分子生物学检测技术简介

分子生物学检测技术简介分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。

近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。

1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。

一、核酸分子杂交（一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。

应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。

到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。

核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。

探针标记的好坏决定检测的敏感性。

1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。

根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。

2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。

由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。

3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。

该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。

目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。

该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。

其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。

标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。

本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。

4、分支链DNA(bDNA)技术近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和HIV等的研究。

该方法主要是通过将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上，然后依次加入待测核酸和悬挂有多个支链的信号探针进行杂交，每个支链DNA都结合有放大信号的分子(如碱性磷酸酶)，最后通过利用化学发光检测核酸的含量。

bDNA技术是目前核酸直接量化检测技术中灵敏度最高的方法之一。

但该方法成本较高，不利于其普及应用。

5、原位杂交直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应。

该技术可检出细胞中单拷贝mRNA，估算病毒在宿主细胞中复制和转录的程度，对于病毒感染（特别是具有长潜伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的诊断很有用。

6、液相杂交液相杂交酶免疫法量化检测核酸扩增产物这种方法同固相杂交量化检测核酸扩增产物原理大致相同，只是将反应体系换为液相环境。

应用液相杂交量化检测维生素D结合蛋白基因，在PCR扩增时通过掺入法使产物上挂有地高辛分子，再通过液相杂交与标记有生物素的探针结合后，被包被有链亲和素的酶标微孔板捕获，利用辣根酶标记的地高辛抗体使酶反应底物(OPD或TMB)显色。

据报道，核酸扩增产物与特异性探针在液相中的杂交效率要高于在酶标微孔板上的结合，液相杂交的灵敏度通常是固相杂交的10～20倍，可以检测到pg水平。

二、聚合酶链反应（PCR）PCR是近年来发展起来的一种快速的DNA片段扩增技术，它通过分别与双链目的DNA序列两个3’端互补的寡核苷酸引物，由Taq DNA聚合酶从5’到3’进行一系列DNA聚合反应，扩增出所需要的目的DNA。

由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长，因此，20次PCR循环将产生约一百万倍（220）的扩增产物。

这种1985年由Kary Mullis 建立的方法最早在美国Cetus公司人类遗传学研究室应用于人β-珠蛋白DNA 的扩增及镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。

随后迅速发展起来，将基因诊断提高到一个崭新的阶段。

PCR反应的设计和优化：PCR技术自建立以来，几年内就成为一项广为应用的研究技术。

PCR 之所以得到普及主要是因为它灵敏、特异、高效、简便。

按照最基本的定义，PCR只不过是在适宜的缓冲液中将样本DNA与寡核苷酸引物、脱氧核苷三磷酸及热稳定的Taq DNA聚合酶结合起来，然后反复加热和冷却若干小时，直到获得所需的扩增量。

但事实上，PCR是一个比较复杂、迄今尚未完全明了的生物化学反应。

在反应中各种反应成分之间的动态的相互作用决定着产物的质量。

尽管在多数情况下，反应的最终结果比较好，但如果要获得更好的结果，就有很多参数需要进一步探讨。

由于PCR的应用很广泛，因此，不可能有这样一套条件，它在任何情况下都能保证反应地成功进行。

但是，一般有一种标准反应，可以适用于大多数的DNA扩增反应，即使不能适应，它至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。

标准PCR的体积通常为50μl或100μl，除样品DNA外，还包括50mMKCl，10mM Tris-HCl （Ph 8.4，室温），1.5mM MgCl2，100μg/ml明胶，0.25μM的各种引物，200μM的各种脱氧核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP），以及2.5 单位的TaqDNA聚合酶。

当然，样品DNA的类型是可变的，但通常都要具有102~105拷贝的模板（例如，0.1μg人基因组DNA），通常还要加几滴矿物油，以密封反应，并防止反应体积的减小。

利用这些条件可扩增DNA的靶序列的范围很大。

当上述条件不能产生理想的结果时，即必须进行PCR的优化。

(一) PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是Mg2+离子，其浓度对扩增的专一性和扩增量有重大影响。

通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP的浓度为200μM时），但有时需采用不同的Mg2+浓度。

Mg2+浓度过高，通常会导致非特异性扩增产物的累积，而浓度过低时通常会降低扩增量。

最近证明少用或不用KCl和明胶对反应较为有利。

四种脱氧核苷酸的浓度通常每种都是50~200μM。

过高的浓度会导致聚合酶将其错误掺入，因此应当避免。

浓度为50μM 和200μM时，足以合成6.5μg 和25μg的DNA。

由于脱氧核苷酸定量地与Mg2+结合，因此反应中的dNTP的含量将决定游离Mg2+的含量。

在标准反应中，4种脱氧核苷酸的最终浓度为0.8mM，因此原来的1.5mM MgCl2中剩下0.7 mM未与dNTP结合。

所以，如果dNTP的浓度有很大的改变，MgCl2的浓度也必须随着改变。

Taq DNA 聚合酶通常浓度为2.5单位/100μL反应液。

对于含有序列非常复杂的DNA 样品（如染色体组DNA）的扩增反应，Taq DNA聚合酶的最适浓度通常为1~4单位/100μL。

浓度高于此水平时，将导致非特异性PCR产物增加。

（二）循环参数也是影响PCR反应的一个重要因素。

标准反应中，将样品快速加热至90~95℃，使双链DNA 变性，再快速冷却至40~60℃，使引物退火结合到互补序列上，然后加热至70~75℃用TaqDNA聚合酶延伸退火引物。

在70~75℃下保温时间因被扩增的靶DNA长度而异。

（如果靶序列含约150个碱基或更短，就可以取消整个延伸过程。

聚合酶在较低温度时仍保持很强的活性，延伸过程有退火转变为变性时即可完成）。

过渡时间，即从一种温度转变到另一种温度所需要的时间，取决于所用设备的类型。

除了有特殊情况外，这种变温速率并不重要，因而应尽量加快过渡转换，从而缩短实验时间。

但是为了确保样品达到所需的温度，应该在扩增过程中测定样品的温度，以确定特定反应中的实际过渡时间。

用一根微探针温差电偶和一台数字式万用表即可达到这个目的。

变性时温度不够是导致PCR反应失败的一个常见原因，但过度变性也是不必要的，应尽可能保持聚合酶活性在整个反应过程中都达到最高水平。

退火时的温度取决于引物的长度和GC含量。

对GC含量约50%，长20个碱基的典型的寡核苷酸引物来说，通常用55℃作为起点温度，尽管较高的温度对提高引物的特异性是必要的，由于在反应的混合物中存在着极其过量的引物，杂交可以在瞬间内完成，因此，不需要长时间退火。

有时，引物只有12~15个碱基，退火温度需达40~45℃。

然而，这样短的引物在72℃的延伸温度下不可能保持退火状态。

利用聚合酶在较低温度时的部分活性将引物延伸几个碱基，使之稳定，就可以解决这个问题。

这可以通过在50~60℃时进行保温或将温度从40℃逐渐升高到72℃来实现。

简并引物与靶序列常常会发生多处错误配对，这可以采用类似方法解决。

在同一温度下使引物退火和延伸是可能的。

在55℃以上的温度同时退火和延伸，除了可将反应程序简化为两温度循环外，还可进一步提高反应的专一性。

（三）引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

现在对高效而专一性强的引物的选择仍然是凭经验。

没有一套规则能确保高效引物对的合成。

但是遵循某些原则，则有助于引物的设计。

（1）长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27bp。

引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证产物的特异性。

（2）G+C含量G+C含量一般为40%~60%。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下形成50%寡核苷酸双链的温度，有效启动温度一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm =4 （G+C）+2（A+T）估计引物Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

（3）碱基的随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3’端不应超过3个连续的G 或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。

（4）引物自身引物自身之间存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构或引物本身复性。