第二章第二节分子荧光和磷光分析法
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分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
荧光和磷光解析
一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构， 分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金 属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大， 常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但 其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发， 接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁， 最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激 辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能 级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能级的分布 情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
第二章第二节分子荧光和磷光分析法
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基 丙氨酸，可以直借用荧光法测定。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
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（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
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(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
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(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
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（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
分子荧光和分子磷光分析法
6. 紫外-可见光度法在定性分析中的应用: 了解能级跃迁的基 本类型, 共轭烯烃键数与能量的关系, 溶剂极性对吸收光 谱的影响.
7. 分子荧光与分子磷光的产生及特点, 仪器比较.
31
第9章
1. 沉淀分离类型, 提高选择性的方法 2. 溶剂萃取分离: KD、D、E 的定义与计算 3. 离子交换分离： 树脂的种类和性质、应
1
8.7.1 发光机理(Jablonski Diagram)
分子吸光与发光示意图
荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s
2
蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）
吸收光谱 发射光谱
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:ex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:em 3
单色器与液槽之间各装一个斩波片.
应用：主要用于有机分析, 与荧光法互补.
24
室温磷光 --固体样品
低温磷光 --液体样品
低温磷光的样品装置
样品管
液氮
镀银
Io
未镀银
25
转筒式磷光镜（a）和转盘式磷光镜（b）
26
第4章
1. 平衡常数:各级形成常数Ki、不稳定常数K不、酸
的质子化常数K H、累积形成常数i ；分布系数。 络合反应的副反应系数（Y 、M 、MY）与条
15
荧光光度计光路图
电源
光度计
记录仪
光源 试样液池
光电倍增管
16
测定方法—标准曲线法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等；
3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(F), 根据工作曲线
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
分子荧光和磷光光谱讲解ppt课件
GFP
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence
原理
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
荧光和磷光的产生过程
• 分子能级和跃迁
– 电子能级、振动能级和转动能级 – 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能
级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位； – 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
500
nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
分子产生荧光的条件
• 分子产生荧光必须具备的条件
– 具有合适的结构（强的紫外可见吸收） – 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（）
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
内容(contents)
• 原理
– 分子荧光与磷光产生过程 – 激发光谱与荧光光谱 – 荧光的产生与分子结构关系 – 影响荧光强度的因素
光电材料的荧光与磷光特性分析
光电材料的荧光与磷光特性分析光电材料是指能够将光能转化为电能或反过来将电能转化为光能的材料。
在现代社会中，我们可以看到许多光电技术的应用，如LED照明、光电传感器等。
这些应用离不开对光电材料的研究与开发。
而荧光与磷光特性的分析则是光电材料研究的重要内容之一。
荧光是指物质在受到激发后，能够发出低能量的光。
光电材料中的荧光现象主要源自于材料分子或原子的跃迁过程。
当光子能量足够大时，它会激发材料中的分子或原子跃迁到高能级，这种跃迁会使材料发出荧光。
荧光的颜色及亮度与物质本身的能带结构以及分子或原子的跃迁方式有关。
磷光则是指物质在受到短波长的紫外线激发后，发出长波长的光。
与荧光不同的是，磷光需要外界能量的激发才能发生。
光电材料中的磷光主要由材料中的荧光增强剂或掺杂物引起。
这些增强剂或掺杂物可以吸收紫外线能量，然后发出长波长的光。
磷光材料的研究与应用主要集中在LED照明、显示屏和荧光标记等领域。
对于光电材料的荧光与磷光特性的分析，有几个关键的实验手段可以应用。
首先是荧光光谱仪。
荧光光谱仪是一种用于测量荧光光谱的仪器。
它能够测量物质在受激时发出的荧光光强度与波长分布情况。
通过荧光光谱的分析，我们可以了解到光电材料在不同激发条件下的荧光特性，并根据光谱数据来优化材料的性能。
其次是磷光光谱仪。
磷光光谱仪的原理与荧光光谱仪类似，但它主要用于测量磷光材料的光谱。
通过磷光光谱的分析，我们可以了解材料对不同波长的紫外线激发的响应情况，从而评估材料在磷光应用中的性能和稳定性。
除了光谱分析，还可以通过时间分辨荧光与磷光实验来研究光电材料的荧光与磷光特性。
时间分辨荧光与磷光实验主要利用物质的荧光寿命或磷光寿命来分析材料的发光机理以及激发与退激发的过程。
通过测量物质的寿命，我们可以了解材料发光的起始时间、终止时间以及发光的过程中可能发生的变化。
在光电材料研究中，还可以利用荧光或磷光材料的应用特性来分析其荧光与磷光特性。
例如，将荧光材料用于LED照明中，我们可以通过调节材料的化学成分和结构来实现不同颜色和亮度的发光；将磷光材料用于显示屏中，则可以通过控制磷光材料在屏幕上的分布和浓度来实现不同的显示效果。
第二章分子发光分析
18
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
涉及非键的孤对电子
随溶剂形成氢键能力增大
荧光光谱向短波方向移动
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 某些芳族羰基化合物和氮杂环化合物
非极性、疏质子溶剂中 激发单重态（n、π*） 荧光弱或无
高极性的氢键溶剂中 激发单重态（ π 、π*） 荧光强
例如: 异喹啉 在环己烷中 在水中
无荧光 发磷光 发荧光
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0
l3
分子荧光和磷光
l 1 光谱分析法讲解l 2
l 2
➢ 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重 态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，
很快（约10-12~ 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该
电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振
π → π*：自旋许可的跃迁 摩尔吸光系数大， 104 激发态寿命短 S1 T1系间窜越概率较小
n → π*：自旋禁阻的跃迁 摩尔吸光系数小，102 激发态寿命长 S1 T1系间窜越的几率大
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
分子荧光和分子磷光分析法共36页文档
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36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
分子荧光和分子磷光分析法
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
荧光和磷光
S2
S1
T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
荧光
一、基本原理
系间窜跃
不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种系间窜 跃。通常，发生系间窜跃时 ，电子由S1的较低振动能级 转移至T1的较高振动能级处 。有时，通过热激发，有可 能发生T1→S1，然后由S1发 生荧光。这是产生延迟荧光 的机理。
系间窜跃
在极稀的溶液中，当lc0.05时 If =2.3 I0 lc
当入射光强度I0 和l一定时，上式为： If = K c
较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系
一、基本原理
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响
荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基 态中各不同能级形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各 振动能级的分布情况。
基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布 情况是类似的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为 相似。
由基态最低振动能级跃迁到 第一电子激发态各个振动能级的 吸收过程中，振动能级越高，两个能级之间的能量差越大， 即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由
在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃 迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动 ，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性：
（1）Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
分子荧光和分子磷光分析法36页PPT
分子荧光和分子磷光分析法
3ห้องสมุดไป่ตู้、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！
3ห้องสมุดไป่ตู้、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
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分子荧光及磷光分析
解释2：位能曲线（Frank-Condon原理）
由于电子吸收跃迁速Байду номын сангаас极快（10-15s），此时核的相对位置可视为不变（核较 重）。当两个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生 的光谱呈镜像对称。
3）外转换（External Conversion，EC） 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧
光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝 灭”。
4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC） 系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如
从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电 子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋 方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁， 该过程称为系间跨跃。
分子荧光及磷光分析
一、基本原理
1. 分子能级、荧光及磷光的产生 2. 去活化过程 3. 定性分析 影响荧光及荧强度的因素 5. 定量分析
二、荧光仪器
三、磷光分析
1. 磷光的特点： 2. 低温荧光 3. 室温荧光 磷光仪器
荧光： 16世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光； 1575年：Monardes——植物愈创木切片黄色水溶液——天兰色荧光； 1852年：Stokes阐明荧光发射机制（分光计观测奎宁和叶绿素的荧光，发现波长稍 长于入射光的波长——认识到荧光为“重新发光”而不是漫射光； 1905年：Wood发现气体分子的共振荧光； 1926年:Gaviola直接测定了荧光寿命； 1923年：荧光X射线光谱； 1964年：原子荧光光谱分析的建立； 1965年：荧光分析在生物分析中广泛应用；
解释1：能层结构相似性
荧光为第一电子激发单重态的最
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四、磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 与荧光计区别：1.样品池 2.斩光器
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，在激发光被 旋转斩光片阻断时，荧光停 止发射，而磷光则持续发射 。采用磷光镜的装置将荧光 隔开。 （2）还可采用脉冲光源和 可控检测及时间分辨技术。
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(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变 磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性． 如：在表面活性剂十二烷基硫酸盐和重原子离子T1+ (铊 ，音ta)和Pb2+的存在下，室温可测定10-6~10-7mol的萘、芘 和联苯，精密度达6%。 (3)敏化磷光 分析物本 身年个并不发 磷光,而是引 发受体发磷光 . 采用这种方法，可测定10-9mol/L的可卡因。
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线
上求出浓度；
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3.荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定(液氮温度-196℃)；
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基 丙氨酸，可以直借用荧光法测定。 芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。 见表.
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磷光分析法基本原理
第二章 分子发光分析法
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一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、激发 单色器、样品池、发射单色器和检测器。
光源要求强 度大、使用 波长范围宽
高压汞灯是以汞蒸气放电发 光的光源，主要有365、 405、436nm 的三条谱线 ，尤以365nm谱线最强， 一般滤光片式的荧光计多采 用它为激发光源
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法. 如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
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(2)生物与有机化合物的分析
2 3 f 0
当I0一定时，得
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If = Kc
If = 2.3 I0 b c If = Kc
定量关系的成立条件为： εbc小于0.05 ，此时与浓度 无关，为定值； 即这种线性关系 只有在极稀的溶液中才成立． 对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。 问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高? ①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数; A= lg(I0/It) ② I0 ↑
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（2）定量方法
1. 2. 3. 4. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)； 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 以标准溶液做工作曲线； 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光 物质的浓度. If = Kc
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
3.药物分析和临床分析
如：阿司匹林、普鲁卡因、柯卡因、致幻剂等，见表
4. 磷光分析法在无机物分析方面应用很少。
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特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
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二、荧光分析方法与应用 1.定量依据与方法 (1)定量依据
I0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ入射光
It 透过光
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率的乘积： If = Ia （1）式 根据吸收定律，I0—入射光强度， It—透射光强度，则 Ia=I0- It （2）式 由朗-比耳定律：A= lg(I0/It)=bc It=I0· 10-A=I0· 10-bc Ia = I0(1-10- b c ) （3）式 If = I0(1-10- bc ) = I0(1-e-2.3 b c ) （4）式 将上式展开，得： ( 2.3 εbc ) ( 2.3 εbc ) I I [2.3 εbc ] 2! 3! 浓度很低时（A =bc <0.05时），得： If = 2.3 I0 b c
一、 仪器与结构流程 instrument and general process molecular luminescence 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and analysis application 第二节 三、 磷光分析法及应用 分子荧光与磷光分析法 phosphorescence analysis and application molecular fluorescence and phosphorescence analysis
由于三重态的寿命长，激发态分子与溶剂分子发生碰撞 去激发的几率增大，使磷光强度减弱甚至消失。
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三、为了获得较强的磷光，宜采用以下措施: 1．增加试样的刚性 这种方法可减小质点间的碰撞几率,以减小无辐射跃迁.低 温荧光法就是基于这一原理的：在低温下（77K)，将试样的 乙醚或异戊醇溶液冷冻成透明玻璃状后测定。 2．重原子效应： 重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易 引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1—T1 的系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。除了使用含 有重原子的溶剂外，还可采用Ag+盐、Pb2+盐和T1+盐等重 金属盐类。 3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
室温测量时，不需要杜瓦瓶。
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三、磷光分析法的应用
1.稠环芳烃和石油产品分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和
杂环化合物（致癌物质）；如：芘、苯并芘、萘酚等，见表
2.农药、生物碱、植物生长激素的分析
DDT， 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D、萘乙酸等分析 检测限0.01 g/mL
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的 分子跃迁返回基态时所产生的辐射。 当磷光物质浓度很小时： Ip = Kc
二、与荧光比较，磷光的特点： (1)磷光辐射的波长比荧光长； (2)磷光的发光速率慢，但具有较长的寿命； (3)磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子非常敏感 （4）发光效率受温度影响大。
四、磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 与荧光计区别：1.样品池 2.斩光器
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，在激发光被 旋转斩光片阻断时，荧光停 止发射，而磷光则持续发射 。采用磷光镜的装置将荧光 隔开。 （2）还可采用脉冲光源和 可控检测及时间分辨技术。
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(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变 磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性． 如：在表面活性剂十二烷基硫酸盐和重原子离子T1+ (铊 ，音ta)和Pb2+的存在下，室温可测定10-6~10-7mol的萘、芘 和联苯，精密度达6%。 (3)敏化磷光 分析物本 身年个并不发 磷光,而是引 发受体发磷光 . 采用这种方法，可测定10-9mol/L的可卡因。
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线
上求出浓度；
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3.荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定(液氮温度-196℃)；
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基 丙氨酸，可以直借用荧光法测定。 芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。 见表.
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磷光分析法基本原理
第二章 分子发光分析法
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一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、激发 单色器、样品池、发射单色器和检测器。
光源要求强 度大、使用 波长范围宽
高压汞灯是以汞蒸气放电发 光的光源，主要有365、 405、436nm 的三条谱线 ，尤以365nm谱线最强， 一般滤光片式的荧光计多采 用它为激发光源
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法. 如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
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(2)生物与有机化合物的分析
2 3 f 0
当I0一定时，得
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If = Kc
If = 2.3 I0 b c If = Kc
定量关系的成立条件为： εbc小于0.05 ，此时与浓度 无关，为定值； 即这种线性关系 只有在极稀的溶液中才成立． 对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。 问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高? ①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数; A= lg(I0/It) ② I0 ↑
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（2）定量方法
1. 2. 3. 4. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)； 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 以标准溶液做工作曲线； 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光 物质的浓度. If = Kc
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
3.药物分析和临床分析
如：阿司匹林、普鲁卡因、柯卡因、致幻剂等，见表
4. 磷光分析法在无机物分析方面应用很少。
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特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
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二、荧光分析方法与应用 1.定量依据与方法 (1)定量依据
I0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ入射光
It 透过光
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率的乘积： If = Ia （1）式 根据吸收定律，I0—入射光强度， It—透射光强度，则 Ia=I0- It （2）式 由朗-比耳定律：A= lg(I0/It)=bc It=I0· 10-A=I0· 10-bc Ia = I0(1-10- b c ) （3）式 If = I0(1-10- bc ) = I0(1-e-2.3 b c ) （4）式 将上式展开，得： ( 2.3 εbc ) ( 2.3 εbc ) I I [2.3 εbc ] 2! 3! 浓度很低时（A =bc <0.05时），得： If = 2.3 I0 b c
一、 仪器与结构流程 instrument and general process molecular luminescence 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and analysis application 第二节 三、 磷光分析法及应用 分子荧光与磷光分析法 phosphorescence analysis and application molecular fluorescence and phosphorescence analysis
由于三重态的寿命长，激发态分子与溶剂分子发生碰撞 去激发的几率增大，使磷光强度减弱甚至消失。
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三、为了获得较强的磷光，宜采用以下措施: 1．增加试样的刚性 这种方法可减小质点间的碰撞几率,以减小无辐射跃迁.低 温荧光法就是基于这一原理的：在低温下（77K)，将试样的 乙醚或异戊醇溶液冷冻成透明玻璃状后测定。 2．重原子效应： 重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易 引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1—T1 的系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。除了使用含 有重原子的溶剂外，还可采用Ag+盐、Pb2+盐和T1+盐等重 金属盐类。 3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
室温测量时，不需要杜瓦瓶。
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三、磷光分析法的应用
1.稠环芳烃和石油产品分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和
杂环化合物（致癌物质）；如：芘、苯并芘、萘酚等，见表
2.农药、生物碱、植物生长激素的分析
DDT， 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D、萘乙酸等分析 检测限0.01 g/mL
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的 分子跃迁返回基态时所产生的辐射。 当磷光物质浓度很小时： Ip = Kc
二、与荧光比较，磷光的特点： (1)磷光辐射的波长比荧光长； (2)磷光的发光速率慢，但具有较长的寿命； (3)磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子非常敏感 （4）发光效率受温度影响大。