课题3 血红蛋白的提取与分离

基础知识
（二）缓冲溶液
1、我们在什么地方遇到过缓冲物质的？ 2、缓冲物质有哪些？
3、缓冲溶液的作用是什么？
4、怎样配制缓冲溶液？
基础知识
（二）缓冲溶液
1、缓冲溶液概念
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱 或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫 做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、缓冲溶液作用
能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影 响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调 节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内 使用的缓冲液。
基础知识
（二）缓冲溶液
4、缓冲溶液的组分分类
①弱酸和弱酸盐组合
H2CO3/NaHCO3
CH3COOH/CH3COONa
课题 课题背景
3
血红蛋白的提取和分离
蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组 计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨 入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用， 首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混 合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常 要做的工作。 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成 分负责血液中O2和CO2的运偷。在本课题中，我们将以血 红蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才 技术 金湖二中生物教研组
基础知识
（三）电泳
4、实例 十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①应用 测定蛋白质分子量。
②聚丙烯酰胺凝胶 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状 结构的凝胶。 ③原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH 下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的 过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此， 缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研 究工作中有着极其重要的意义。
基础知识
（三）电泳
阅读第65页的相关内容，回答以下问题：
1、电泳的概念；
5、生理功能
6 、获得方法、
基础知识
问：依据什么来分离和提取蛋白质（原理P65T5－13）
根据蛋白质各种特性的差异， 如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
基础知识
（一） 凝胶色谱法
阅读并回答 （P64） 1、凝胶色谱法另一个名称； 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据； 3、凝胶的实质； 4、凝胶色谱法 5、凝胶色谱法的原理。
基础知识
（一） 凝胶色谱法
5、具体过程
基础知识
（一） 凝胶色谱法
5、具体过程
在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分 子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较 小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法 进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程 较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质 分子因此得以分离。
③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如 二硫键）互相连接，具有不同的空间结构 ④关于蛋白质相对分子量的计算：n 个氨基酸形成m条肽 链，每个氨基酸的平均相对质量为a，那么由此形成的蛋 白质的相对分子量为n· - (n - m)· a 18
关于血红蛋白
1、元素组成
2、分子结构
3、颜色
4、存在细胞
实验操作
（一）样品处理
2.血红蛋白的释放 血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中， 加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，臵于磁 力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下， 红细胞破裂，释放出血红蛋白。
说出：蒸馏水和甲苯的作用。
实验操作
（一）样品处理
3.分离血红蛋白溶液 问： 1、采用什么方法分离血红蛋白？ 2、离心分层后，各层的成分各是什么？ 3、用滤纸过滤，去掉什么成分？ 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心 管中，以2000 r／min的速度离心10min后，可以明显看 到试管中的溶液分为4层。从上往下数，第1层为无色透明 的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀 层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4 层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过 滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静臵片刻后，分出 下层的红色透明液体。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入( SDS)。SDS能使蛋白质发生完全变性。 由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用 下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 ( )。SDS能与各种蛋白质 单条肽链的分子量 形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的 量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而 掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 分子的大小 迁移率完全取决于( )。
11、相关计算 ①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了， 形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一 个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽 链说，至少应有的氨基和羧基都是一个
②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n - m个肽 键,脱去个n - m个水分子，至有氨基和羧基各 m 个
CO
NH
脱水缩合 肽链 （n条） 盘曲折叠
7、分子结构 氨基酸
蛋白质
8、蛋白质多样性的原因：
(多样性的根本原因)
氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化 多端；多肽链的空间结构千差万别
9 、蛋白质的鉴定方法 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的 主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切 生命活动的主要承担者
水分
血细胞
实验操作
（一）样品处理
血 红 蛋 白
2个a－肽链 2个β一肽链 4个亚铁红素基团
血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的 组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包 括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素 基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有 血红素而呈现红色。
实验操作
阅读课本相关内容，思考以下问题：
1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？
2、样品怎样处理？
3、蛋白质怎样分离？
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验操作
（一）样品处理
问：蛋白质提取和分离步骤？ 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
实验操作
（一）样品处理
①血液组成
血 血 液
血浆蛋白 浆 无机盐 固体物质 磷脂 葡萄糖等 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 2个a－肽链 血红蛋白 2个β一肽链 （90％） 4个亚铁红素基团
生产和生活中使用酶制剂和固定化酶，都需 要把从微生物细胞中提取分离出来。 细胞中有许多种蛋白质，怎样才能将所需要 的酶提取分离出来呢？
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进 入了后基因组时代。
人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对 蛋白质功能的研究
讨论：如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时， 可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已 知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分 子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试 剂出售
基础知识
（一） 凝胶色谱法
1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2、凝胶色谱法的概念： 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。
3、依据的特性
4、凝胶
蛋白质分子量的大小。
①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；
3、洗涤干净的标志是什么？
1 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 2 采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次 3 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
实验操作
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤 问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？
基础知识
（三）电泳
基础知识
（三）电泳
原理：许多重要的生物大分子，如 （多肽、核酸）等都具有( 可解离的基团 ) 在( 一定的PH )下，这些基团会带上 正电或负电 。在电场的作用下，这些 （ ） 所带电荷相反的电极 带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 （ 带电性质的差异 ）以及分子本身 （ 大小）、（ 形状的 ）的不同使带电分 子产生不同的（ 迁移速度 ），从而实现 样品中各种分子的分离。
实验操作
（一）样品处理
②血红蛋白组成及作用 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团 可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因 含有血红素而呈红色
③选材
本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的 血液来分离血红蛋白。
实验操作
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤
阅读课本内容，回答以下问题：
1、洗涤的目的？
2、怎样洗涤？
②弱碱和弱碱盐
NH4OH /NH4CI
③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐
NaH2PO4 /Na2HPO4
KH2PO4 /K2HPO4
基础知识
（二）缓冲溶液
思考： 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？ 它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内 的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察 (红色)和科学研究(活性)。 问：在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液 和准确测定缓冲溶液的pH？
基础知识
（三）电泳
④ SDS作用 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。 ⑤ SDS作用机理
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组 成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽 链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所 带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。 因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁 移率完全取决于分子的大小。
2、电泳的原理； 3、电泳的种类； 4、SDS的作用。
基础知识
（三）电泳 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
1、概念 2、原理
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解 离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以 及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁 移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3、电泳的类型 琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素
C、H、O、N 高分子化合物 H
3、相对分子质量
4、基本组成单位： 氨基酸 结构简式： 种类：
R
C NH2
COOH
5、氨基酸连接方式
脱水缩合
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 6、肽键
1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉 淀达不到分离的效果。 2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞 已洗涤干净。
实验操作
（一）样品处理
1.红细胞的洗涤
红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂 蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要 及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如 500 r／rain离心2min，然后用胶头吸管吸出上层 透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入 烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9 ％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离 心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色， 表明红细胞已洗涤干净。
②化学本质：多糖类化合物： ③实例：葡聚糖、琼脂糖：
5、具体过程
基础知识
（一） 凝胶色谱法
原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速 度（ 较慢 ），而（ 相对分子质量较大） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 凝胶外部 ）移动，路程（较短 ）， 在（ 移动速度（ 较快 ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。