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

3、将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶溶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。