课题3 血红蛋白的提取与分离
血红蛋白的提取和分离
4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽 链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会 解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质 形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电 荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷 量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷 差别，使电泳迁移率完全取决于分子的 大小。
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 （一）样品处理
1、红细胞的洗涤：
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍 体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液 →反复洗涤直至上清液无黄色
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：
血红蛋白的提取和分离 课题3 血红蛋白的提取和分离
主要内容： 一、基础知识 二、实验操作
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）
1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通 道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法
端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意 不要破坏凝胶面。
（3）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品
渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
（4）洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到
适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离 - 知识梳理
的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是
和
，
在测定蛋白质分子量时通常使用
。
电泳速率完全取决于
。
二实 验 操 作 蛋白质的提取和分离一般分为四步
：
↓
:
↓
：
↓
：
一基 础 知 识
（一）样品处理
1.红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是
，采集的血样要及时
分离红细胞，分离时采用
离心（500r/min、离心2min），然
除去
；离心速度过高和时间过长会使
等一同沉淀，
达不到分离的效果。
2. 色谱柱填料的处理 商品凝胶使干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用
加热，逐渐升温至接近
沸腾，通常只需1—2h。这种方法不但
，而且可以除去凝胶中可能带有
的
，排除胶粒内的
。
3. 凝胶色谱柱的装填 在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量
【旁栏思考题】
【P70】你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较 大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移 动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路 程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子 质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质 量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内 ，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过， ，影响分离的效果。
人教版高二选修一专题5课题3《血红蛋白的提取和分离》 课件 (共47张PPT)
③凝胶色谱柱的装填方法：
A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情 况下将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填 时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀
注意：
1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。
2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱 洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
2.作用:
能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影 响，维持PH基本不变。
一、基础知识
（二）缓冲溶液
3.缓冲溶液的配制:
通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。 调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范 围内使用的缓冲液。
4.在本课题中使用的缓冲液: 磷酸缓冲液
5.目的利：用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血
(4)四个原因：是指蛋白质分子结构多样性的原因 有4个：
①组成蛋白质的氨基酸分子的种类不同；
②组成蛋白质的氨基酸分子的数量成百上千；
③组成蛋白质的氨基酸分子的排列次序变化多端；
④蛋白质分子的空间结构不同。
(5)五大功能：是指蛋白质分子主要有5大功能(由分子结构 的多样性决定)：
①有些蛋白质是构成细胞和生物体的重要物质，如人和动 物的肌肉主要是蛋白质；
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
凝胶 凝胶电泳
（二）操作过程
色谱 法
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1.用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行 DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血 红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
垂直向下移动，无规 则扩散进入颗粒内部
血红蛋白的提取和分离教案
血红蛋白的提取和分离教案血红蛋白的提取和分离教案引言血红蛋白是存在于人类和其他脊椎动物血液中的一种蛋白质。
它具有运输氧气和二氧化碳的重要功能，并且是维持身体正常运作所必需的。
本篇文章将为您介绍血红蛋白的提取和分离方法，帮助您更好地理解和研究这一重要蛋白质。
一、血红蛋白的提取方法1. 在提取血红蛋白前，我们需要准备以下材料：- 外周血样本- 1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）- 过硫酸铵溶液- 冷冻离心管- 高速离心机- 冷藏离心机2. 提取步骤如下：- 将外周血样本收集到冷冻离心管中，并添加适量的1M磷酸盐缓冲液。
- 现将样本离心5分钟，以将红细胞与其他成分分离开。
- 小心地将上清液转移至新的冷冻离心管中。
- 向上清液中加入过硫酸铵溶液，使最终浓度达到约20%。
- 待浑浊沉淀形成后，使用高速离心机以12000g离心20分钟。
- 移除上清液，留下血红蛋白沉淀。
- 用冷磷酸盐缓冲液轻轻洗涤血红蛋白沉淀，以除去残留的过硫酸铵。
- 用冷磷酸盐缓冲液重新悬浮血红蛋白沉淀。
二、血红蛋白的分离方法1. 准备以下材料：- 细胞膜- 3M尿素溶液- 离心管- 高速离心机2. 分离步骤如下：- 将提取得到的血红蛋白沉淀加入3M尿素溶液中。
- 使其达到适当浓度，将溶液倒入离心管中。
- 将离心管放入高速离心机中，以12000g离心15分钟。
- 小心地移除上清液，保存血红蛋白沉淀。
- 将血红蛋白沉淀重新悬浮于适量的磷酸盐缓冲液中。
- 将悬浮液转至新的离心管中，在高速离心机中以12000g离心15分钟。
- 再次移除上清液，留下较纯的血红蛋白。
三、实验注意事项1. 在实验过程中，应注意安全操作，避免对自身和他人造成伤害。
2. 所用材料应严格按照规定使用，避免交叉感染或污染。
3. 实验室工作台面应保持干净整洁，及时清理实验废弃物。
4. 离心过程应注意离心管的平衡布置，以防离心过程中发生意外。
结论通过本文的介绍，我们了解到了提取和分离血红蛋白的基本方法。
课题3 血红蛋白的提取和分离
④洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗
脱瓶，在50cm高的操作压下，
用300ml的20mmol/l的磷酸 缓冲液（pH为7.0）充分洗涤 平衡12小时。
注意：
液面不要低于凝胶表面， 否则可能有气泡混入。
不能发生洗脱液流干， 露出凝胶颗粒的现象。
3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面
打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口
（2）缓冲溶液的配制 通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比
例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液
在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是磷酸缓冲液，
目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)
5.电泳 （1）概念: 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 （2）原理 ①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所
带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。
（3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N‵—亚甲基 双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维 网状结构的凝胶 ②SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复 合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的是单条肽 链的分子量，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物， SDS所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩
SDS带有大量的负电荷
血红蛋白的提取和分离教案
血红蛋白的提取和分离教案教案一: 血红蛋白的提取和分离教学目标:- 理解血红蛋白的结构和功能。
- 学习血红蛋白的提取和分离方法。
- 掌握实验室中分离血红蛋白的步骤和操作技巧。
教学步骤:引入活动:在开始实验之前，首先向学生介绍血红蛋白的结构和功能，以及为什么需要提取和分离血红蛋白。
1. 血红蛋白的提取:a. 实验材料准备:- 鲜血样本- 磷酸缓冲溶液（pH 7.4）- 离心管- 离心机- 冷藏器b. 实验步骤:1) 将鲜血样本取出，用磷酸缓冲溶液稀释。
2) 将稀释后的样本置于离心管中，离心10分钟。
3) 将离心后的上清液转移至新的离心管中，置于冷藏器中。
2. 血红蛋白的分离:a. 实验材料准备:- 血红蛋白样本- 离心管- pH 4.7缓冲溶液- pH 5.2缓冲溶液- pH 6.0缓冲溶液- pH 7.0缓冲溶液b. 实验步骤:1) 将血红蛋白样本转移到离心管中。
2) 分别加入pH 4.7、pH 5.2、pH 6.0和pH 7.0缓冲溶液，使其达到不同的酸碱度。
3) 转动离心管，使其充分混合。
4) 将混合溶液置于冰箱中冷藏一段时间。
5) 通过离心，收集上层液体，然后分别加入酸、碱溶液，使其达到酸碱中和。
6) 重复以上步骤，直到获得纯净的血红蛋白。
实验注意事项:- 实验过程中要注意安全，佩戴实验室衣物和手套。
- 实验器材要严密封闭，避免反应物外泄。
- 实验后要彻底清理实验场地。
教学总结:通过本次实验，学生可以了解血红蛋白的结构和功能，并掌握了提取和分离血红蛋白的方法。
同时，学生也了解了实验室实验的注意事项和操作技巧。
5.3血红蛋白的提取和分离
电泳缓冲液
如何让蛋白质在聚丙烯酰胺中的电泳迁移率只取决于分子量大小？
SDS
1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系 统中加入SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决 于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。
四、 SDS-聚丙烯酰胺（垂直板）凝胶电泳法
（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
结果分析: • 测定的只是单个亚基或肽链的相对分子质量，而不是完整分子的
相对分子质量；
• 要测定蛋白质真正的相对分子质量，应与其他测定蛋白质相对分 子质量的方法加以校正。
五、 凝胶电泳法
常见种类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分类 琼脂糖 凝胶电 泳
SDS-聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳
红细胞洗涤 离心+洗涤：去血浆蛋白等杂蛋白 血红蛋白释放 吸水涨破释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液 离心分离血红蛋白与其他杂质
粗分离：透析 除去相对分子质量较小的杂质+更换样品缓冲液
凝胶色谱操作
凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填
样品的加入与洗脱
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定蛋白质纯度
三、提取分离血红蛋白的实验操作
镰刀型红细胞贫血症（血红蛋白分子结构异常）
一、凝胶色谱法
发现历史： ·1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。 ·他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以
不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为 “色谱法”。
一、凝胶色谱法
1.凝胶：由多糖类化合物构成的多孔载体。 孔:贯穿凝胶的通道。 2.色谱法（层析法）
总结思：
1、凝胶色谱法原理？ 2、缓冲溶液作用？ 3、电泳原理？
血红蛋白的提取和分离习题带答案
课题3 血红蛋白的提取和分离【学习目标】1、简述蛋白质提取和分离的基本原理2、理解蛋白质提取与分离的实验操作过程【重点与难点】重点：蛋白质提取和分离的基本原理难点：蛋白质提取与分离的实验操作（凝胶色谱操作）过程【知识链接】1.血红蛋白存在于何种细胞？其特性和作用分别是什么？2.为何不选用鸡血做实验材料？3.分离不同种类蛋白质的依据是什么？【自主学习内容一】基础知识（记忆）1．凝胶色谱法：凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时的速度不同，相对分子质量较小的蛋白质由于能够路程较，移动速度；而相对分子质量较大的的蛋白质，只能在移动，路程，移动速度。
2．缓冲液缓冲液通常是由1～2种缓冲剂（如NaHCO3、（NH4）2SO4）溶解于水中配制而成；其作用是。
3．电泳：电泳是指电泳利用了待分离样品中各分子以及，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是和。
在测定蛋白质分子量时通常使用，其中SDS的作用是，。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它以及等因素。
【自主学习内容二】实验操作（凝胶色谱法）1.蛋白质的提取和分离一般分四步：、、和。
2.样品处理（1）红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是采集的血样要及时通过采用的方法使红液分层，用胶头吸管吸出上层透明的黄色，将下层红细胞倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌低速离心，如此重复三次，直到，表明红细胞忆洗涤干净。
注意：离心转速及离心时间不能过长，否则，达不到分离效果。
（2）血红蛋白的释放：原理是当外界溶液浓度低于细胞内液浓度时，细胞，红细胞由于没有的保护，而，释放出血红蛋白；使用的试剂是。
（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明的液体，这是，第4层是红细胞破碎物沉淀物（其他杂质，呈色）。
课题3_血红蛋白的提取和分离_教学设计_教案
课题3_血红蛋白的提取和分离_教学设计_教案教学准备1.教学目标（一）知识与技能1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理（二）过程与方法体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤（三）情感、态度与价值观初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神2.教学重点/难点课题重点凝胶色谱法的原理和方法课题难点样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填3.教学用具多媒体4.标签生物,教案教学过程（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1．基础知识蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：（图5－13b）混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
1．3凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
［思考］阅读教材后，填写下表：。
血红蛋白的提取和分离
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外 来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）的对溶液 的（ PH值 ）的影响，维持PH基本不变。
三 实验结果分析与评价
观察你处理的血液样品离心后是否分层（见 教科书图5-18），如果分层不明显，可能是 洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此 外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞 和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细 胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝 胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝 胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子 的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡 聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、 狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如 果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以 消除气泡，消除不了时要重新装柱。
2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
（2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀 时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮 液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置 固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装 填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装 均匀。注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡 会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
专题5课题3血红蛋白的提取与分离PPT课件
(三)电泳
1、概念：带电粒子在 电场 的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等 都具有 可解离的基团 ， 在 一定的PH 下，这些 基团会带上正电或负电 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动。电泳利 用了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分 子本身 大小 、 形状 的不同使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：
①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素 C、H、O、N (大多数含S) 3、相对分子质量 高分子化合物
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取； 猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含 量丰富便于提取血红蛋白。
9 、蛋白质的鉴定方法 10、生理功能
细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。
基础知识
问：依据什么来分离和提取蛋白质 根据蛋白质各种特性的差异，
如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
基础知识 （一） 凝胶色谱法
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
血红蛋白的分离和提取
答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞 无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。
一、基础知识：
（一）蛋白质分离原理
（二）蛋白质分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法
（三）缓冲液的作用
二、实验操作－－实验步骤 注意事项
血液组成成分
5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不
同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少
B 分子的大小
C 肽链的多少
D 分子形状的差异
6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作， 其中正确的是（ A ）
• A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞
• C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同 时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利 用相关计算公式算出相对分子量
SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质 间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子 大小。
8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原 因是
A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果
B、气泡阻碍蛋白质的运动 C、气泡与蛋白质发生化学反应 D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝
胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的
专题 _课题3__血红蛋白的提取和分离导学案
课题3 血红蛋白的提取和分离导学案[导学诱思]1．凝胶色谱法凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是。
缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3．电泳电泳是指。
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。
4．蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。
5．样品处理血液由和组成，其中红细胞最多。
红细胞具有的特点。
红细胞中有一种非常重要的蛋白质，其作用是，血红蛋白有个肽链组成，包括，其中每条肽链环绕一个，磁基团可携带。
血红蛋白因含有呈现红色。
红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时采用分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
讲课—血红蛋白的提取和分离课件
特别提醒
底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮
塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还
会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联 葡聚糖凝胶) ①固定：将色谱柱垂直固定在支架上
②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内
③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h
(3)样品的加入和洗脱 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到 色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入____________，打开下端出口，进行 磷酸缓冲液 洗脱。 4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 五、操作提示 离心速度 1．红细胞的洗涤：洗涤次数、________与离心时 间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白： 白细胞 离心速度过高和时间过长会使_______等一同沉淀， 达不到分离效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用 沸水浴 ________加热，加速膨胀。 3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果。 均匀一致 4．蛋白质的分离：如果红色区带__________地 移动，说明色谱柱制作成功。
重点回顾： 血红蛋白的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分四步： 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定。 1．样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①采集血样→②低速短时间离心→③吸取血浆→④ 生理盐水洗涤→⑤低速离心→⑥重复④⑤步骤三次。 特别提醒 (1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续 步骤的进行。 (2)离心时转速要低，时间要短，一般为500 r/min， 离心2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤 次数。
血红蛋白的提取和分离
本课题学习要点和难点
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
3、课题要点：凝胶色谱法旳原理和措施 4、课题难点：
①样品旳预处理 ②色谱柱填料旳处理和色谱柱旳装填。
2023年4月14日宣告人类基因组序列图完毕，这标志着进入了后基因组和蛋 白质组时代
2、你装填旳凝胶色谱柱是否有气泡产生？你旳色谱 柱装填得成功吗？你是怎样判断旳？
因为凝胶是一种半透明旳介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与 凝胶柱垂直旳日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够 加入大分子旳有色物质，例如蓝色葡聚糖—2023或红色葡聚糖， 观察色带移动旳情况。假如色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色 谱柱旳性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
血红蛋白的提取和分 离
本课题学习目的
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白旳提取中分别起到什么作用。
2. 主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质旳原理
②电泳法分离样品旳原理
③缓冲溶液旳构成和作用机理
④洗脱：小心加入pH=7.0 旳20mmol/l旳磷酸缓冲液到合 适高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤搜集：待红色旳蛋白质接近色谱柱底端时，用试管搜集流 出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如 红色区带均匀一致旳移动，阐明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确旳加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。
装配好旳凝胶柱
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基础知识
（一） 凝胶色谱法
5、具体过程
基础知识
（一） 凝胶色谱法
5、具体过程
在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分 子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较 小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法 进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程 较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质 分子因此得以分离。
基础知识
（一） 凝胶色谱法
1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2、凝胶色谱法的概念： 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。
3、依据的特性
4、凝胶
蛋白质分子量的大小。
①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；
2、缓冲溶液作用
能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影 响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调 节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内 使用的缓冲液。基础知识Fra bibliotek（二）缓冲溶液
4、缓冲溶液的组分分类
①弱酸和弱酸盐组合
H2CO3/NaHCO3
CH3COOH/CH3COONa
CO
NH
脱水缩合 肽链 （n条） 盘曲折叠
7、分子结构 氨基酸
蛋白质
8、蛋白质多样性的原因：
(多样性的根本原因)
氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化 多端；多肽链的空间结构千差万别
9 、蛋白质的鉴定方法 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的 主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切 生命活动的主要承担者
实验操作
（一）样品处理
②血红蛋白组成及作用 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团 可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因 含有血红素而呈红色
③选材
本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的 血液来分离血红蛋白。
实验操作
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤
阅读课本内容，回答以下问题：
1、洗涤的目的？
2、怎样洗涤？
③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如 二硫键）互相连接，具有不同的空间结构 ④关于蛋白质相对分子量的计算：n 个氨基酸形成m条肽 链，每个氨基酸的平均相对质量为a，那么由此形成的蛋 白质的相对分子量为n· - (n - m)· a 18
关于血红蛋白
1、元素组成
2、分子结构
3、颜色
4、存在细胞
课题 课题背景
3
血红蛋白的提取和分离
蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组 计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨 入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用， 首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混 合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常 要做的工作。 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成 分负责血液中O2和CO2的运偷。在本课题中，我们将以血 红蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才 技术 金湖二中生物教研组
基础知识
（三）电泳
基础知识
（三）电泳
原理：许多重要的生物大分子，如 （多肽、核酸）等都具有( 可解离的基团 ) 在( 一定的PH )下，这些基团会带上 正电或负电 。在电场的作用下，这些 （ ） 所带电荷相反的电极 带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 （ 带电性质的差异 ）以及分子本身 （ 大小）、（ 形状的 ）的不同使带电分 子产生不同的（ 迁移速度 ），从而实现 样品中各种分子的分离。
生产和生活中使用酶制剂和固定化酶，都需 要把从微生物细胞中提取分离出来。 细胞中有许多种蛋白质，怎样才能将所需要 的酶提取分离出来呢？
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进 入了后基因组时代。
人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对 蛋白质功能的研究
讨论：如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时， 可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已 知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分 子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试 剂出售
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH 下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的 过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此， 缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研 究工作中有着极其重要的意义。
基础知识
（三）电泳
阅读第65页的相关内容，回答以下问题：
1、电泳的概念；
基础知识
（三）电泳
4、实例 十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①应用 测定蛋白质分子量。
②聚丙烯酰胺凝胶 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状 结构的凝胶。 ③原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
②化学本质：多糖类化合物： ③实例：葡聚糖、琼脂糖：
5、具体过程
基础知识
（一） 凝胶色谱法
原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速 度（ 较慢 ），而（ 相对分子质量较大） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 凝胶外部 ）移动，路程（较短 ）， 在（ 移动速度（ 较快 ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。
基础知识
（三）电泳
④ SDS作用 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。 ⑤ SDS作用机理
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组 成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽 链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所 带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。 因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁 移率完全取决于分子的大小。
水分
血细胞
实验操作
（一）样品处理
血 红 蛋 白
2个a－肽链 2个β一肽链 4个亚铁红素基团
血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的 组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包 括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素 基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有 血红素而呈现红色。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素
C、H、O、N 高分子化合物 H
3、相对分子质量
4、基本组成单位： 氨基酸 结构简式： 种类：
R
C NH2
COOH
5、氨基酸连接方式
脱水缩合
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 6、肽键
5、生理功能
6 、获得方法、
基础知识
问：依据什么来分离和提取蛋白质（原理P65T5－13）
根据蛋白质各种特性的差异， 如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
基础知识
（一） 凝胶色谱法
阅读并回答 （P64） 1、凝胶色谱法另一个名称； 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据； 3、凝胶的实质； 4、凝胶色谱法 5、凝胶色谱法的原理。
实验操作
阅读课本相关内容，思考以下问题：
1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？
2、样品怎样处理？
3、蛋白质怎样分离？
实验操作
（一）样品处理
问：蛋白质提取和分离步骤？ 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
实验操作
（一）样品处理
①血液组成
血 血 液
血浆蛋白 浆 无机盐 固体物质 磷脂 葡萄糖等 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 2个a－肽链 血红蛋白 2个β一肽链 （90％） 4个亚铁红素基团
3、洗涤干净的标志是什么？
1 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 2 采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次 3 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
实验操作
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤 问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？
实验操作
（一）样品处理
2.血红蛋白的释放 血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中， 加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，臵于磁 力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下， 红细胞破裂，释放出血红蛋白。
说出：蒸馏水和甲苯的作用。
实验操作
（一）样品处理
3.分离血红蛋白溶液 问： 1、采用什么方法分离血红蛋白？ 2、离心分层后，各层的成分各是什么？ 3、用滤纸过滤，去掉什么成分？ 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心 管中，以2000 r／min的速度离心10min后，可以明显看 到试管中的溶液分为4层。从上往下数，第1层为无色透明 的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀 层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4 层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过 滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静臵片刻后，分出 下层的红色透明液体。
2、电泳的原理； 3、电泳的种类； 4、SDS的作用。
基础知识
（三）电泳 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。