治疗方案制定

CIK细胞培养程序

1. 将分离机采集细胞缓慢加在细胞分离液（1.077 g/ml）上，体积比为1:1，800⨯g，室温离心20分钟；

2. 收集界面的白色絮状细胞加入30ml的低糖DMEM培养基，轻轻吹打混匀，300⨯g，室温离心10分钟；

3. 重复离心洗涤共3遍；

4. 收取细胞轻轻吹打混匀，加入无血清培养基及IFN-γ500 U/ml置37℃、5% CO2孵箱中培养；

5. 24 h后加入IL-2 300 U/ml，CD3 10 ng/ml，IL-1 100 U/ml 继续培养，；

6. 每天观察细胞生长状态并根据情况进行换液及加入IL-2 300 U/ml进行扩增；

7. 细胞收集：第14-20天收集细胞，离心弃上清液，用生理盐水洗涤细胞2 次以上，重新混匀，悬于100～200 ml 输注用生理盐水中。

附件30-32

治疗方案制定

从理论上来说，几乎每一位肿瘤病人都可以从免疫治疗中获得益处。早期肿瘤病人由于机体免疫系统尚未受到肿瘤的严重影响，对免疫治疗的应答较好，疗效相对也会更好。CIK 细胞对多种实体肿瘤均有明显疗效，对白血病也有很好作用，尤其是骨髓移植或化疗缓解后能够清除残存的肿瘤细胞，防止复发。CIK 细胞治疗肿瘤的疗效除与输注细胞数量及活性有明显关系外，还与患者的选择有很大关系。

适应证

CIK 细胞可用于下述肿瘤患者的辅助治疗：

1）手术后患者，可防止肿瘤转移、复发；

2）无法进行手术、放疗、化疗的中晚期患者；

3）放疗、化疗失败的患者；

4）放疗、化疗后、间期患者的综合治疗；

5）常规药物治疗无效的癌性胸、腹腔积液患者；

6）骨髓移植后或化疗缓解后的白血病患者；

病例选择

⑴患者预期生存>3 个月，生存质量评分（KPS）> 60%。

⑵重要生命器官功能正常，血胆红素< 68 μmol/L，天冬氨酸氨基转移酶< 90 IU/L，

肌酐< 353 μmol/L，白细胞计数> 3.5×109/L，血小板计数> 80×109/L，红细胞压积>

0.20。

禁忌证

1) 不符合纳入标准；

2) 合并心、肺、肝、肾等重要脏器的功能障碍；

3) 自身免疫性疾病的病人；

4) 凝血功能障碍如血友病，或凝血酶原活动度(PTA) < 50%，血小板（PLT）<

40×109/L；

5) 正在使用免疫抑制药物，或器官移植后长期使用免疫抑制剂的患者；免疫功能缺

陷患者；

6)重创伤、手术、出血、自发性细菌性腹膜炎、急性感染发作期及伴有休克的患者；

7) 妊娠和哺乳期妇女；

8) 高度过敏体质或者有严重过敏史者；

9) 患有精神疾病者、酗酒、有药瘾或有其它不宜进行临床试验者。

中断治疗

在治疗期间出现明显的毒副作用；重要生命器官出现明显功能异常；患者因某种原因提出终止治疗。

治疗途径

根据治疗途径可分为全身治疗和局部治疗。全身治疗是通过静脉输注进行；局部治疗是将收获的浓缩CIK 细胞直接注入病灶部位（胸、腹腔积液患者直接注入胸、腹腔内），也可通过介入方法。

治疗过程

1、首先用成份血分离机采集病人外周血单个核细胞，大约50～100毫升；或第1～

3 天连续给患者注射IL-2，每天50 万U，第

4 天采集患者自体外周血50～100 ml；

2、而后将采集到的细胞在超洁净实验室进行分离、诱导、扩增、激活等培养过

程及质检；

3、于培养的第15天左右收获并配制成回输液，间隔2-7天分5-8次回输细胞；

4、观察治疗反应及疗效；间隔3～4个月可进行下一疗程的治疗。

输注CIK 细胞数量

研究表明，当输注的CIK 细胞数达到一定数量时就可出现明显的治疗效果，其效果并不随着输注细胞增加而呈线性增大。要求：每次输注的细胞数应> 1×109，每疗程输注细胞数应> 8×109。输注的细胞中可视情况加入IL-2 100 万U。

细胞培养相关表格

细胞回输变更计划

细胞室：

姓名由于更改治疗计划如下：改至

主治医师签字：

日期：

回输细胞报告单

细胞状况报告单

病案号：

细胞培养记录表

检测报告单

细菌检测报告

姓名性别年龄住院号标本细胞培养液

（注：本次结果仅对本次标本有效）

检验医师：检验日期：

CIK细胞免疫治疗报告书

治疗过程：

CIK培养情况：

CIK光镜照片CIK流式细胞仪检测结果图

培养人签名：

自体免疫细胞制剂制备质控标准

CIK细胞制备后数量、活性检定

取离心洗涤后的细胞计数，（1）采用瑞氏－姬姆萨染色计数单个核细胞比例（应不低于90%）；（2）采用台盼蓝染色计数活细胞比例（应不低于97%）。

CIK细胞制备后检定报告单

实验人：复核人：

实验日期：

检测报告单

细菌检测报告

姓名性别年龄住院号

标本细胞培养液

（注：本次结果仅对本次标本有效）

检验医师：检验日期：

用瑞氏－姬姆萨染色标准操作规程：

1. 细胞涂片；

2. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；

3. 稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度

酌情而定)；

4. 稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜

上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入；

5. 染色30-40分钟；

6. 分色：用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上，待干，勿用滤纸吸干；

7. 显微镜观察计数。

用台盼蓝染色标准操作规程：

1. 取细胞悬液10μl，用培养基将其稀释到2000~5000个/毫升；

2. 取100μl 稀释后的细胞悬液，加入100μl 4%台盼兰溶液，轻轻混匀；

3. 5分钟后用血球计数板在镜下计数细胞；

4. 计算细胞活性，即未着色细胞占总细胞数的百分比；

细胞鉴定标准操作规程

1.形态学观察：

显微镜下可见，细胞呈圆形，体积增大，胞质饱满，折光性好，有颗粒，核增大，细胞表面有很多突起和伪足。

2.表面抗原的检测：

在细胞培养开始和结束(第20天)，取细胞进行实验，实验各组取细胞浓度为2 ×106/mL的细胞悬液50 uL，加入不同单抗(CD3-FITC，CD56-PE)，另设对照，室温避光孵