第五章分子标记辅助育种
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植物分子育种
分子标记辅助育种
DNA标记辅助选择育种是利用与重要经济 性状连锁的DNA标记或功能基因来改良动、 植物品种的现代分子育种技术；
基因工程育种
转基因育种则是通过向受体植物转移有重要 功能的基因或一组功能相关的基因来改良植 物性状的育种技术。
分子标记辅助育种
第一节 遗传标记发展
标记辅助育种（Marker assisted selection) 是利用与目标性状基因紧 密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟 踪选择的一项育种技术。 遗传标记(genetic markers)是基因型的 特殊的易于识别的表现形式。
CAP 标记
SBE1片段
Left primer
Indica (1) Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT
Indica (51) TACTTGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TACTAGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT
Molecular Marker
Based on variation in the DNA sequence
Single base mutation – Insertion / deletion
– Rearrangement
Advanced in Molecular Markers
????
CAPACITY
理想的遗传标记主要应具备以下标准:
– (1)具有较强的多态性; –(2)表现为共显性(codominance); –(3) 选择中性，对主要的农艺性状没有 影响; –(4) 容易操作．自动化程度高。 –5)重复性好； –6)所得数据可在实验室之间交流和比较。
多态性或遗传多态现象(Genetic Polymorphism)是指在一个生物群体中， 同时和经常存在两种或两种以上不连续的 变异型或基因型，每种类型的比例较高, 不 能由重复突变来维持。
DNA Chips ISSR AFLPs SSRs RAPDs RFLPs
1985
1990
1995
2000
第二节 分子标记技术
几种常用的分子标记技术
l 基于Southern杂交的分子标记
基于PCR技术的分子标记
一、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基于Southern杂交的分子标记
限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA）
建立基因组DNA的质粒文库
基
设计探针，筛选重组克隆
本
对阳性克隆DNA插入序列测序
步
根据SSR两侧序列设计并合成引物
骤
PCR扩增反应
凝胶电泳检测多态性
http://www.agron.missouri.edu
Chromosome 1, Region 11 (bin 1.11)This page summarizes the data available describing features found in bin 1.11 in maize. What is a bin, and why is it important? This region is highlighted in red on the image of maize chromosomes to the right. You can click on regions of that image to move to other portions of the maize genome.Genes in Bin 1.11 Other Loci in Bin 1.11 Bin 1.11 High-Density Map Regions Sequences in Bin 1.11 EST Contigs in Bin 1.11 SSRs in Bin 1.11 BACs in Bin 1.11 Mapped loci w/ accessions in Bin 1.11 Map Locations of Sequences in Bin 1.11
Right primer
SNP标记
SBE1片段
Left primer
Indica (1) Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT
PCR-based markers
1 RAPDs
Anonymous markers - but can be converted to SCARs Dominant markers - homozygotes cannot be distinguished from heterozygotes Fast, easy and cheap - commercial primer sets available
1 RFLP标记
RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
RFLP标记的特点
（1）遍布于整个基因组， 数量 几乎是无限的； （2）无表型效应， 不受发育阶段器官特异性限制； （3）共显性， 可区分纯合子和 杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂， 难以用于大规模的育种实践中
1 分子图谱的构建
主要包括以下步骤：
–根据遗传材料之间的多态性确定亲 本组合，建立作图群体； –群体中不同植株或品系的标记基因 型分析； –标记间的连锁关系。
构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及
分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大， 否则会降低所建图谱的准确度和适用性。
用于分子标记的遗传作图可分为两类：
SSRs in Bin 1.11 Here are the 38 SSRs that have been verified to be in this chromosomal region. (AC)20 p-umc1797(ACAA)4 p-umc1421(ACC)4 p-umc1500(ACC)5 p-umc1725(AG)10 p-umc1538(AG)6 p-umc1220(AG)8 pumc1553(AGA)7 p-umc1737(ATGGG)4 p-umc1630(CA)10 pmmc0221(CA)14 p-mmc0031(CA)15 p-mmc0011(CAAAA)4 pumc1111(CCG)4 p-umc1681(CGT)5 p-umc2241(CT)8 pumc1064(GA)8 p-umc1862(GAGCA)4 p-umc1118(GCGCCG)4 pumc1744(GCT)4 p-umc2045(GGC)4 p-umc2244(GGT)10 pumc1331(GT)7(GA)7 p-umc1009(TC)8 p-umc1129(TCTCC)4 pumc2243(TGC)6 p-umc2242AAG p-phi120ACC p-phi227562AG(16) p-bnlg2331AG(22) p-bnlg1055AG(31) p-bnlg2123AGG pphi265454ATCC p-phi064p-(GATA)2(GACA)2p-bnlg131p-bnlg257pbnlg504p-bnlg667
Right primer
G C A T
变性，退火
PCR
G C
CEL I
A T
变性
走胶，检测
第三节 分子标记在育种中的应用
分子图谱的构建 品种、品系鉴定和杂交种纯度分析 亲缘关系分析 基因标记及标记辅助育种（Markerassisted Selection，MAS） 数量性状因位点（QTL）的分子标记 辅助选择
a) 暂时性分离群体，包括F2群体、BC等
b) 永久性分离群体，包括重组自交系群体、
加倍单倍体群体等
自花授粉作物作图群体的构建方法
P1×P2 F1 F2 F3 F4 异花授粉作物作图群体的构建方法 ABCDEfG AbcdEfg
对B、D、G位点来说，相当于F2
3 AFLP marker
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），又称选 择性限制片段扩增（Selective Restriction Fragment Amplification）。
双酶切
连接节头
预扩增
选择性扩增
The specific band in Xianyou 63 amplified with AFLP primer combination E-AAC/M-CAT
2 SSR marker
简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）或称微卫星DNA （Microsatellite Repeat）、简单串联重 复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。
微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果
二、 基于PCR技术的分子标记
随机扩增片段长度多态性DNA （Random Amplified Polymorphic DNA） 特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP） 简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR） 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
Indica (51) TCCATGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TCCATc TTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT
遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker）
–同工酶:酯酶和过氧化物酶 –贮藏蛋白
分子标记（molecular marker）
分子标记的优越性：
直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受季节、环境 的限制，不存在表达与否的问题； 数量极多，遍及整个基因组； 多态性高，利用大量引物、探针可完成覆 盖基因组的分析； 表现为中性，即不影响目标性状的表达， 与不良性状无必然的连锁； 许多标记为共显性。
分子标记辅助育种
DNA标记辅助选择育种是利用与重要经济 性状连锁的DNA标记或功能基因来改良动、 植物品种的现代分子育种技术；
基因工程育种
转基因育种则是通过向受体植物转移有重要 功能的基因或一组功能相关的基因来改良植 物性状的育种技术。
分子标记辅助育种
第一节 遗传标记发展
标记辅助育种（Marker assisted selection) 是利用与目标性状基因紧 密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟 踪选择的一项育种技术。 遗传标记(genetic markers)是基因型的 特殊的易于识别的表现形式。
CAP 标记
SBE1片段
Left primer
Indica (1) Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT
Indica (51) TACTTGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TACTAGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT
Molecular Marker
Based on variation in the DNA sequence
Single base mutation – Insertion / deletion
– Rearrangement
Advanced in Molecular Markers
????
CAPACITY
理想的遗传标记主要应具备以下标准:
– (1)具有较强的多态性; –(2)表现为共显性(codominance); –(3) 选择中性，对主要的农艺性状没有 影响; –(4) 容易操作．自动化程度高。 –5)重复性好； –6)所得数据可在实验室之间交流和比较。
多态性或遗传多态现象(Genetic Polymorphism)是指在一个生物群体中， 同时和经常存在两种或两种以上不连续的 变异型或基因型，每种类型的比例较高, 不 能由重复突变来维持。
DNA Chips ISSR AFLPs SSRs RAPDs RFLPs
1985
1990
1995
2000
第二节 分子标记技术
几种常用的分子标记技术
l 基于Southern杂交的分子标记
基于PCR技术的分子标记
一、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基于Southern杂交的分子标记
限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA）
建立基因组DNA的质粒文库
基
设计探针，筛选重组克隆
本
对阳性克隆DNA插入序列测序
步
根据SSR两侧序列设计并合成引物
骤
PCR扩增反应
凝胶电泳检测多态性
http://www.agron.missouri.edu
Chromosome 1, Region 11 (bin 1.11)This page summarizes the data available describing features found in bin 1.11 in maize. What is a bin, and why is it important? This region is highlighted in red on the image of maize chromosomes to the right. You can click on regions of that image to move to other portions of the maize genome.Genes in Bin 1.11 Other Loci in Bin 1.11 Bin 1.11 High-Density Map Regions Sequences in Bin 1.11 EST Contigs in Bin 1.11 SSRs in Bin 1.11 BACs in Bin 1.11 Mapped loci w/ accessions in Bin 1.11 Map Locations of Sequences in Bin 1.11
Right primer
SNP标记
SBE1片段
Left primer
Indica (1) Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT
PCR-based markers
1 RAPDs
Anonymous markers - but can be converted to SCARs Dominant markers - homozygotes cannot be distinguished from heterozygotes Fast, easy and cheap - commercial primer sets available
1 RFLP标记
RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
RFLP标记的特点
（1）遍布于整个基因组， 数量 几乎是无限的； （2）无表型效应， 不受发育阶段器官特异性限制； （3）共显性， 可区分纯合子和 杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂， 难以用于大规模的育种实践中
1 分子图谱的构建
主要包括以下步骤：
–根据遗传材料之间的多态性确定亲 本组合，建立作图群体； –群体中不同植株或品系的标记基因 型分析； –标记间的连锁关系。
构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及
分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大， 否则会降低所建图谱的准确度和适用性。
用于分子标记的遗传作图可分为两类：
SSRs in Bin 1.11 Here are the 38 SSRs that have been verified to be in this chromosomal region. (AC)20 p-umc1797(ACAA)4 p-umc1421(ACC)4 p-umc1500(ACC)5 p-umc1725(AG)10 p-umc1538(AG)6 p-umc1220(AG)8 pumc1553(AGA)7 p-umc1737(ATGGG)4 p-umc1630(CA)10 pmmc0221(CA)14 p-mmc0031(CA)15 p-mmc0011(CAAAA)4 pumc1111(CCG)4 p-umc1681(CGT)5 p-umc2241(CT)8 pumc1064(GA)8 p-umc1862(GAGCA)4 p-umc1118(GCGCCG)4 pumc1744(GCT)4 p-umc2045(GGC)4 p-umc2244(GGT)10 pumc1331(GT)7(GA)7 p-umc1009(TC)8 p-umc1129(TCTCC)4 pumc2243(TGC)6 p-umc2242AAG p-phi120ACC p-phi227562AG(16) p-bnlg2331AG(22) p-bnlg1055AG(31) p-bnlg2123AGG pphi265454ATCC p-phi064p-(GATA)2(GACA)2p-bnlg131p-bnlg257pbnlg504p-bnlg667
Right primer
G C A T
变性，退火
PCR
G C
CEL I
A T
变性
走胶，检测
第三节 分子标记在育种中的应用
分子图谱的构建 品种、品系鉴定和杂交种纯度分析 亲缘关系分析 基因标记及标记辅助育种（Markerassisted Selection，MAS） 数量性状因位点（QTL）的分子标记 辅助选择
a) 暂时性分离群体，包括F2群体、BC等
b) 永久性分离群体，包括重组自交系群体、
加倍单倍体群体等
自花授粉作物作图群体的构建方法
P1×P2 F1 F2 F3 F4 异花授粉作物作图群体的构建方法 ABCDEfG AbcdEfg
对B、D、G位点来说，相当于F2
3 AFLP marker
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），又称选 择性限制片段扩增（Selective Restriction Fragment Amplification）。
双酶切
连接节头
预扩增
选择性扩增
The specific band in Xianyou 63 amplified with AFLP primer combination E-AAC/M-CAT
2 SSR marker
简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）或称微卫星DNA （Microsatellite Repeat）、简单串联重 复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。
微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果
二、 基于PCR技术的分子标记
随机扩增片段长度多态性DNA （Random Amplified Polymorphic DNA） 特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP） 简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR） 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
Indica (51) TCCATGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TCCATc TTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT
遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker）
–同工酶:酯酶和过氧化物酶 –贮藏蛋白
分子标记（molecular marker）
分子标记的优越性：
直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受季节、环境 的限制，不存在表达与否的问题； 数量极多，遍及整个基因组； 多态性高，利用大量引物、探针可完成覆 盖基因组的分析； 表现为中性，即不影响目标性状的表达， 与不良性状无必然的连锁； 许多标记为共显性。