微载体上MRC_5细胞扩大培养的研究_陈余娟
芡实提取物对D_半乳糖衰老小鼠学习记忆障碍的改善作用
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芡实提取物对 D － 半乳糖衰老小鼠学习记忆障碍的改善作用
沈 蓓 吴启南 陈 蓉 王新胜 袁冬平 伍城颖 陈广云 （ 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046）
〔摘 要〕 目的 观察芡实不同提取物对 D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响及其作用机制。方法 将昆明种小鼠随机分为 8 组，即对 照组、模型组、芡实乙醇提取物高低剂量组、芡实乙酸乙酯提取物高低剂量组、芡实正丁醇提取物高低剂量组。分别采用旷场装置和 Morris 水迷宫装 置测试各组小鼠的自主活动状况及学习记忆能力，同时测定各组小鼠脑组织一氧化氮合成酶（ NOS） 、谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-Px） 、乙酰胆碱酯酶 （ AChE） 的活性。结果 芡实乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物均能浓度依赖性地改善亚急性衰老小鼠的学习记忆能力，提高脑组织 NOS、GSH-Px 活力，降低 AChE 活力。结论 芡实乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物具有改善小鼠衰老状态的作用，其机制可能与其能促进机体清除脂 类过氧化物，增强脑组织抗氧化能力，改善胆碱能系统在学习和记忆中的作用有关。芡实正丁醇提取物的作用优于乙醇提取物，乙醇提取物的作用 优于乙酸乙酯提取物。
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中国老年学杂志 201次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得 到乙酸乙酯浸膏，干燥备用。芡实正丁醇提取物的制备： 称取 芡实整粒 2 000 g，用 8 倍量水饱和正丁醇，回流提取 2 次，每次 8 h，合并提取液，减压浓缩为浸膏。临用前用生理盐水配成所 需浓度。 1. 2. 2 动物分组及给药 将昆明种小鼠随机分为 8 组，每组 13 只，分别为对照组、模型组、芡实乙醇提取物高、低剂量（ 500、 250 mg·kg － 1 ·d － 1 ） 组、芡实乙酸乙酯提取物高、低剂量（ 300、 150 mg·kg － 1 · d － 1 ） 组、芡实 正 丁 醇 提 取 物 高、低 剂 量 （ 100、 50 mg·kg － 1 ·d － 1 ） 组，以上三种提取物高、低剂量分别换算成 生药量均一致。模型组和给药组每日上午腹腔注射 D- 半乳糖 500 mg·kg － 1 ·d-1 ，空白组注射等量生理盐水，下午给药组分 别灌胃相应浓度的药物，空白组和模型组分别灌胃等量的生理 盐水，给药量均为 0. 1 ml /10 g，连续 42 d，并用旷场和 Morris 水 迷宫装置测试模型制备的成功。 1. 2. 3 旷场实验 各组小鼠给药 42 d 后，将其置于旷场中 央，开始计时，用 Anymaze 动物行为学视频分析系统记录并分 析小鼠 90 s 内的自主探究情况，包括运行轨迹、在周边区和中 央区的运动速度、总区域跨行次数等。每实验完 1 只小鼠将旷 场箱打扫干净，再进行下一只的实验。 1. 2. 4 Morris 水迷宫实验 定位航行实验： 从造模和给药第 38 天开始，每日于注射和灌胃后进行训练，上、下午各 1 次，历 时 5 天。将小鼠面向池壁，从平台对角象限固定入水点放入水 中，记录 120 s 内找到平台的时间，如未能找到平台，则将其引 至上面停留 10 s，再放回笼中，潜伏期记为 120 s。空间探索实 验： 定位航行实验结束后 24 h，移出平台，仍从平台对角象限固 定入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录 120 s 内穿越原平台 位置的次数，以衡量小鼠对水迷宫记忆的获取能力。 1. 2. 5 脑组织蛋白质、NOS、GSH-Px、AChE 活性的测定 实验 结束后，取脑组织冰浴研磨，并用冷生理盐水制成 10% 脑匀浆， 3 500 r / min离心 10 min，取上清液按试剂盒方法，测定脑组织 中蛋白质、NOS、GSH-Px、AChE 活性。 1. 3 统计学分析 实验数据均以 x ± s 表示，采用 SPSS18. 0 统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用 t 检验。
临床护理观察路径在造血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良中的应用
入 ５ ｍ～ ６ ｍ） ， 证 了 胃管 侧 孔 在 胃 内 ， 少 了 由于 胃管 ３ｃ ５ｃ 嘲 保 减 侧 孔 在 食 管 而 引 起 的误 吸 、 咳 、 物 反 流 。二 是 本 研 究 抬 高 床 呛 食
便捷且更利于血糖 监测 ， 且保 证 了糖尿病 病人 充足 的休 息。 而 较 之 传 统 的 ２ｈ进 行 １次 的 鼻 饲 方 法 ， 研 究 明 显 减 少 了 护 士 本
的工作量 。
ｔｅｏｄ ｒｐｐ ｌ ｉｎ Ｊ． ＭＣ Ｈｅｈ ｅｖＲｅ，０ ０ １ ：７ ． ｈ ｌｅ ｏ ｕａ ｏ ［］ Ｂ ａ ｈＳ ｒ ｓ２ １ ，０ ２ ４ ｔ 作者简介 徐毅君 ， 管护师， 士研究生 ， 主 硕 单位 ：６ ０ ３ 青 岛 大 学 医学 ２６０ ， 院 附属 医院 ； 红 霞 、 新 林 、 风芝 、 敏 、 显 芝 单 位 ：６０ ３ 青 岛 大 孙 胡 纪 庄 赵 ２ ６０ ， 学 医学 院附 属 医 院 。 （ 稿 日期 ：０ １— ７ ９ 修 回 日期 ：０ ２— ３—２ ） 收 ２ １ ０ —１ ； ２１ ０ ５
Ｈｏ ｅ ｌｈ ａ ｅ ｓ ｒ ｉｅ ｎ Ｔａｗａ Ａ ａ ｉ ｎ ｄ ｔ ｄ ｍｏ ｇ ｍｅ ｈ ａｔ ｃ ｒ ｅ ｖ ｃ ｓ ｉ ｉ ｎ： ｎ ｔｏ ｗｉ ｅ ｓ ｕ ｙ ａ ｎ
注 鼻饲 饮 食 会 导 致 血 糖 波 动 大 ， 不利 于控 制 血 糖 ； 另一 方 面 给 降
糖 药 物 的 应 用及 血糖 监测 带 来 困难 ， 导致 低 血 糖 ， 利 于 一 些 易 不
居 家 老 年糖 尿病 鼻 饲 病 人 的 护 理 和 康 复 ＿ 。 本 研 究 所 采 取 改 １
MRC-5 细胞生长情况
：2012-8-1 细胞间隙大小 细胞形态 较小 不规则 很大 不规则 很大 不规则 很大 不规则 较大 不规则 较大 不规则 较大 不规则 很大 不规则 较大 不规则 很大 不规则 很大 不规则 很大 不规则
传代时间：2012-8-1 细胞团数量情况 细胞分布均匀情况 较多 较均匀 很多 不均匀 很多 不均匀 很多 较均匀 较少 较均匀 较多 较均匀 很多 较均匀 较多 较均匀 很多 不均匀 较少 不均匀 较少 不均匀 较多 较均匀
像均存在倒置显微镜成像系统文件夹 盘other-MRC-5 骆晓丽
40倍及100倍图像
备注：所有培养瓶中细胞生长状态图像均存在倒置显微镜成像系统文件夹 盘other-MRC-5 骆晓丽
40
MRC-5 细胞生长情况详情表 贴壁情况及细胞数量 贴壁细胞数量理想，细胞总数较多 贴壁细胞数量一般，仍有悬浮；细胞总数一般 贴壁细胞数量一般，仍有悬浮；细胞总数一般 贴壁细胞数量一般，仍有悬浮；细胞总数一般 贴壁细胞数量一般，仍有悬浮；细胞总数一般 贴壁细胞数量一般，仍有悬浮；细胞总数一般 贴壁细胞数量一般，仍有悬浮；细胞总数一般 贴壁细胞数量较多，有悬浮，细胞总数较多 贴壁细胞数量较多，有悬浮，细胞总数较多 贴壁细胞数量少，细胞总数少 贴壁细胞数量少，且比1#少；细胞总数少 贴壁细胞数量较少，但比1#、2#多；细胞总数少
日期：2012-8-2 组别 10%FBS 3%FBS+1# 3%FBS+2# 3%FBS+3# 3%FBS+ 2 2 2 2 1 1 1 接种瓶规格 T225 T25 T25 T25 T25 T25 T25 T25 T25 T25 T25 T25
微型腺病毒载体的扩增和纯化研究（论文）
文章编号:0427-7104(2001D 05-0525-05微型腺病毒载体的扩增和纯化研究邰艳红1 2 王飞1 王琪1 卢大儒1 郑尊2 薛京伦1(1.复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室 上海200433;2.第二军医大学基础部细胞生物学教研室 上海200433D 摘要:微型腺病毒(mAd D 是去除所有编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 的新型腺病毒载体.它具有包装容量大 免疫原性小等优点.在大量扩增时 需与缺失E 1区及包装信号的辅助腺病毒共转染入包装细胞(293细胞D 内 S 1超离心纯化 将二者分开.再通过琼脂糖覆盖挑斑~在包装细胞内大量扩增~S 1超离心纯化等步骤 最终得到较为纯净的mAd .但因mAd 结构不稳定 易与辅助病毒发生同源重组 在S 1超离心时不能完全与辅助病毒分开 导致外源基因表达逐步下降.关键词:微型腺病毒;扩增;纯化中图分类号:G 39;R 554文献标识码:A腺病毒(AdenoviruS Ad D 因其滴度高~易于制备~转染效率高等优点 现已成为仅次于反转录病毒载体的应用最广泛的一类病毒载体[1].然而 由于腺病毒基因本身转录的病毒蛋白会诱导宿主产生细胞免疫及体液免疫 最终导致外源基因不能长期稳定地表达 且造成二次注射失败[2];目前常用的腺病毒载体(AdV D 包装容量小(约8kb D 不能容纳大片断外源基因.为了提供腺病毒载体的包装容量 降低腺病毒载体的免疫原性 提高外源基因的表达时间及可重复注射的目的 腺病毒载体的结构一直在不断的被改进[3*5].我们尝试构建去除所有病毒编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 共500bp 左右的微型腺病毒载体(mini -Ad mAd D 介导凝血F X 基因及绿色荧光蛋白报告基因(GFP D 进行大量扩增~纯化~离体及活体表达检测.由于微型腺病毒缺失所有结构蛋白基因 仅保留复制及包装所必需的顺式结构 在其大量扩增时 就必须与辅助腺病毒(E 1区缺失D 一同转入包装细胞(含腺病毒的E 1区片断D 为其提供复制及包装所需的蛋白.因此 在大量扩增2种病毒混合液后 mAd 的分离纯化是一个关键问题.本文就微型腺病毒载体的大量扩增及纯化作了初步的尝试 为其下一步的外源基因表达打下基础.1材料和方法1.1细胞系及腺病毒混合液293细胞为含有Ad 5的E 1区并持续表达E 1A 及E 1B 功能蛋白的人胚肾细胞系 由加拿大哥伦比亚大学A .Ama1Sitano 赠送;含凝血F X 基因及GFP 报告基因的微型腺病毒(mAdcFIX ;mAd D 和含B -ga1报告基因的辅助腺病毒(Ad~B D 由美国Baxter 公司张维维博士构建 由本实验室负责扩增及纯化.RSF 细胞(兔成纤维细胞系D 购自美国AT 公司.1.2mad 和adHB 混合斑(6D 的制备将高糖DMEM +10%F S (体积分数D 加入在6孔板培养的293细胞中至细胞50%铺满 改用含2%525第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究 收稿日期:2000-12-07基金项目:国家 863'项目(863-Z 20-02-01D ;国家自然科学基金(39880019D ;国家教育部优秀青年教师基金;教育部博士点基金(98024620D ;霍英东基金;全国优秀博士论文基金;教育部跨世纪人才基金资助作者简介:邰艳红(1970 D 女 医学硕士.625复旦学报(自然科学版D第40卷FCS的高糖DMEM培养基加入20pL mAd及AdHB混合液转染6h后倒去培养液.将加热的12g/L 琼脂糖与加温的2>DMEM液等量混匀调温至42C取2mL混合液轻轻地加入培养孔中室温冷却凝培养箱中.在转染第3天~第5天如法覆盖.第5~7天挑取含mAdcFIX与AdHB的混合病结后转至CO2毒颗粒的半透明空斑20个分别加入0.5mL Tris-HCl(0.01mol/mL pH=8.1D中反复吹打经37C和-80C(各5min D中冻融3次~3000r/min(4C10min D离心后留上清得到20个初次重组腺病毒斑的粗提液.用上述粗提液分别转染293细胞用琼脂糖覆盖~挑半透明感染空斑20个3次冻融和离心得到1 mL含混合腺病毒颗粒的粗提液.各取300pL粗提液转染293细胞.当观察到部分细胞有CPE反应(细胞毒性效应D时收集含混合腺病毒的293细胞用荧光显微镜和X-gal染色鉴定并筛选出荧光反应强~X-gal染色阳性率适中的克隆.1.3mad的大量扩增将首代鉴定的mAd粗提液感染在6孔板中培养的293细胞用含2%(体积分数D小牛血清的DMEM培养待90%的293细胞出现CPE反应时收集细胞~离心(3000r/min4C10min D;取沉淀细胞用0.01mol/L Tris-HCl(pH8.1D复悬(在约5>106细胞中加入0.3mL Tris-HCl液D经37C和-80 C(各5min D中冻融3次;冻融液离心取上清液为mAd粗提液.以同样方法大量扩增病毒粗提液-20 C保存;待收集培养的293-mAd细胞达150瓶(以100mL的培养瓶计算D一同超离心纯化.在每次收集病毒粗提液后取0.1mL感染105贴壁生长的RSF细胞6h后在492nm波长激发光下用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达同时做X-gal染色.确保mAd的转染和包装良好.1.4mad的CSCI超离心纯化[3]共进行连续2次CsCl梯度超离心,在11.5mL的CsCl超离心管中依次加入0.5mL的1.5g/mL CsCl 2.5mL的1.35g/mL CsCl和2.5mL的1.25g/mL CsCl在CsCl液面上缓慢加入mAd及AdHB 5.5mL用石蜡油封顶并配平.离心条件为8150kg(S 41离心机STS型转头D1h.离心后抽取1.35 g/mL和1.25g/mL CsCl之间的单一病毒带.将抽取的病毒液与1.35g/mL CsCl按1:5混匀加入11. 5mL离心管内离心条件为8150kg18h.2条病毒带分别位于距管底2.7cm 3.5cm处.分别抽取至透析盒中用PBS透析3次(每次透析液3000mL D第4次透析液采用10%(体积分数D甘油-PBS每次2 ~3h;纯化产物分装于-20C暂时保存备用.1.5二种病毒的浓度测定取纯化的腺病毒颗粒5pL加120~125pL第4次透析液(PBS+10%(体积分数D甘油D混匀以第4次透析液为空白对照紫外分光光度计(波长260nm D比色根据D(260D值计算Ad颗粒数(mL-1D,即D(260D>稀释倍数>1012.1.6mad的纯度检测将2种病毒纯化液分别加入到70%融合的培养RSF细胞的6孔板内(102particles/cell D6h后在492nm激发光下以荧光显微镜观察一孔细胞的GFP表达另一孔细胞用4%(体积分数D多聚甲醛固定10min X-gal染色4h后再在荧光显微镜下观察GFP的表达同时在普通光学显微镜下观察B-gal的表达情况计算表达报告基因的细胞所占比例.2结果2.1GFP表达的稳定性检测在进行mAd大量扩增的过程中为了使得到的mAd始终保持较高活力我们对每一代扩增的病毒粗提液都进行报告基因GFP的表达检测发现GFP的表达很不稳定其中第1代mAd中GFP表达的细胞约占100%而到第5代降为60%到7代以后降到30%以下(图1所示D.图1mAd 扩增后RSF 细胞GFP 的表达情况Fig .1The expreSSion of GFP in RSF cellS after mAd S amplification .A .第一代;.第五代;C .第七代;D .未感染腺病毒的RSF 细胞.GFP 位于核周(-)2.2mad 的超离心纯化及浓度测定通过连续2次CSCl 梯度超离心 最终在1.35g /mL 和1.25g /mL CSCl 之间得到2条界限不明显的病毒宽带 分别抽取2条病毒带(上方为浮密度小的mAd 距管底3.5cm 下方为浮密度大的Ad~B 距管底2.7cm 测D (26O) 计算病毒颗粒含量 mAd 为2.3>1O 11mL -1;Ad~B 为4.5>1O 11mL -1.2.3mad 的纯度检测感染mAd 组的RSF 细胞在荧光显微镜下可见表达GFP 的细胞占83% X -gal 染色后仅见极少蓝染细胞;感染Ad~B 组RSF 细胞在荧光显微镜下可见GFP 表达占23% X -gal 染色后蓝染细胞占97%(图2所示) 而未感染腺病毒的对照组未见荧光及蓝染(未显示).图2mAd 的纯度检测Fig .2The detection of mAd S purity .A .感染mAd 的RSF 细胞GFP 表达(-);.感染mAd 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-);C .感染Ad~B 的RSF 细胞后GFP 表达(-);D .感染Ad~B 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-)3讨论本实验通过大量扩增~CSCl 超离心纯化 成功地得到了颗粒含量较高且较为纯净的mAd 纯化液.其携带的报告基因GFP 的表达检测证明 mAd 介导外源基因可以在离体培养细胞内较高水平地表达 但同时也发现 mAd 感染的细胞中偶尔也可检测出B -gal 的表达 即mAd 中掺杂有约1%的Ad~B .这种现象应从微型腺病毒载体系统本身的结构分析(图3 此图为本室自制):(1)mAd 缺失所有结构基因 仅保留725第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究500bp 左右的顺式结构,它与野生型腺病毒的结构差异性最大,因此其结构的稳定性也最差,因此,Ad~B 的包装能力远大于mAd ,造成Ad~B 的优先包装(3D .(2D 由于mAd 的结构特点,在复制及包装时,必需有Ad~B 与其共转染293细胞(内含E 1区片断D 为其提供反式补偿.(3D mAd 与Ad~B 及293细胞内E 1区之间存在一定的同源序列.在一定条件下可发生同源重组而产生新的病毒(3,7D .由于以上三种原因,使扩增mAd 过程中产生大量重组病毒,其长度介于mAd 与Ad~B 之间.这样就导致mAd 携带的报告基因的逐步丢失,随扩增代数的增加,GFP 表达下降.而且在CSCI 超离心纯化时2种病毒带界限不清或形成宽带,造成分离的困难.因此在大量制备mAd 时,应注意仅保留扩增的前几代病毒,尽量减少同源重组的机会.尽管目前仅有几个实验室在进行微型腺病毒的研究,腺病毒的同源重组问题仍然引起了极大的关注,并尝试了各种解决的方法.除尝试不同的CSCI 超离心条件外,ParkS 等[8~11]在辅助型腺病毒的包装信号两侧插入IoXP 位点后,与mAd 共转染入293Cre (持续表达Cre 重组酶的293细胞D 细胞中扩增,这样可以通过同源重组将IoXP 位点之间的包装信号缺失,并保证辅助型腺病毒结构的稳定性,有效减少了辅助病毒与mAd 及包装细胞之间的同源重组,同时也降低了辅助病毒的包装效率,氯化铯梯度超离心后,辅助病毒的污染率明显降低.但并未从根本上将2种病毒完全分开.因此,要完全将2种病毒分开,从而得到高纯度的mAd ,除进一步摸索最佳的实验条件外,最根本的手段是进一步改进微型腺病毒载体系统本身的结构,增加其结构稳定性,最大限度地降低同源重组的发生.图3介导F X 的微型腺病毒载体系统简图Fig .3The SimpIe deScription of mAd vector Which mediateS factor XCA :CMV 人actin 启动子9EF :人延长因子启动子参考文献:[1]候云德.分子病毒学[M ].北京:学苑出版社,1990.151-180.[2]Piedra P A ,Poveda G A ,RamSey B .Incidence and prevaIence of neutraIizing antibodieS to commonadenoviruSeS in chiIdren With cyStic fibroSiS :ImpIication for gene therapy With adenoviruS vectorS [J ].PeClCtllCS ,1998,lol(6D :1013-1019.[3]AIemany R ,Dai Yi -fan ,Yan Chun -Iou ,et Cl .CompIementation of heIper -dependent adenoviraI vector :Size effectS and titer fIuctuationS [J ].J vllol meth ,1997,68:147-159.[4]Moorhead J M ,CIayton G ~,Smith R L .A repIication -incompetent adenoviruS vector With thepreterminaI protein gene deIeted efficientIy tranSduceS mouSe earS [J ].J vllol ,1999,73(2D :1046-1053.825复旦学报(自然科学版D 第40卷[5]Morsy M A*Gu M C*Motzel S*et al.An adenoviral vector deleted for all viral coding seguences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[J].P1oc Natl Acac Sci*1998*95:7866-7871.[6]Kochanek S*Clemens P R*Mitani K*et al.Anew adenoviral vector:Replacement of all viral codingseguences with28kb independently expressing both full-length dystrophin and B-galactosidase[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:5731-5736.[7]Lochmuller~*Jani A*~uaro J*et al.Emergence of early region1-containing replication-competentadenovirus in stocks of replication defective adenovirus recombinants(A E1A E3)during multiple passages in293cells[J].Pum Gene the1*1994*5:1485-1491.[8]Parks R J*Chen L*Anton M*et al.A helper-dependent adenovirus vector system:Removal of helpervirus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:13565-13570.[9]Schiedner G*Morral N*Parks R J*et al.Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirusvector results in improved in UiUo gene expression[J].Natu1e Genet*1998*18:180-183.[10]~aecker S E*~ansell~*Stedman~*et al.Ln UiUo expression of full-length human 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novel adenoviral vector that contains only the viral inverted terminal repeat seguences(I T R)*packaging signal and ci S-acting elements reguired for viral DNA replication and packaging.MAd vector has larger capacity and lower immunogenicity*which showed its proprietary prospect in the field of gene therapy.F or amplification of mAd vector*the cells must be co-transfected with mAd and helper Ad that deleted E1region and packaging signal for packaging cells.T hrough plague assay*amplification and propagation*the density of purified mAd was2.3>1011mL-1.~owever*mAd genome was found unstable and with1%contamination of helper Ad.T he amplification and purification of mAd were discussed.Keywords:Mini-Adenovirus;amplification;purification 925第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究微型腺病毒载体的扩增和纯化研究作者：邰艳红， 王飞， 王琪， 卢大儒， 郑尊， 薛京伦作者单位：邰艳红(复旦大学生命科学学院遗传学研究所;第二军医大学基础部细胞生物学教研室)，王飞,王琪,卢大儒,薛京伦(复旦大学生命科学学院遗传学研究所)， 郑尊(第二军医大学基础部细胞生物学教研室)刊名：复旦学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF FUDAN UNIVERSITY年，卷(期)：2001,40(5)1.候云德分子病毒学 19902.Piedra P A;Poveda G A;Ramsey B Incidence and prevalenc e of neutralizing antibodies to common adenoviruses in children with cystic fibrosis:Implication for gene therapy with adenovirus vectors [外文期刊] 1998(06)3.Alemany R;Dai Yi-fan;Yan Chun-lou Complementation of helper-dependent adenoviral vector: Size effects and titer fluctuations 19974.Moorhead J M;Clayton G H;Smith R L A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduc es mouse ears[外文期刊] 1999(02)5.Morsy M A;Gu M C;Motzel S An adenovi ral vector deleted for all viral coding sequences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[外文期刊] 1998(14)6.Kochanek S;Clemens P R;Mitani K Anew adenoviral vect or:Replacement of all viral coding sequences with 28 kb independently expressing both full-length dystrophin and β-galactosidase 19967.Lochmuller H;Jani A;Huaro J Emergence of early regio n 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication defec tive adenovirus recombinants (△E1+△E3) during multiple passages in 293 cells 1994(05)8.Parks R J;Chen L;Anton M A helper-dependent ade novirus vector system:Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[外文期刊] 19969.Schiedner G;Morral N;Parks R J Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirus vector results in improved in v i vo gene expression 199810.Haecker S E;Hansell H;Stedman H In vivo express ion of full-length human dystrophin from adenoviral vectors deleted of all viral genes 1996(07)11.Lieber A;Chen Y H;Kay M A Adenoviral preterminal protein sta bilizes mini-adenoviral genomes in vitro and in vivo[外文期刊] 199712.Lieber A;Steinwaerder D S;Carlson C A Integrating a denovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral gene 1999(11)13.Steinwaerder D S;Carlson C A;Lieber A Generation of adenovirus vectors devoid of all viral genes by recombination between inverted repeats[外文期刊] 1999(11)引用本文格式：邰艳红.王飞.王琪.卢大儒.郑尊.薛京伦微型腺病毒载体的扩增和纯化研究[期刊论文]-复旦学报(自然科学版) 2001(5)。
CHO细胞表达系统研究进展
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２３９~２４３ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０２￣２２ꎻ接受日期:２０１６￣０４￣０４㊀作者简介:郑惠惠ꎬ技术员ꎬ主要从事真核重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｊｖｑｉｕｍｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:江洪ꎬ工程师ꎬ主要从事重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇ＠ｗｏｎｄｅｒｇｅｎ.ｃｏｍＣＨＯ细胞表达系统研究进展郑惠惠ꎬ㊀江㊀洪∗北京万达因生物医学技术有限责任公司ꎬ北京１４１０１７摘㊀要:ＣＨＯ细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展ꎬＣＨＯ细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎬ并被广泛应用于抗体㊁重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中ꎮ近年来ꎬ针对ＣＨＯ细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足ꎬ研究者们通过利用基因工程技术手段ꎬ结合重组蛋白表达机制的研究成果ꎬ为优化和应用ＣＨＯ细胞表达系统做出了不懈努力ꎮ从培养基的优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最近研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的研究与应用提供参考ꎮ关键词:ＣＨＯ细胞培养ꎻ细胞改造ꎻ重组抗原表达ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＺＨＥＮＧＨｕｉ￣ｈｕｉꎬＪＩＡＮＧＨｏｎｇ∗ＢｅｉｊｉｎｇＷｏｎｄｅｒｇｅｎＢｉｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.Ｌｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１４１０１７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｗｉｔｈｔｈｅｅｖｏｌｖｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｕｓｉｎｇｌａｔｅｓｔｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｒｅｅａｓｐｅｃｔｓ:ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＨＯ细胞是由Ｐｕｃｋ于１９５７年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系ꎮ发展至今ꎬＣＨＯ细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术㊁生物反应器设计放大与强化技术㊁大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展ꎬＣＨＯ细胞系统被广泛应用于抗体㊁基因重组蛋白质药物㊁病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中ꎮＣＨＯ细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系ꎮ因为它具有准确的转录后修饰功能ꎬ表达的蛋白在分子结构㊁理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子ꎮ但ＣＨＯ细胞在无血清培养基中会出现活力差㊁分泌外源蛋白能力弱等问题ꎮ所以建立稳定㊁高产的重组ＣＨＯ细胞成为很多研究者的目标ꎮ近年来ꎬ研究者从细胞营养㊁代谢㊁凋亡㊁信号传导等角度ꎬ结合蛋白表达机制等研究成果ꎬ对这一目标的实现做出了很多努力ꎮ本文从培养基优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构. All Rights Reserved.建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最新研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的应用提供参考ꎮ１㊀培养基的优化研究发现ꎬ不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别ꎮ通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响ꎬ并开发适用于不同重组ＣＨＯ细胞株的培养基ꎬ成为很多研究者提高ＣＨＯ细胞表达系统产量的重要方式ꎮ为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长ꎬ需要在基础培养基中添加很多其他因子ꎬ如激素㊁生长因子㊁蛋白水解物等ꎮ蛋白质水解物含有丰富的营养成分ꎬ可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程ꎮＤａｖａｍｉ等[１]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响ꎬ优化得到更适于ＤＧ４４的培养基ꎮ酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物ꎬ可以使细胞密度增加的同时ꎬ使重组表达抗体的表达量大幅提高[２]ꎮ大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[１ꎬ３ꎬ４]ꎮ由于蛋白水解物的构成复杂ꎬ且批间差异大ꎬ因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性ꎮ如果去除培养基中的蛋白质水解物ꎬ需要添加氨基酸或微量元素等ꎬ通过优化调整其比例ꎬ仍能支持高密度的ＣＨＯ细胞培养[５]ꎮ刘兴茂等[６]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察ꎬ确定了腐胺㊁胰岛素及转铁蛋白对１１Ｇ￣Ｓ细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用ꎮ设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到４.１２ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎮＸｕ等[７]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ设计与支持向量机(ＳＶＭ)预测并实验确定了硫酸锌㊁转铁蛋白及ＢＳＡ对ＣＨＯ￣Ｋ１细胞的生长有促进作用ꎮ另有研究表明ꎬ使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物ꎬ可以使细胞的密度达到７.０ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎬ但是会降低转染效率[８]ꎮＭｉｋｉ等[９]研究发现ꎬ添加生长因子ＩＧＦ￣１和脂类信号分子溶血磷脂酸(ＬＰＡ)也可以有效加速ＣＨＯ细胞生长ꎮ优化培养基能有效提高重组ＣＨＯ细胞的培养密度ꎮ高密度的ＣＨＯ细胞培养是ＣＨＯ细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一ꎮ与大肠杆菌和酵母表达系统相比ꎬＣＨＯ细胞有生长较慢㊁培养周期较长㊁产量较低等缺点ꎮ为了提高重组蛋白产量㊁扩大ＣＨＯ细胞表达系统的生产应用范围ꎬ研究者们在优化培养基的实验基础上ꎬ构建高产的重组ＣＨＯ细胞系ꎬ为大规模的重组蛋白生产提供基础ꎮ２㊀高产重组ＣＨＯ细胞株的构建研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对ＣＨＯ细胞进行筛选和改造ꎬ得到高产的重组细胞株ꎮ研究者们通过过量表达或敲除某个基因ꎬ调整代谢途径㊁延缓细胞凋亡㊁增强转录表达效率ꎬ有效的增加了重组蛋白产量ꎮ通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果ꎬ研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力ꎮ２.１㊀调整代谢途径乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长ꎮＺｈｏｕ等[１０]使用ｓｉＲＮＡ技术降低乳酸脱氢酶Ａ(ＬＤＨａ)和丙铜酸脱氢酶激酶(ＰＤＨＫｓ)基因的表达ꎬ使乳酸的产生降低了９０％ꎬ并增加了单抗的产量ꎮＴｏｕｓｓａｉｎｔ等[１１]通过在ｒＣＨＯ中表达酵母丙酮酸羧化酶(ＰＹＣ２)ꎬ改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率ꎬ增长了细胞的对数生长期ꎬ从而增加了细胞密度及产量ꎮ２.２㊀延缓细胞凋亡为了延长细胞培养的时间从而增加产量ꎬ有研究者建立了能表达抗凋亡基因的ＣＨＯ细胞系ꎮＭａｊｏｓ等[１２]通过在ＣＨＯ中表达１个Ａｓｐ２９Ａｓｎ突变的抑制凋亡基因ꎬ有效延缓了细胞凋亡ꎮ也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡ꎬ如Ｃｏｓｔ等[１３]敲除了ＢＣＬ２相关蛋白Ｘ(ＢＡＸ)和ＢＡＫ的基因ꎬ使单克隆抗体产量增加了５倍ꎮＲｉｔｔｅｒ等[１４]发现８号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加ꎮ２.３㊀增强转录表达效率有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上ꎬ通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白ꎬ增强转录和表达效率ꎬ以增加目的重组蛋白的产量ꎮＬｅＦｏｕｒｎ等[１５]通过在ＣＨＯ中表达人信号受体蛋白ＳＲＰ１４ꎬ成功增加了分泌表达的重组蛋白的产０４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.量ꎮＰｅｎｇ等[１６]通过表达转录翻译相关蛋白ＳＬＹ１㊁ＭＵＮＣ１８Ｃ和ＸＢＰ１ꎬ使ＩｇＧ的产量提高了２０倍ꎻＲａｈｉｍｐｏｕｒ等[１７]在ＣＨＯ细胞中表达神经酰胺转移蛋白(ＣＥＲＴ)的突变基因使ｔ￣ＰＡ的产量增加了３５％ꎮ２.４㊀表达糖基化酶能产生糖基化的重组蛋白是ＣＨＯ细胞表达系统重要的优势ꎬ研究者们通过建立能表达Ｎ￣糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性ꎮ如Ｇｏｈ[１８]建立的一个含有Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｉ基因的突变体ＣＨＯ￣ｇｍｔ４细胞系ꎬ其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者ꎮＺｈａｎｇ等[１９]通过ＣＨＯ￣ｇｍｔ５细胞株表达的重组抗体ꎬ其Ｆｃ的Ｎ￣多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ＡＤＣＣ的作用ꎮ根据ＣＨＯ￣Ｋ１的基因组信息ꎬＹａｎｇ等[２０]通过锌指核酸酶(ＺＦＮｓ)基因敲除的方法ꎬ研究了１９种包括作用于Ｎ￣糖基链分支㊁半乳糖基㊁聚ＬａｃＮＡｃ延伸㊁唾液酸化加盖的Ｎ￣糖基转移酶对Ｎ￣糖基化作用的影响ꎬ为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考ꎮ重组ＣＨＯ细胞表达重组蛋白能力的高低ꎬ不能简单的归结为某些关键基因的作用ꎮ为了得到高产的重组细胞株ꎬ需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况㊁培养条件㊁蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素ꎮ３㊀大规模培养研究基因工程技术㊁细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展ꎬ推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用ꎮ由于ＣＨＯ细胞能以悬浮培养的方式高密度培养ꎬ培养体积可达１０００Ｌ以上ꎬ所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中ꎬＣＨＯ细胞表达系统拥有广阔的发展前景ꎮ在大规模生产中ꎬ通常采用流加培养方式ꎬ通过添加营养物质来延长培养时间ꎬ增加细胞密度和目的产品的浓度ꎮ为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率ꎬ研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点ꎬ选择和优化起始培养基㊁补料培养基及补料策略ꎮ现代计算机技术㊁数学算法及理论的应用ꎬ也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助ꎮ３.１㊀优化培养参数选择合适的培养基㊁优化细胞培养的参数(如温度㊁ｐＨ㊁溶氧㊁ＣＯ２浓度㊁渗透压等)对生产至关重要ꎮ同时ꎬ流加工艺参数(如流加培养基成分㊁流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化ꎮＦａｎ等[２１]采用分批补料方式培养ＣＨＯ细胞ꎬ实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长㊁ＩｇＧ浓度和Ｎ￣糖基化生成都很重要ꎮＫｉｍ等[２２]使用分批补料培养使ＩｇＧ的产量达到２.３ｇ/Ｌꎮ通过用小麦蛋白水解物(ＷＧＨ)代替补料中的谷氨酰胺可以使ｔ￣ＰＡ的产量达到４２２ｍｇ/Ｌ[２３]ꎮ３.２㊀应用新的培养技术微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术ꎮ培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面ꎬ从而可实现细胞的高密度培养ꎮ胡显文等[２４]在搅拌式反应器中无血清培养分泌ｕ￣ＰＡ的ＤＮＡ重组ＣＨＯ细胞ꎬ通过部分更换Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体ꎬ解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题ꎮ并使用周期变压刺激技术使ｕ￣ＰＡ的产量提高了１０倍ꎬ且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率ꎮＶｅｎｔｉｎｉ等[２５]通过Ｃｙｔｏｄｅｘ微载体培养ＣＨＯ￣ｈＴＳＨ细胞的实验表明ꎬ培养基中微载体的数量及在ｒｈＴＳＨ合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数ꎮ李智等[２６]利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性ꎬ采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性ꎬ用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３￣Ａ２株ꎬ分泌表达的ｒｈＴＮＫ￣ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ/Ｌ ｄꎮ３.３㊀添加保护剂聚醚Ｆ６８可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤ꎮ针对Ｆ６８对某些细胞株的生长及产量降低的情况ꎬ研究者发现０.０５％或０.０７５％的５００ｋＤａ的γＰＧＡ可以替代Ｆ６８应用于ＣＨＯＤＧ４４细胞的培养中[２７]ꎮ在细胞培养工艺逐级放大的过程中ꎬ每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标ꎮ生物反应器在线监控ｐＨ㊁溶氧等参数的功能㊁色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助ꎮ１４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.４ 展望ＣＨＯ细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞ꎬ有其不可比拟的优点ꎬ同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处ꎮ结合生物信息学㊁细胞生物学㊁基因工程技术和生物反应器技术的研究成果ꎬ研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性㊁蛋白表达特性等影响因素ꎬ通过研发个性化培养条件及培养工艺ꎬ构建高表达载体ꎬ筛选稳定高产的重组细胞株ꎬ改造宿主细胞等角度继续优化ＣＨＯ细胞表达系统ꎬ为产业化生产重组蛋白提供基础ꎮ用于产业化生产的重组ＣＨＯ细胞ꎬ需要具备生长特性良好㊁能在无血清培养基中高密度培养㊁表达重组蛋白能力强㊁能正确的进行翻译后修饰等特点ꎮ糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一ꎬ直接影响重组蛋白的空间结构㊁生物活性㊁稳定性㊁免疫原性和生物反应性等ꎮ对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题ꎮ随着基因编辑技术的发展ꎬ研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整㊁准确的特定形式的糖链结构ꎬ为糖基化蛋白在免疫诊断㊁临床治疗等领域的持续发展奠定了基础ꎮ随着基因技术的不断发展ꎬ对细胞代谢㊁信号传导等方面研究的持续深入ꎬ构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组ＣＨＯ细胞株仍将成为研究热点ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＥｇｈｂａｌｐｏｕｒＦꎬＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉＬꎬｅｔａｌ..ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯＤＧ４４ｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｉｒａｎ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１９(４):１９４－２０５.[２]㊀ＳｕｎｇＹＨꎬＬｉｍＳＷꎬＣｈｕｎｇＪＹꎬｅｔａｌ..Ｙｅａｓｔｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｌｏｗ￣ｃｏｓｔａｄｄｉｔｉｖｅｔｏｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００４ꎬ６３(５):５２７－５３６.[３]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＢａｌｄｉＬꎬＲａｊｅｎｄｒａＹꎬｅｔａｌ..ＰｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｖａｒｉａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＭｅｄ.ꎬ２０１４ꎬ３(３):１４６－１５６.[４]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＫｉｍＪＨꎬＬｅｅＨＪꎬｅｔａｌ..Ｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ９８(５):１０００－１００５.[５]㊀张大鹤ꎬ易小萍ꎬ张元兴ꎬ等ꎬ适于重组ＣＨＯ细胞培养的无血清培养基的制备[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０１１(１０):１１５２－１１５６.[６]㊀刘兴茂ꎬ刘红ꎬ叶玲玲ꎬ等ꎬＣＨＯ工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１０ꎬ(１):８５－９２.[７]㊀ＸｕＪꎬＹａｎＦＲꎬＬｉＺＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｉｎｔ.ꎬ２０１４ꎬｄｏｉ:１０.１１５５/２０１４/２６９３０５. [８]㊀ＥｂｅｒｈａｒｄｙＳＲꎬＲａｄｚｎｉａｋＬꎬＬｉｕＺ.Ｉｒｏｎ(ＩＩＩ)ｃｉｔｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ６０:１－９.[９]㊀ＭｉｋｉＨꎬＴａｋａｇｉＭ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍｅｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６７(４):６８９－６９７.[１０]㊀ＺｈｏｕＭꎬＣｒａｗｆｏｒｄＹꎬＮｇＤꎬｅｔａｌ..ＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｌａｃｔａｔｅｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙｃｅｌｌｓ(ＣＨＯ)ｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１５３(１－２):２７－３４.[１１]㊀ＴｏｕｓｓａｉｎｔＣꎬＨｅｎｒｙＯꎬＤｕｒｏｃｈｅｒＹ.ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｏａｌｔｅｒｌａｃｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ２１７:１２２－１３１.[１２]㊀ＭａｊｏｒｓＢＳꎬＣｈｉａｎｇＧＧꎬＰｅｄｅｒｓｏｎＮＥꎬｅｔａｌ..Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎａｎｔｉ￣ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｏｍａｔｉｃｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１２ꎬ２５(１):２７－３８.[１３]㊀ＣｏｓｔＧＪꎬＦｒｅｙｖｅｒｔＹꎬＶａｆｉａｄｉｓＡꎬｅｔａｌ..ＢＡＫａｎｄＢＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１０ꎬ１０５(２):３３０－４０. [１４]㊀ＲｉｔｔｅｒＡꎬＶｏｅｄｉｓｃｈＢꎬＷｉｅｎｂｅｒｇＪꎬｅｔａｌ..Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆａｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(５):１０８４－１０９３.[１５]㊀ＬｅＦｏｕｒｎＶꎬＧｉｒｏｄＰＡꎬＢｕｃｅｔａＭꎬｅｔａｌ..ＣＨＯｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｅｖｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｅｔａｂ.Ｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ２１:９１－１０２.[１６]㊀ＰｅｎｇＲＷꎬＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｅｘｏｃｙｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２００９ꎬ１０２(４):１１７０－１１８１.[１７]㊀ＲａｈｉｍｐｏｕｒＡꎬＶａｚｉｒｉＢꎬＭｏａｚｚａｍｉＲꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＥＲＴａｎｄＸＢＰ１ｓｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ２３(８):１１１６－１１２２. [１８]㊀ＧｏｈＪＳꎬＬｉｕＹꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＣＨＯ￣ｇｍｔ４ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄꎬ２０１４ꎬ５２４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.(４):２６９－２７３.[１９]㊀ＺｈａｎｇＰꎬＨａｒｙａｄｉＲꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＤＰ￣ｆｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ３５Ｃ１ｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｍｕｔａｎｔ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２２(７):８９７－９１１.[２０]㊀ＹａｎｇＺꎬＷａｎｇＳꎬＨａｌｉｍＡꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｖｅｒｓｅꎬｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３３(８):８４２－８４４.[２１]㊀ＦａｎＹꎬＪｉｍｅｎｅｚＤｅｌＶａｌＩꎬＭｕｌｌｅｒＣꎬｅｔａｌ..Ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｆｆｅｃｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１５ꎬ１１２(３):５２１－５３５.[２２]㊀ＫｉｍＢＪꎬＺｈａｏＴꎬＹｏｕｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ｂａｔｃｈꎬｆｅｄ￣ｂａｔｃｈꎬａｎｄｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｗｉｔｈＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎａｐｒｅｓｓｕｒｅ￣ｃｙｃｌｅｄｒｉｖｅｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１２ꎬ１０９(１):１３７－１４５.[２３]㊀ＫｉｍｄｏＹꎬＣｈａｕｄｈｒｙＭＡꎬＫｅｎｎａｒｄＭＬꎬｅｔａｌ..Ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｔ￣ＰＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｅｄｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅａｍｍｏｎｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｐｒｏｇ.ꎬ２０１３ꎬ２９(１):１６５－１７５.[２４]㊀胡显文ꎬ肖成祖ꎬ高丽华ꎬ等.用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００１ꎬ(１):４５－４８. 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MRC-5体外培养细胞生长曲线测定 - 详细
MRC-5体外培养细胞生长曲线测定一．实验目的认识细胞接种和传代培养中细胞生长增殖规律。
二．实验原理在培养接种或每一次传代培养过程中，培养物都要经历相似的恢复和生长过程。
细胞生长曲线反映的是培养细胞从接种到传代之前的生长状况，也是判定细胞活力的重要指标。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，紧接着进入大量分裂的指数生长期。
在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平台期及退化衰亡4个部分。
以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制细胞的生长曲线坐标图。
三．实验准备3.1实验人员用品工作服、帽子、口罩、手套、肥皂、医用手臂消毒桶、0.1%新洁尔灭消毒液；3.2消毒和灭菌用品电炉、高压蒸汽灭菌锅、铝盒、24孔细胞培养板、移液管、枪头、洗耳球、离心管（规格：1.5mL/5mL/10mL）；3.3药品和试剂DMEM细胞培养液（10%血清）、0.25%胰蛋白酶-0.53Mm EDTA、PBS(-)；3.4 细胞MRC-5人二倍体细胞；3.5设备与器材CO2培养箱、离心机、移液枪（规格：1000uL、200uL）、二级生物安全柜、血细胞计数板、显微镜、记号笔、废液瓶；四．实验步骤4.1细胞接种4.1.1选择生长良好的MRC-5人二倍体细胞，移液管移除原细胞培养液至废液瓶中；4.1.2 DPBS润洗三次，每次5mL；4.1.3 吸管吸取1mL胰蛋白酶溶液浸润培养层细胞，37℃恒温消化2～10min；4.1.4用含10%血清的DMEM培养液4mL终止消化；4.1.5将终止消化后的细胞悬液用移液管转移至离心管中，1000r/min离心8min，弃上清；4.1.6吸管吸取2mL DMEM细胞培养液悬浮细胞；4.1.7对细胞悬浮液进行细胞计数；4.1.8调整悬浮液的细胞浓度分别为5×103个/mL(A) 、2×104个/mL(B)、 5×104个/mL(C)3种不同的细胞浓度（细胞理论数：1.575×104个）；4.2 细胞培养4.2.1依次将浓度为5×103个/mL(A) 、2×104个/mL(B)、 5×104个/mL(C)的细胞悬液分装于3个有盖的24孔细胞培养板，分别按每孔接种1mL，每种浓度各接21孔，进行细胞的悬浮培养；4.3 细胞换液细胞接种培养后，分别按照每间隔3d和5d换液一次。
人二倍体细胞(MRC-5)悬浮培养扩大化中培养条件研究
272生物技术世界 BIOTECHWORLD在生物医药领域,许多基因工程药物、疫苗等都离不开最基本的细胞培养技术,人二倍体细胞系的建立使人用疫苗得到了长足的发展。
[1]到目前为止,mrc-5 细胞被世界各地很多疫苗生产厂家用于疫苗生产,比如人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV)。
HDCV安全性好,具有很好的免疫原性,同其他狂犬病疫苗相比,接种后副作用极少发生,因此被WHO推荐为评价任何一种人用狂犬病疫苗的标准疫苗[2]。
1 材料1.1 细胞:中国成都康华生物制品有限公司MRC-5工作细胞库细胞。
1.2 微载体:GE公司的cytodex I型。
1.3 生物反应器:中国广州奇志BC-15L、BC-100L型生物反应器。
1.4 培养液 :日本株式会社日水 MEM 培养液, 10%的小牛血清(山西太原润生) ,0.03%L-谷氨酰胺,1%非必须氨基酸(Gbico)1.5 消化液:0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。
1.6 缓冲液液:pH7.2 0.01mol/l PBS 溶液。
2 方法2.1 微载体培养 mrc-5 细胞2.1.1 微载体处理按照 GE 公司说明处理微载体,高压灭菌。
2.1.2 细胞接种将细胞悬液以60、80、100、120、150rpm的搅拌转速分别接种到BC-15L 细胞培养罐内,接种密度(2×105个/ml),培养浓度 5g/L,取样观察细胞贴壁状况。
每天更换培养液,每天显微镜下观察细胞生长状况,细胞在微载体上长满单层后可进行扩大培养。
2.1.3 微载体扩大培养种子罐细胞长满后,用PBS洗涤细胞三次,加入0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。
消化细胞,分别用60、80、100、120、150rpm消化15分钟后取样观察细胞状态并测定细胞活力,细胞从微载体上脱离下来后,将细胞悬液转入到BC-100L细胞培养罐,培养浓度5g/L。
2.1.4 培养参数筛选接种细胞到BC-100L 细胞培养罐后设置相同的细胞接种浓度(2×105cells/ml)、微载体浓度(5g/L)、液体更换程序,所有培养参数中确保唯一参数变化。
丹贝益肺方对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)增殖及胶原蛋白合成的影响
丹贝益肺方对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）增殖及胶原蛋白合成的影响目的:本实验通过观察丹贝益肺方对人胚肺成纤维细胞增殖的抑制,观察统计不同浓度丹贝益肺方溶液对人胚肺成纤维细胞胶原蛋白表达的影响,研究其是否对人胚成纤维细胞有抑制和干预的作用,来证明丹贝益肺方对肺纤维化的作用,为丹贝益肺方治疗肺纤维化提供实验基础。
方法:1.体外培养人胚肺成纤维细胞,用不同浓度丹贝益肺方进行处理,分为（1）空白对照组、（2）丹贝益肺方1×10<sup>-3 </sup>mg/ml组、（3）丹贝益肺方1×10<sup>-2 </sup>mg/ml组、（4）丹贝益肺方1×10<sup>-1 </sup>mg/ml组、（5）丹贝益肺方1 mg/ml,在温度为37℃,浓度为5%的培养箱中,培养的时间分别为:24 h、48 h以及72 h。
在显微镜镜下观察并记录细胞的不同形态变化,然后应用MTT法,对不同浓度丹贝益肺方作用不同时间进行记录和检测,以及肺成纤维细胞在双波长（490 nm,630 nm）的吸光度A值。
通过记录并对比A值做时效、量效图表,最终对得到的不同浓度以及不同时间丹贝益肺方对肺成纤维细胞增殖的影响进行比较。
2.通过体外培养MRC-5细胞,并将培养的细胞分为四组:（1）空白对照组、（2）地塞米松组(5×10<sup>-2 </sup>mg/ml)、（3）丹贝益肺方低浓度组(1×10<sup>-3 </sup>mg/ml)、（4）丹贝益肺方高浓度组(1×10<sup>-1 </sup>mg/ml)。
通过细胞爬片免疫组化法观察细胞内Ⅰ型胶原蛋白（COLⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（COL Ⅲ）表达的变化,同时采用Image pro-plus图像分析系统,把各组对应COLⅠ、COLⅢ表达的IOD计算出来。
达格列净通过丝氨酸
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ９（ＩＲＦ９）ｐｒｏｔｅｉｎａｓｗｅｌｌａｓｍｙｘｏｖｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１（ＭｘＡ）ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅＪＡＫ／ＳＴＡＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＩｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨＢＶｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙａｎｄＨｅｐＧ２ ２ １５ｃｅｌｌｓｓｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨＢＶ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＴＥＮｐｒｏｔｅｉｎｂｏｔｈｄｅｃｒｅａｓｅｄ；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＢＶ ｒｅｌａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄＨＢＶｐｇＲＮＡｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＰＴＥＮ ＯＥＨｅｐＧ２ ２ １５ｃｅｌｌｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｂｙｐｏｌｙ（Ｉ∶Ｃ），ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＩＦＮ αｍＲＮＡｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＲＦ９ａｎｄＭｘＡｐｔｏｔｅｉｎｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅＪＡＫ／ＳＴＡＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｂｏｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＨＢＶｍａｙｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇｔｈｅａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩＦＮ αｂｙｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＴＥＮ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ；ＰＴＥＮ；ＩＦＮ α；ＪＡＫ／ＳＴＡＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ；ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ网络出版时间：２０２２－０５－２８１４：２６ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０６５．Ｒ．２０２２０５２６．１０１８．０２１．ｈｔｍｌ达格列净通过丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶／内皮型一氧化氮合酶途径调节高糖环境下的内皮祖细胞功能解丹丹，巫婷婷，赵晓彤，许慕蓉，陈明卫摘要 目的 探讨达格列净（ＤＡＰＡ）对高糖环境下体外培养的大鼠内皮祖细胞（ＥＰＣｓ）功能的影响。
组织型转谷氨酰胺酶在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中的表达及意义
ｔＧ可能通过 交联细 胞外基 Ｔ 扩张 。Ｍａ ｏ 染 色可见模 型组 大鼠肾问质胶原 明显增 多。模 型组 ｔ ｓｎ ｓ Ｔ Ｇ和 Ｆ Ｎ的基 因和蛋 白表 达均 明显 高于假手术 组 （ Ｐ＜Ｏ ０ ）并且 ｔ ．１ ， Ｔ Ｇ的蛋 白水平与 Ｆ Ｎ水平呈显著 正相 关 （ ＝０ ７４ Ｐ ＜００ ） ｒ ．３ ， ．５ 。结论 质蛋 白 ， 抵抗降解 ， 参与 Ｕ Ｏ大 鼠肾问质纤维化 的发生发展 。 Ｕ
Ｃａｇｈｎ１０２ ， ｈ ａ ｈ ｎｃｕ ３０ １ Ｃ ｉ ） ｎ ＡｂｔａｔＯｂｅｔ ｅ Ｔ ｎｅｔａ ｅｅｐｅｓ ｎｏ ｓｕ ｍ ｇ ｔ ｉ ｓ ｆＧ）ｉ ｕｉｔ ａ ｕｅ ｒ ｂｔ ｃｏ Ｕ Ｏ） ｓ ｃ： ｊ ｉ ｏｉ ｓｇｔ ｔ ｘｒｓｏ ｆｉ ｅｔ ｍ ｌ ａ ｎ ｅ（ ｒ ｃｖ ｖ ｉ ｅｈ ｉ ｔｓ ｒ ｕ ｍ ａ ｉ ｎ ｎ ａ ｒｌ ｒｔ ａ ｏｓｕｔｎ（ Ｕ ｌｅ ｅ ｌ ｒ ｉ ｒ ｓＭｅ ｏｓ Ｔ ｅａｉａ ｍ ｄｌ ｏ ｕｉｔ ａ ｕｅ ｒ ｂｔ ｃｏ Ｕ Ｏ）ｗ ｒ ｕｅ ． ｓ ｒ ａ ｅ ａｄｍｙｄ ｉ ｄｉｏｔ ａ ． ｔ ｄ ｈ ｎ ｌ ｏｅ ｆ ｎ ａ ｒｌ ｒ ｅ ｏｓｕｔｎ（ Ｕ ｔ ｈ ｍ ｓ ｌｅ ｔａ ｌ ｒ ｉ ｅｅ ｓｄ Ｗｉａ ｒ ｓ ｒ ｒｎｏ ｌ ｉｄ ｔ ｈ ｔ ｔ ｗ ｅ ｖｅ ｎ ｅ
丹皮酚对MRC 5细胞的抗衰老和抑制HaCaT细胞的EMT作用
丹皮酚对MRC-5细胞的抗衰老和抑制HaCaT细胞的EMT作用一、目的:衰老是生物界的普遍规律,可以是正常组织细胞的正常老化,也与冠心病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、肝损伤等疾病有密切关系,这些疾病所导致的机体的免疫功能降低或者脏腑功能的衰竭,从而引起器官、组织和细胞的快速衰老;其中衰老与癌症死亡率也随年龄增加而呈指数递增的关系,尤其是60岁以上的人群;此外衰老细胞能显著分泌多种炎症因子,趋化因子,生长因子等,这种分泌形式统称为衰老相关的分泌表型（SASP）,SASP可以泌炎症及癌基因相关因子促进永生化的上皮细胞恶性增殖、迁移和侵袭,诱导上皮细胞发生恶性转化和上皮间质转化（EMT）。
在80年代早期,EMT首次被人们发现并且逐渐被人们所重视,很多研究发现上皮间质转化与肿瘤的发生发展有着密切的关系。
EMT是上皮细胞获得迁移能力的一种方式,近年来,EMT在肿瘤侵袭和转移过程中被人们所认识且越来越被关注。
通过上皮-间质转分化,细胞失去其本身的极性,而且也失去了与基底膜之间的连接,使肿瘤细胞获得了抗凋亡以及降解细胞外基质的能力,从而具有很高的迁移及侵袭等间质的表型。
目前,EMT已被大多数人认为是导致恶性肿瘤发生侵袭与转移的重要因素。
本实验首先利用H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>诱导人肺胚成纤维细胞MRC-5发生衰老,而衰老的MRC-5细胞的分泌上清里包含着SASP,其里面的炎性因子（IL-6/IL-8）可以促进人永生化细胞HaCaT Keratinocytes cells（HaCaT细胞）发生恶性转化,从而导致HaCaT细胞发生EMT。
故本实验首先探讨丹皮酚对MRC-5细胞的抗衰老作用与机制,接着利用衰老MRC-5细胞的分泌上清诱导HaCaT细胞发生EMT,最后研究丹皮酚对HaCaT细胞EMT的作用及机制。
本文实验结果证明了丹皮酚可以通过抗氧化应激和抑制EMT．的作用,从而发挥其抗衰老和抑制恶性转化的功效。
一种MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基及其使用方法[发明专利]
![一种MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基及其使用方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9add54f7ba4cf7ec4afe04a1b0717fd5370cb273.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510358920.5(22)申请日 2015.06.25C12N 5/071(2010.01)C12N 7/00(2006.01)A61K 39/205(2006.01)A61P 31/14(2006.01)C12R 1/93(2006.01)(71)申请人江苏太一生物科技有限公司地址214135 江苏省无锡市无锡新区菱湖大道97号太湖国际科技园兴业楼C 栋407室(72)发明人吴增玉(54)发明名称一种MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基及其使用方法(57)摘要本发明提供一种适用于在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书4页 说明书14页 附图1页(10)申请公布号CN 104894057 A (43)申请公布日2015.09.09C N 104894057A1.一种在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基，其特征在于：培养基的组成成分为：2.如权利要求1所述的在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基，其特征在于：培养基的组成成分为：3.如权利要求1或2所述的培养基，在使用前加入5％-10％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在生物反应器培养环境中使用的培养MRC-5细胞的培养液。
4.一种在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养方法，其特征在于：使用权利要求1-3之一所述的培养基，在生物反应器中以灌流培养的方式大规的培养MRC-5细胞；接种狂犬病病毒种毒液，以灌流培养的方式维持狂犬病病毒的增殖，直到收获病毒液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的培养基加入5％-10％浓度的血清，在生物反应器中大规模培养MRC-5细胞，然后接种狂犬病病毒，使用同一培养基维持病毒增殖。
多聚物纳米抗生素的研究进展
多聚物纳米抗生素的研究进展杜子秀;陈娟【摘要】多聚物纳米抗生素制剂目前尚处于起步阶段,但已有多种聚合物可以作为抗生素的载体,如聚氰基丙烯酸烷基酯、聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)、壳聚糖、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、两亲性嵌段共聚物等.本文主要回顾了上述聚合物的抗生素纳米制剂的发展状况,并分析展望其未来的应用前景.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2018(043)008【总页数】6页(P990-995)【关键词】多聚物纳米抗生素;抗生素的载体;聚合物;纳米颗粒【作者】杜子秀;陈娟【作者单位】上海交通大学药学院,上海200240;上海交通大学药学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】R978.1临床常用的β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类等抗生素对病原微生物具有抑制或杀灭作用，是防治感染性疾病的重要药物[1]。
目前作为抗菌药物的抗生素在临床用药中占相当大的比例，但同时发现抗生素治疗细菌感染会遇到诸如水溶性和稳定性差、病灶部位浓度低、毒副作用强等问题，上述缺点严重制约了抗菌药物的有效利用，并对人体的健康造成损伤，同时会产生细菌耐药性和耐药菌感染等副作用[2]。
为了克服抗生素的上述缺点，提高体内药物的生物利用度、降低抗生素的用药剂量、避免细菌耐药性和耐药菌感染等，人们在不断开发新的更有效的抗生素药物的同时，也在努力利用纳米颗粒实现其体内的安全高效输送。
目前用于抗生素的纳米制剂有各种抗生素负载递送系统，例如聚合物纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质/聚合物混合纳米颗粒，也有不同材料组装的纳米纤维/支架、纳米片、纳米管和纳米乳液等[3]。
其中利用高分子生物材料制备的纳米输送体系在抗生素的输送中虽然还处于刚起步阶段，但已经体现了其独特的优越性。
本文将对多聚物纳米抗生素的研究进展和现状进行总结分析，探讨如何有效合理利用多聚物实现抗生素的靶向给药。
脂肪干细胞体外快速扩增实验研究
脂肪干细胞体外快速扩增实验研究
梁慧;王庆胜;方海滨;马卉
【期刊名称】《中国误诊学杂志》
【年(卷),期】2008(8)21
【摘要】目的:探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增兔脂肪干细胞的方法。
方法:比较应用微载体结合旋转生物反应器(RCSS)进行动态培养与平皿静态培养两种方法中,脂肪干细胞生长曲线、倍增时间和生长周期的情况。
结果:实验组RCSS法培养中脂肪干细胞密度可达最初接种的19倍左右,而对照组平皿静态培养仅为6倍余。
实验组倍增时间短于对照组,且细胞周期分析显示G2-M期+S期细胞比例高于对照组。
结论:利用微载体细胞培养技术可快速地在体外扩增脂肪干细胞。
【总页数】3页(P5047-5049)
【关键词】细胞培养技术/方法;干细胞/细胞学;脂肪组织/细胞学;细胞,培养的【作者】梁慧;王庆胜;方海滨;马卉
【作者单位】河北医科大学附属秦皇岛市第一医院心内科
【正文语种】中文
【中图分类】R329.29
【相关文献】
1.黄嘌呤核苷促进骨髓间质干细胞体外快速扩增的实验研究 [J], 刘芳;陈少红;刘青波;范新娟;唐芳;刘大伟;赵国强
2.体外扩增的自体脂肪干细胞介导自体脂肪移植的临床研究 [J], 汤苏阳;李彦;闫俊灵;陈冲;李梁;丁红;原理
3.基质血管成分与体外扩增的脂肪来源干细胞促进移植脂肪成活的对比研究 [J], 赵建辉;易成刚;邱璇;李龙;梁丽华;夏炜;苏映军;郭树忠
4.体外扩增后人脂肪源干细胞的体外免疫调节功能的实验研究 [J], 白雯;江明;崔磊;尹烁
5.体外扩增和纯化脂肪干细胞应用于自体脂肪移植的研究进展 [J], 邹雅琴
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3 结果
消化cytodex1上的细胞,5min,10min,15min,20min时取样观 察细胞消化状态并拍照,测定细胞活力（图1）。
加入消化液后,高速搅拌使消化液均匀作用于每个微载体上的 细胞,同时也对微载体上的细胞产生剪切力,至细胞损伤,降低细胞 的活力,所以选择一个可接受的消化状态对微载体的二级放大是非 常重要的,因为如果载体上的细胞未完全脱落时,或是细胞成团状 而未成单个细胞悬液时,又或是细胞消化过度活力降低时都会影响 细胞的再次贴壁和培养。
生物技术 世界
生命科学与实验研究
微载体上 MRC-5 细胞扩大培养的研究
陈余娟 (四川大学生物治疗国家重点实验室 四川成都 610100)
摘要:通过研究摸索微载体上人二倍体细胞mrc-5的扩大培养,以期达到规模化生产病毒性疫苗的目的。本文对mrc-5细胞在微载体上的持续放
大提出了一种新的思路,即“球转球”,这就是将微载体上长满的mrc-5细胞全部消化下来,制备成细胞悬液,按照合适的比例转入到新的微载体上继续
4 讨论
生物反应器微载体培养过程从实验室规模放大到中试甚至于 工业化生产规模的过程中,如何有效的放大一直是生产中的难点 (1)。有报道研究是在微载体培养过程中直接将上一级培养物(长满 细胞的微载体)作为种子接入到下一级生物反应器中,通过在旧球和 新球的重新分配而实现扩大培养(2),这种培养方法的优点在于操作 简单,污染机会小,微载体利用率高,可以连续使用,但是新旧载体 上的细胞处于不同的生长状态,最终旧载体上长满细胞而新载体尚 未长满,空球率高,细胞生长没有明显的对数生长期,这反应了细胞 群体中细胞的生理状态有明显的差别,细胞代次不一致,不符合于 药品生产的要求。试验结果表明使用0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶 消化液在BC-15L生物反应器内150rpm,消化10-15钟可获得活力 高且分散均匀的mrc-5细胞悬液。
作者简介:陈余娟(1983 —),四川成都人,研究生,成都康华生物制品有限公司,研究方向:生物医学。
BIOTECHWORLD 生物技术世界 1
1 材料
1.1 生物反应器 中国广州奇志公司生产的BC-15L(工作体积12L)以及BC100L型(工作体积80L)微载体培养系统。 1.2 细胞 中国成都康华生物制品有限公司MRC-5工作细胞库细胞,23代。 1.3 微载体 GE公司的cytodex I 型,按照厂家指导进行制备和灭菌处理, 使用浓度5g/l-15g/l。 1.4 培养液 日本株式会社的MEM培养液,补加10%的小牛血清(山西太原 润生),0.03%L-谷氨酰胺,1%非必须氨基酸(Gbico)。 1.5 消化液 0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。 1.6 细胞洗涤液 pH7.2 0.01mol/l PBS溶液
2 方法
2.1 mrc-5 细胞的准备 将MRC-5细胞复苏,并在2000ml K氏瓶中培养扩增,培养条 件为pH7.2—7.4、36-37℃、3%-5%CO2、待细胞长成致密单层后, 消化、收集细胞悬液。 2.2 微载体培养 mrc-5 细胞 2.2.1 微载体处理 cytodex I型微载体,按照GE公司说明将微载体用pH7.2 0. 01mol/LPBS水化膨胀,高压灭菌,用培养液置换1-2次后,浸泡2小 时以上,备用。 2.2.2 细胞接种 将细胞悬液接种到BC-15L细胞培养罐内,接种密度(1×105 个/m l ), 培养浓度5 g/L 。设置好培养参数(温度3 7 ℃, p H7 . 2 , DO50%,转速40rpm)进行培养,每天更换营养液,细胞在微载体上长
参考文献
[1] Kunitake R,Suzuki A,Lchihashi H,et al.Fully-automated roller bottle handling system for large scale culture of mammalian cells(j).J Biotechonology,1997,52(6):289-191. [2] Wang Y.Quyang F.Bead-to-bead transfer of Vero cells in microcarrier cultrure(J).Cytotechology,1999,31(31):221-224.
5min
10min
15minຫໍສະໝຸດ 图220min满单层后可进行二级放大。 2.2.3 微载体培养二级放大 种子罐细胞长满后,用PBS洗涤细胞三次,加入0.01%EDTA-
0.25%胰蛋白酶溶液(30ml/g)消化细胞,转速150rpm,消化5、10、15、 20分钟后取样观察细胞状态并测定细胞活力,细胞从载体上脱离下 来后,按比例将细胞悬液转入到BC-100L细胞培养罐扩增,设置好 培养参数进行培养。
扩大培养。
关键词:mrc-5细胞 微载体 规模化培养 cytodex I
中图分类号:Q2-3
文献标识码:A
文章编号:1674-2060(2015)05-0001-01
mrc-5细胞是来源于一个27岁的健康妇女(瑞典)的14周男性胚 胎,该细胞核型为46XY,衰老期为48群体倍增代。MRC-5原始种子 库为7代细胞,共481支。2005年该委员会向WHO建议并被批准建立 了新的细胞库,细胞代次为12代。MRC-5细胞株是世界卫生组织 (World Health Organization,WHO)推荐的可以用于人用疫苗生 产的标准人二倍体细胞株,其免疫原性好,具有良好的耐受性,无异 种移植致癌性,无外源因子污染,其规模化培养适宜生产多种病毒 性疫苗。到目前为止,mrc-5细胞被世界各地很多疫苗生产厂家用于 疫苗生产,比如人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV)。
从上图我们可以发现,当加入消化液5min微载体大多聚集在一 起,成团状,细胞有回缩现象,仅少数细胞脱离载体,处理10min,载 体上80%的细胞已经脱落,细胞活力95%,处理15min,细胞95%从微 载体上脱落,且形成单个分散的悬液,细胞活力92%,处理20min,细 胞完 全 脱 离 微载 体, 此时 的 细 胞 活 力 为8 5 % 。因 此, 选择0 . 01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液作用15min作为mrc-5细胞微载 体消化的最佳时间。