实验二总糖和还原糖的测定
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▪ 3、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什 么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？
六、改进实验建议
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▪ 附：仪器和试剂
▪ 主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管， 移液管等。
▪ 3,5-二硝基水杨酸试剂：
▪ 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠溶液中， 并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
▪ 乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml 10%氢氧化钠溶 液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。
▪
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。
在室温放置7-10天后使用。
▪ 6 mol•L-1 盐酸
▪ 10%氢氧化钠溶液
▪ 酚酞指示剂
▪ 碘～碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏 水中。
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三、实验步骤
1、葡萄糖标准曲线的制定 葡萄糖标准液的配制：准确称取100mg分 析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒 重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓 度为1mg/ml。
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取7支25×250mm的试管，分别按下表加入试剂：
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▪ （2）样品中总糖的水解提取：
▪ 准确称取10g新鲜材料（或1g材料干样粉末）， 放在锥形瓶中，加入10ml 6 mol•L-1 盐酸，15ml 水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于 白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完 全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1 滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液 呈微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上 述溶液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混 匀备用。
▪ 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双 糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多 糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行 测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还 原糖以葡萄糖含量计）。
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▪ 本实验是利用3，5～二硝基 水杨酸溶液（DNS法）与还 原糖溶液共热后被还原成棕 红色氨基化合物，在一定范 围内还原糖的量和棕红色物 质深浅的程度成一定比例关 系，可用于比色测定。操作 简便，快速，杂质干扰较少。
将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立
即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，
摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数
为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
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▪2、样品中总糖和还原糖含量的测定
▪ （1）样品中还原糖的提取： ▪ 准确称取10g新鲜材料（或2g材料干样粉 末），放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊 状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水 浴中保温20min，过滤，将滤液收集在100ml 容量瓶中，再定容至100ml。
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（3）样品中糖含量的测定： 取7支25×250mm试管分别按下表加入试剂：
管号
空白
还原糖
总糖
0 123 1 23
样品溶液（ml） 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
蒸馏水（ml） 2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
3,5二硝基水杨酸 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 (ml)
=
积（ml）×稀释倍数
测定用提取液体积（ml）× 样品重量（g）
样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数
总糖（mg•g-1）=
测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）
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五、讨论分析
▪ 1、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖 包括哪些？
▪ 2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？ 而在其测定前，又为何要用NaOH中和？
管号
0
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
相当于葡萄糖量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水（ml）
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
3,5二硝基水杨酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
OD
加完试剂后，与制作标准曲线时
相同的操作测定样品糖含量。
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四、实验结果
在Excel绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。 以表格形式列出实验数据，取样品的OD520平均值用标 准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品 中还原糖与总糖的含量。
还原糖毫克数×提取液总体
还原糖 （mg•g-1）
实验二 总糖和还原糖的测定
(3，5～二硝基水杨酸法)
《食品生物化学实验》课程
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1
一、实验目的
▪ 掌握3，5～二硝基水杨酸法测定待测 样品的总糖和还原糖含量的基本原理， 学会处理721型或722型分光光度计出 现的问题
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2
二、实验原理
▪ 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是 指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖， 双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是 还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
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六、改进实验建议
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▪ 附：仪器和试剂
▪ 主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管， 移液管等。
▪ 3,5-二硝基水杨酸试剂：
▪ 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠溶液中， 并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
▪ 乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml 10%氢氧化钠溶 液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。
▪
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。
在室温放置7-10天后使用。
▪ 6 mol•L-1 盐酸
▪ 10%氢氧化钠溶液
▪ 酚酞指示剂
▪ 碘～碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏 水中。
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三、实验步骤
1、葡萄糖标准曲线的制定 葡萄糖标准液的配制：准确称取100mg分 析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒 重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓 度为1mg/ml。
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取7支25×250mm的试管，分别按下表加入试剂：
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▪ （2）样品中总糖的水解提取：
▪ 准确称取10g新鲜材料（或1g材料干样粉末）， 放在锥形瓶中，加入10ml 6 mol•L-1 盐酸，15ml 水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于 白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完 全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1 滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液 呈微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上 述溶液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混 匀备用。
▪ 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双 糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多 糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行 测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还 原糖以葡萄糖含量计）。
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▪ 本实验是利用3，5～二硝基 水杨酸溶液（DNS法）与还 原糖溶液共热后被还原成棕 红色氨基化合物，在一定范 围内还原糖的量和棕红色物 质深浅的程度成一定比例关 系，可用于比色测定。操作 简便，快速，杂质干扰较少。
将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立
即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，
摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数
为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
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▪2、样品中总糖和还原糖含量的测定
▪ （1）样品中还原糖的提取： ▪ 准确称取10g新鲜材料（或2g材料干样粉 末），放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊 状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水 浴中保温20min，过滤，将滤液收集在100ml 容量瓶中，再定容至100ml。
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（3）样品中糖含量的测定： 取7支25×250mm试管分别按下表加入试剂：
管号
空白
还原糖
总糖
0 123 1 23
样品溶液（ml） 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
蒸馏水（ml） 2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
3,5二硝基水杨酸 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 (ml)
=
积（ml）×稀释倍数
测定用提取液体积（ml）× 样品重量（g）
样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数
总糖（mg•g-1）=
测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）
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五、讨论分析
▪ 1、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖 包括哪些？
▪ 2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？ 而在其测定前，又为何要用NaOH中和？
管号
0
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
相当于葡萄糖量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水（ml）
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
3,5二硝基水杨酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
OD
加完试剂后，与制作标准曲线时
相同的操作测定样品糖含量。
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四、实验结果
在Excel绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。 以表格形式列出实验数据，取样品的OD520平均值用标 准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品 中还原糖与总糖的含量。
还原糖毫克数×提取液总体
还原糖 （mg•g-1）
实验二 总糖和还原糖的测定
(3，5～二硝基水杨酸法)
《食品生物化学实验》课程
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一、实验目的
▪ 掌握3，5～二硝基水杨酸法测定待测 样品的总糖和还原糖含量的基本原理， 学会处理721型或722型分光光度计出 现的问题
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二、实验原理
▪ 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是 指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖， 双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是 还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
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