第三章 工业微生物的菌种选育

实例： 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、 文献 产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 产生菌为中性牙孢杆菌 →80度30分钟处理 度 分钟处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 曲利本蓝＋ 曲利本蓝 （羧甲基纤维素） 培养3～ 天 培养 ～4天，选择有凹陷圈的菌落 采样（ 采样（造纸 厂） 26株为组成 型 株为组成 个土样中获得62株 从285个土样中获得 株 个土样中获得 36株为诱导型 株为诱导型
（四）筛
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选
这一步是采用与生产相近的培养基和培养 条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验， 条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验， 以求得适合于工业生产用菌种。 以求得适合于工业生产用菌种。
（五）毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒 将其作为生产菌种应当十分当心， 的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与 食品工业有关的菌种，更应慎重。 食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家 规定，微生物中除啤酒酵母 脆壁酵母、 啤酒酵母、 规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲 米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试 霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试 验外，其他微生物作为食用， 验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以 上的毒性试验。 上的毒性试验。
（三）培养分离
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尽管通过增殖培养效果显著， 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微 生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步 在这 步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
从自然界筛选
• 2 、 采样季节 ： 以温度适中 ， 雨量不多的秋初为 采样季节： 以温度适中， 好。 • 3 、 采土方式 ： 在选好适当地点后 ， 用小萨子除 采土方式： 在选好适当地点后， 去表土， 取离地面5 15cm 处的土约10 cm处的土约 10g 去表土 ， 取离地面 5-15cm 处的土约 10g ， 盛入 清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记， 清洁的牛皮纸袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 标记 ， 记录 采样时间、地点、环境条件等，以备查考。 采样时间 、 地点 、 环境条件等 ， 以备查考 。 为了 使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样 使土样中微生物的数量和类型尽少变化， 品逐步分批寄回，以便及时分离。 品逐步分批寄回，以便及时分离。
诱变
物理、 物理、化学或生物诱变方法
•诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止 诱变育种：以诱发突变为基础的育种， 诱变育种 国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 国内外提高菌种产量、性能的主要手段。具有速度 收效大、方法简便等特点。 快、收效大、方法简便等特点。
一、诱变剂和诱变处理
• 物理诱变剂 ： 射线如紫外线 、 X—射线 、 γ—射 物理诱变剂： 射线如紫外线、 射线、 射线 射 快中子； 线，快中子； • 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是 紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线， 紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对 于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 • 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透 其他的几种射线都是电离性质的， 一般都由专业人员在专门的设备中使用， 力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否 则有一定危险性。 则有一定危险性。
第二节
诱变育种
• 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不 很高，一个基因的自然突变频率仅10 左右。 很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。 • 问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？ • 回复突变 ： 高产菌株在传代的过程中 ， 由于自然突变 回复突变：高产菌株在传代的过程中， 导致高产性状的丢失，生产性能下降， 导致高产性状的丢失 ， 生产性能下降 ， 这种情况我们 称为回复突变
食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。目前 已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
淀粉酶： α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 淀粉酶 黑曲霉、米曲霉、米根酶、 和地衣牙孢杆菌
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 度的手段，培养（固体、液体； 连续） 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
菌落的选出
从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法， 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长， 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。 上就可以初步识别。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 花了10年的时间从40 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
第一节 自然选育
新种分离与筛选的步骤 • 定方案 ： 首先要查阅资料 ， 了解所需菌种的生 定方案： 首先要查阅资料， 长培养特性。 长培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖 ： 人为地通过控制养分或培条件 ， 使所需 增殖： 人为地通过控制养分或培条件， 菌种增殖培养后，在数量上占优势。 菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。 发酵性能测定：进行生产性能测定。
（二）增殖培养
• 为了容易分离到所需的菌种， 为了容易分离到所需的菌种 ， 让无关的微生 物至少是在数量上不要增加， 物至少是在数量上不要增加 ， 可以通过配制选 择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制， 可选定糖 ， 淀粉 、 纤 例如碳源利用的控制 ， 可选定糖， 淀粉、 维素， 或者石油等， 以其中的一种为唯一碳源， 维素 ， 或者石油等 ， 以其中的一种为唯一碳源 ， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。 这样 生长 ， 而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
诱变剂的选择
碱基类似物和羟胺具有很高的特异性， 1 ． 碱基类似物和羟胺具有很高的特异性 ， 但很少 使用，回复突变率高，效果不大。 使用，回复突变率高，效果不大。 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 亚硝酸和烷化剂应用的范围较广， 伤较多。 伤较多 。 其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 超诱变剂” “ 超诱变剂 ” ， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变 剂之一。 剂之一。
•
目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势， 富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。 得可能。
富集的主要方案： 富集的主要方案： 定向培养: 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 条件，进行培养。
定向培养的富集方法
1、底物 3、培养时间 2、pH条件 pH条件
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的 沼泽土中，以细菌和放线菌为主， 沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化 合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如 一些野果生长区和果园内。 一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以 是植物，腐败物品，某些水域等。 是植物，腐败物品，某些水域等。
已工业化产品生产菌的介绍
抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下： 线菌（链霉素 四环素； 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等） 真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
氨基酸生产有关的微生物
60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵 年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵， 50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点： 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵： 人工诱变的方法， 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物， 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
3 ． 吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全 中断。 中断。 紫外线仍十分有效。 4 ． 紫外线仍十分有效 。 电离辐射是造成染色体 巨大损伤的最好诱变剂， 巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的 缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。 缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。
二、诱变育种步骤
•出发菌株的选择 出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备 处理菌悬液的制备 •诱变处理 诱变处理 •中间培养 中间培养 •分离和筛选 分离和筛选
第三章 工业微生物的 菌种选育
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基， 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物 有关合成产物的途径尽可能地简单， 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（ 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关） 菌无关） 生产特性要符合工艺要求