PCR质控及问题分析
实时荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控分析
实时荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控分析目的探讨实时荧光定量PCR在HBV DNA定量检测过程中的室内质控问题。
方法用实时荧光定量PCR法检测2013年1~7月自制的乙肝阳性室内质控血清，与临床标本同步检测，计算每次阳性质控结果的常用对数、标准曲线的斜率、截距和相关系数(r)及相关结果的均值(x)、标准差(s)和变异系数(cv)，利用EXCEL折线散点图画出质控图进行质控。
结果本室2013年1~7月测定自制的阳性室内质控结果测定值均在控，标准差和变异系数均在允许范围内，符合要求。
结论本实验室采用实时荧光定量PCR检测HBV-DNA定量检测过程中，选用的质控方法和自制的质控品稳定性良好，能可靠有效地为临床提供准确的检验结果。
Abstract：ObjectiveTo explore the indoor quality controlproblems in HBV DNA quantitative detection of real-time fluorescence quantitative PCR. Indoor quality control serum HBsAg positive self detection.MethodsFor 1~7 months of 2013 by real-time fluorescence quantitativePCR method and clinical specimens, synchronous detection, curve of standard logarithm, calculated for eachpositive quality control results of the slope, intercept and correlation coefficient (R) value and related results ,standard deviation (s) and the coefficient of variation(CV), scatter picture quality control chart for quality control by using the EXCEL line. ResultsThe 1~7 months of 2013 were positive results of internal quality control of homemade measured values are in control, the standard deviation and variation coefficient were within the allowable range, meet the requirements. ConclusionThis laboratory detection of HBV-DNA quantitative real-time fluorescence quantitative PCR detection process,quality control methods and quality control of homemadegood stability, can provide valid and reliable accurate test results for clinical.Key words：Real time fluorescence quantitative PCR; Polymerase chain reaction; HBV-DNA; Quality controlHBV DNA含量是诊断和监测乙型病毒性肝炎的重要指标[1]。
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法检验科人员是核酸检测工作的主力军，我们不但要保证检测结果的有效性，还时刻面临着被感染的风险。
本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。
1、传染源目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。
无症状感染者也可能成为传染源。
2、传播途径经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径。
在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。
由于在粪便及尿中可分离到新型冠状病毒，应注意粪便及尿对环境污染造成气溶胶或接触传播。
3、荧光PCR原理重复进行“变性 - 退火 - 延伸”三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。
4、常见问题解析①新冠试剂出现翘尾，怎么处理？答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。
如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。
设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
③新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。
PCR实验室基因扩增检测实验及结果分析
PCR实验室基因扩增检测实验及结果分析1、目的：保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。
3．负责人：操作人：4、标准程序：4.1基因扩增检测标准程序：扩增反应前须先在样本输入模板上按照事先排好的标本位置进行设置。
每次实验除待检标本，还需包括：阴性对照、阳性对照、室内质控品各一份，一组阳性标准品（4个梯度108、106、105、104）。
4.1.1打开电脑电源开关，进入Windows XP界面。
4.1.2 接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。
4.1.3双击电脑桌面的SLAN-96P图标进入程序设置界面。
4.1.4单击“文件”菜单中的“新建”命令，（或单击工具栏中的“新建”按扭）。
在测定、容器和模板中做相应的选择，点击OK。
4.1.5应用检测管理程序，并将其添加到样品板文档中。
4.1.6检测反应管，4.1.7 根据当次实验所需条件编辑时间和温度。
运行样品板文档。
4.2 结果分析标准程序：应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。
4.2.1 整体曲线的观察：将所有曲线选中进行整体观察1）观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。
2）观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。
4.2.2 阴性对照的分析阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。
作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。
4.2.3 阳性对照的分析阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。
作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。
4.2.4 室内质控品的分析室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知浓度室内质控品。
作用：用以监控日常实验的精密度。
PCR质量控制2023.3
PCR质量控制2023.3引言PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术，它能够在体外扩增目标DNA片段，具有高度特异性和灵敏度。
PCR反应的质量控制对于确保实验结果的准确性和可重复性至关重要。
本文将介绍PCR质量控制的方法和注意事项，以帮助研究人员有效地进行PCR实验并获得可靠的结果。
质量控制方法1. 使用质量良好的试剂和材料，确保所使用的PCR试剂和材料的质量良好。
选择来自可靠供应商的高质量试剂，如聚合酶、引物和缓冲液等。
使用新鲜的试剂，并储存于适当的条件下，避免冻融循环和长期存储。
2. 设计合适的引物和探针引物和探针的设计是PCR实验成功的重要因素之一。
确保引物和探针的序列与目标DNA片段完全匹配，并具有合适的Tm值，以确保高度特异性的扩增。
避免引物和探针之间的互相结合和二聚体形成。
3. 进行质控反应在进行实际PCR反应之前，建议进行质控反应以验证试剂和仪器的性能。
质控反应通常包括PCR阴性对照、阳性对照和样品重复，以确保实验的可靠性和一致性。
通过检测阴性对照是否无扩增产物以及阳性对照是否有预期的扩增产物，可以评估试剂和仪器的质量。
4. 优化PCR参数选择合适的PCR条件对于实现高效扩增至关重要。
优化PCR参数包括反应体系的浓度和比例、引物和探针的浓度、PCR循环程序和温度梯度等。
通过调整这些参数，可以获得较高的扩增效率和特异性。
5. 检测PCR产物，对PCR产物进行检测和验证。
常用的PCR产物检测方法包括凝胶电泳、聚合酶链反应的实时荧光定量PCR（qPCR）和基因测序等。
通过这些方法，可以评估PCR扩增的效果，并确认目标DNA片段的存在与否。
注意事项除了上述质量控制方法之外，还有一些重要的注意事项需要注意：1. 保持实验室的清洁和无菌。
PCR反应对外源性污染非常敏感，应该在无菌条件下进行实验，并且使用无菌的试剂和材料。
2. 严格遵循PCR反应的操作规程。
避免交叉污染，使用新鲜的各种试剂，并按照正确的顺序和步骤进行实验操作。
pcr室内质控结果编低
pcr室内质控结果编低
PCR室内质控结果编为低可能有以下原因：1. 实验操作失误：PCR技术对实验操作非常敏感，如果操作不正确，比如样品污染、试剂过期等，就会影响结果的准确性。
2. PCR条件设置不正确：PCR反应的温度、时间等条件设置不正确，可能导致扩增效率降低，结果变差。
3. 试剂质量问题：PCR试剂的质量不良也会影响结果的准确性，比如引物或探针的质量有问题。
4. 样品质量问题：样品的DNA质量不好，比如浓度低、含有抑制物等，都会影响PCR反应的效果。
5. 基因突变或异质性：如果待检测的基因存在突变或者样品中存在基因的异质性，都可能导致PCR结果编为低。
在面对PCR室内质控结果编为低时，应该进行排查和分析，检查实验操作是否正确、PCR条件是否设置正确、试剂质量是否良好等，同时可以尝试重复实验或采取其他措施进一步验证和提高结果的准确性。
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施2022年5月29日中午12:30开始PCR实验室假阳性频率增高,考虑可能出现实验室污染，检测工作立即停止，首先，查找污染源和明确污染范围。
经排查本次实验室污染的主要来源可能是部分配置好的反应体系放置时间过久、实验室二区出现扩增产物的污染。
一、发生污染的原因分析。
1.核酸检测工作频次过高，导致每批样本检测之间没有足够时间消毒。
2、核酸检测人员短缺，检测人员需要多次往返二区、三区，极容易导致扩增产物的污染。
二、实验室污染的处理：1.生物安全柜的操作台消毒处理：使用5000mg∕L含氯消毒剂进行喷洒消毒。
消毒液需要现用现配，24小时内使用。
2.实验室台面、地面、物体表面等的消毒处理：立即使用润湿有5000mg∕L含氯消毒剂的毛巾擦拭、消毒。
清洁、消毒通风系统滤网。
采用房间固定和可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。
3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
整改措施：1.严格实验室功能分区确保实验室人、物及空气单向流动核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区一样本制备区T扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。
空气流向应按照从试剂储存和准备区一样本制备区一扩增区一扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
2、力口强实验室检测安全管理(1)基本要求核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩和隔离衣等。
开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。
(2)实验室前安全要求应使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精进行桌面、台面及地面消毒。
消毒液需每天新鲜配制，不超过24小时。
转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。
转运桶开启后，使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精对转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。
PCR 技术在医学检验中的质量控制及应用综述
PCR 技术在医学检验中的质量控制及应用综述摘要】自20实际80年代PCR技术问世以来，该项技术以在医学及生物学等多个领域广泛应用，为医学疾病的精确诊断创造了条件。
但在PCR技术的应用阶段，存在各类隐患如临床标本的处理和污染的控制等，成为PCR技术应用中不可忽视的问题，也是PCR技术成功的关键。
因此，在现代医学中对PCR技术的应用提出了更高的要求，必须提高医学检验人员临床诊治水平，同时提高PCR的准确度和可信度，只有这样才能切实保障人民安全健康，防止医疗纠纷的发生。
本文通过对PCR技术在医学检验中的应用的深入研究，提出了该项技术在医学检验中的质量控制方法及相关应用。
【关键词】PCR技术；医学检验；质量控制；应用【中图分类号】R2 【文献标号】A 【文章编号】1671-8725（2014）10-0128-01引言：在当前的医学疾病监测方法中，PCR 技术以其灵活、简单、快速、特异等优点，成为了一种新型疾病监测手段，增强了各类疾病监测的准确性。
PCR技术在医学研究领域和临床应用中发挥着重大的作用，使医学疾病检验可以从患者身体的一极小一部分组成（如一根头发、一滴血液等）出发，通过细胞扩增来进行DNA的分析诊断。
同时在病原体的鉴定、遗传病诊断研究等方面也发挥着很大的作用。
一PCR技术概述PCR技术是由三个基本步骤组成的循环反应，其基本原理是通过对体内DNA分子的复制机制的模仿，在体外相同条件下对特异的DNA片段进行扩增。
三个步骤分别为：①根据DNA分子的特点，采用加热的方法使双链DNA分子解旋成两条单链，②根据碱基互补配对原则，通过采取降温措施使这两条单链与引物结合成双链，③在镁离子、脱氧核苷酸以及缓冲液环境下，通过DNA 聚合酶催化合成互补链，完成链的延伸。
以上步骤的重复，约经过30各周期，即1~2小时的时间，目的基因的数量就能增加几百万倍。
二医学检验中PCR技术的质量控制在PCR 技术在医学检验中，为了提高PCR技术的准确度和可信度，必须做好PCR技术在医学检验中的质量控制工作，这就要求对PCR技术的相关弱点进行合理的分析，可以从PCR 技术实验室的正规化配置、PCR技术操作人员的技术水平、临床标本的处理、污染的控制等方面着手。
PCR室内质控规则讨论
由于此前HBV-DNA只做单水平质控物，仅采取了1-3S单个失控规则。
此次复审中专家也提到我室质控物操作的问题，建议加做高水平质控物。
针对检查组提出的问题，我们做出了整改，目前已增加高水平质控物，靶值约在108左右。
由于增加了质控物的水平，采用单个失控规则明显不能满足质控管理的需求。
现讨论增加1-2个规则，黄少军：增加R-4S失控规则，增加此规则可有效控制偶然因素导致的出控，确保试验结果的稳定性。
可以考虑增加2-2S失控规则，原因是目前我室采用的失控规则（1-3S、R-4S）仅能判断偶然误差，无法判断系统误差，增加2-2S规则后，可以判断是否存在系统性的偏倚、漂移或倾向性改变。
但要经过一段时间的验证，因为从质控图上看，单个水平的质控物我室基本上很少有2-2S的情况出现，但目前刚开始采用双水平质控物，缺少数据，无法判断采用2-2S 后实际的情况。
柯峰：对增加R-4S失控规则，完全同意。
但对增加2-2S失控规则，有一定的担心，因为整个PCR检测工作可以说是手工操作，受操作人员操作导致的检测变异比较大，在加样误差的控制上无法像生化和临检的机器那么稳定，如果增加2-2S规则的话，可能会出现失控次数比仅使用单水平质控物时候明显增多的情况。
目前可以先观察一段时间，看看2-2S规则的实际应用情况。
另外我赞成黄少军提出的对PCR扩增曲线的斜率进行监测的意见，这样做是符合PCR工作实际情况的。
以上两位同志所说的实际情况，确实也都有一定的道理。
针对柯峰的问题，黄少军提出另外一个可以解决的想法，不增加2-2S规则，但要对PCR扩增曲线的斜率进行监测，因为扩增曲线的斜率实际上是对整个PCR扩增系统的扩增效率的反映，如果监测扩增曲线斜率在一个可接受的范围内，那么可以说PCR的扩增效率基本上是恒定的，这样也基本上不会出现系统误差，仅仅会出现DNA提取过程导致的偶然误差。
结合两位同志的讨论，考虑增加R-4S规则，同时监测扩增曲线斜率。
PCR 检验的质量控制
行业综述Industry Reviewdoi:10.16736/41-1434/ts.2022.16.015PCR检验的质量控制Quality Control of PCR Test◎ 徐 枫1，艾 萍2，金 浩1，刘 卓3，陈振宇2，赵 咏4（1.锦州市疾病预防控制中心，辽宁 锦州 121000；2.锦州市第二医院，辽宁 锦州 121000；3.锦州市妇婴医院，辽宁 锦州 121000；4.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000）XU Feng1, AI Ping2, JIN Hao1, LIU Zhuo3, CHEN Zhenyu2, ZHAO Yong4(1.Jinzhou Center for Disease Control and Prevention, Jinzhou 121000, China;2.The Second Hospital of Jinzhou City, Jinzhou 121000, China;3.Jinzhou Women and Infants Hospital, Jinzhou 121000, China;4.Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)摘 要：PCR检验技术在生命科学、遗传学、疾病诊断和食源性病原菌检验等方面得到了广泛的应用，具有灵敏度高、特异性强、快速简便的特点。
在突发公共卫生事件时，PCR技术可以实现大批量的检验，能够在短时间内出具检验结果，为有效控制突发公共卫生事件提供有力的技术支持。
由于PCR检验技术的高灵敏性，极易造成假阳性结果，为保证检验结果的准确无误，必须在实验室设置设施、仪器设备和人员管理以及试剂耗材、样本采集运输方面做好控制。
关键词：聚合酶链式反应；检验；质量控制Abstract：PCR detection technology has been widely used in life science, genetics, disease diagnosis, food-borne pathogen detection and other aspects, with high sensitivity, strong specificity, rapid and simple characteristics. When public health emergencies break out, PCR technology can realize large-scale inspection and produce inspection results in a short time, providing strong technical support for effective control of public health emergencies. Due to the high sensitivity of PCR test technology, it is easy to cause false positive results. In order to ensure the accuracy of test results, it is necessary to control laboratory facilities, instruments and equipment, personnel management, reagents and consumables, sample collection and transportation.Keywords：polymerase chain reaction; test; quality control中图分类号：R197.2食品的安全问题一直是社会关心的热点，它直接关系到公众的身体健康以及生命安全，并对国民经济的发展以及社会的稳定产生影响。
临床PCR检验的室内质控方法（可编辑）
临床PCR检验的室内质控方法临床PCR检验的室内质控方法卫生部临床检验中心李金明存在的问题概念不清不知道具体怎么做不会写室内质控的SOP 不知道如何选择室内质控物不会分析室内质控的结果室内质控SOP存在的问题责任人不清。
质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。
有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。
没有明确所选用的质控方法。
对前20次的测定的室内质控没有解决方法。
没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。
并且一般都没有阴性失控的判断方法。
没有失控后的分析及处理措施。
室内质量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。
可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。
是对实验室测定的即时性评价。
室内质量控制（IQC）的基本内容主要包括三个方面：（1）测定前的质量控制；（2）统计学质量控制；（3）质量控制的评价。
测定前的质量控制实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法人员培训实验室设施、仪器设备及管理实验室空间及工作流程的设计实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源临床PCR实验室设计的一般原则各区独立注意风向因地制宜方便工作临床PCR实验室质量管理的特点“无基因”概念实验室要有严格的人员进入限制和程序使用合格的试剂和消耗品 PCR实验室“污染”的主要来源临床标本中存在的大量待测微生物科研中得到的质粒克隆以前分析研究的特定微生物大量存在于实验环境中的特定微生物以前扩增产物的残留污染。
这也是PCR实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。
PCR实验室室间质控记录及失控分析记录
日期 室间质控来源 室间质控编号 试剂品牌 FAM通道 HEX通道 是否在控
武汉明德 武汉明德 武汉明德 武汉明德 武汉明德 结果回执时间，并附上回执结果、证书，如有失控，请做出失控分析：
操作人
记录人
日期 室间质控来源 室间质控编号 试剂品牌 FAM通道 HEX通道 是否在控 操作人
武汉明德 武汉明德 武汉明德 武汉明德 武汉明德 结果回执时间，并附上回执结果、证书，如有失控，请做出失控分析：
记录人
日期 室间质控来源 室间质控编号 试剂品牌 FAM通道 HEX通道 是否在控 操作人
武汉明德 武汉明德 武汉明德 武汉明德 武汉明德 结果回执时间，并附上回执结果、证书，如有失控，请做出失控分析：
记录人
人民医院检验科 PCR实验室室间质控记录
及失控分析记录
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
广西临床检验中心
对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
广西临床检验中心
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
广西临床检验中心
标准曲线分析
斜率、截距、相关性
广西临床检验中心
数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
细菌PCR检测的质控方法-IAC
IAC构建实例三-替换
替换-重叠延伸技术
159bp
189bp
替换-重叠延伸
目标DNA：159bp(百日咳杆菌B.pertussis的DNA）
P1：5`-TGCAACATCCTGTCCCCTTAATCC-3` P2：5`-ATGCTTATGGGTGTTCATCCGGCC-3`
ICD I-primer P3: 5`-AATGCGCAAGCCTGATGTCAGTCAGATGAACCATGCATAC-3`
非竞争性IAC需考虑的因素
IAC引物的浓度
控制IAC引物的浓度（最低水平），限制IAC的扩增， 防止对NTP和DNA聚合酶的过度竞争。
二个PCR反应的条件优化
在同一个PCR条件下，主要对目标DNA的PCR条件优 化，IAC的扩增只要能检出就行。
IAC扩增的限制
IAC的构建策略
删除：在目标DNA的壤杆菌Ti质粒中的tmr基因)
• ns PCR产物：
201bp(Ti质粒中的virC)
构建：
将目标DNA克隆至pGEM-T质粒， 形成pGtmr质粒，导入E. coli中，
纯化质粒，用内切酶HpaI在克隆
段内部位点处分割，成线性pGtmr, 和ns连接成pGtrmns质粒, 导入大 肠杆菌DH5α 。
产生一个长度小于目标DNA的DNA片段。
插入：在目标DNA的正反引物位置之间插入一段DNA，
产生一个长度大于目标DNA的DNA片段。
替换（修饰）：在目标DNA的正反引物位置之间置换
一段与目标DNA无关的DNA。
IAC构造实例一-删减
IAC构建方法-删减
目标DNA：E. coli O157的rfbE 基因
PCR质量控制2012.3
耗材、试剂
耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检 试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检 选择或更换试剂品牌：试剂性能评估 更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率
更换试剂批号质检
设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照 试剂不合格 1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标 准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。 2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在 问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。 3) 阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可 能。 4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值 偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。
使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌， 以使可能存在的RNase永久性失活。
标本验收、拒收
血液标本：溶血、严重脂血等应拒收 泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。 痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般<10个，白细胞 一般>25个。
标本运送
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件 （温度、时间）作出相应规定。 靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送， 建议采集后8h之内送至实验室； 靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为 较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验 室； 所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至 实验室前，均应放2－8℃临时保存。 淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。
-2S
-3S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4） R4S 在同一批中两个控制结果差超出4S范围， 其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S 限值。或其中一个超出了＋1.5S，另一个超出了 －2.5S限值属随机误差过大，为失控。
pcr实验室室内质控规则及意义
pcr实验室室内质控规则及意义PCR 实验室建设的主要目标是为PCR 检验提供一个安全、规范、方便、适宜的环境和场所。
PCR 检验是一项要求高、技术性较强的工作，为了确保PCR 检验工作的顺利进行，保证PCR 检验工作的质量，实验室的建设，包括实验室工作区域的设置、设备配置、质量控制和质量保证、清洁及废弃物处理等非常重要。
环境和场所作为实验室检验中非常关键的一个要素，在PCR 检验中同样至关重要。
目前，在我国相关国家标准、行业标准、实验室认可指南、国家相关部委公告等文件中均对PCR 实验室的设计和建设都给出了明确的要求，把涉及基因扩增的实验室包括PCR 实验室的建设和管理纳入了法制化、规范化的轨道。
一、实验前的质量控制(一) 人员实验操作人员应具备良好的分子生物学专业技术操作规范。
PCR 都是微量操作，要想获得稳定可靠的检测结果，操作人员就需要一定的专业技术知识与经验，要尽可能做到知其然又知其所以然。
从实际工作中来看，不同的操作者所获得的测定结果往往差异也很大，因此，人员培训相当重要，尤其是内部针对性的培训。
(二)环境实验室的设计和布局应符合相关法律法规的要求，生物安全方面要符合GB19489-2008 的规定。
要将不相容活动的相邻区域进行有效隔离，合理设计实验室分区，进入各个工作区域须遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、样品制备区、PCR 反应配制区、扩增区至扩增产物分析区，防止不同区域间的交叉污染对检测结果造成的影响。
总结为一句话就是:严格遵守“各区独立、单一方向”。
对影响检测质量的区域的进入和使用，也要加以控制，非实验有关人员和物品不能随便进入。
(三) 仪器设备仪器设备的正确使用、维护和校准是保证PCR 结果准确的前提。
对实验室中的仪器设备，如扩增仪、离心机、移液器、生物安全柜等应建立一套规范化、标准化的操作程序。
各实验区域应有专用的仪器设备，每台设备要加贴唯一性标签，同一区域内的仪器设备、物品和工作服应有明显标记，避免与其他区域混用。
PCR检测方法分析性能评价
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性能验证前的准备
• 应熟悉待验证的检测系统 • 应熟悉验证方案的步骤(PCR检测项目成本高、阳性标
本来源困难,精密度和正确度验证可以采用EP15-A2 文 件) • 制定质量保证措施 • 确保足够的样本数量和覆盖较宽检测范围 • 确定比较方法
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• 至少25个重复测量 • 每个样品重复测量的结果与该样品的参考值比较,以确
定是否超出目标误差,超过误差目标的结果数量可用于 评价此方法在该浓度是否合适.
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20-1000个检测值符合超出LoB预期95% 比例的下限
检测数 观察比例的下限(%) 检测数 观察比例的下限(%）
• 计算偏倚或百分比偏倚的标准差
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结果判断
• 如果偏倚<厂家指标(实验室指标),验证通过 • 如果偏倚>厂家指标(实验室指标),则通过计算验证值
进行差异的显著性检验, 在验证限范围内,验证通过
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• 选择厂家申明中使用的比较方法为本方案的比较方法
• 每天做室内质控,如果失控,剔除数据,重新进行测定 • 实验数据的统计学处理:批内标准差、实验室内标准差
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结果判断
• 重复性验证:
• 批内标准差<厂家申明, 验证通过
• 批内标准差>厂家申明, 则通过计算验证值进行 差异的显著性检验,
批内标准差<验证值验证 通过
• 实验室内精密度验证:
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检测方法与明确诊断比较2*2列联表
PCR常见异常扩增曲线
PCR常见异常扩增曲线问题解析在PCR反应体系中加入荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每⼀个循环变得“可见”，最后通过循环阈值( Cycle threshold，Ct) 和标准曲线的关系对起始模板进⾏定量分析。
PCR扩增过程中，每⼀轮循环均检测⼀次荧光信号的强度。
随着反应循环次数的不断增加，所扩增的⽬的基因⽚段呈指数规律增长，反应中产生的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正比。
仪器实时检测和采集的荧光信号，随着时间和循环数的不断增加，产⽣⼀条反映实时荧光信号强度变化的曲线，称为扩增曲线。
扩增曲线以循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标。
样本扩增曲线是反应PCR进程的镜⼦，我们可以通过观察扩增曲线来评估PCR扩增效率，分析实验是否顺利进⾏。
扩增曲线的正常与否，反映出实验中存在的诸多因素和问题，对新冠核酸检测结果判读⾄关重要。
⼀、正常状态扩增曲线正常PCR扩增曲线呈“S”型，分为基线期、指数期、平台期。
扩增曲线良好的指标是曲线拐点清楚，扩增曲线整体平⾏性好，基线平⽽⽆上扬现象。
基线期PCR起始时，刚开始前几个循环的荧光信号还没有发生变化，接近一条直线，将其称之为基线，一般是3-15个循环。
在基线期内，扩增的荧光信号被背景荧光信号所掩盖，无法判断PCR产物量的变化。
指数期扩增的荧光信号高于背景荧光信号，扩增曲线起峰，开始进入指数期。
在指数期内，每个循环积聚的产物准确加倍（假定100%反应效率）。
该阶段的PCR反应具有高度特异性和精确度。
因为所有试剂均充足，反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍，所以产物出现指数级扩增。
只有在这个阶段，Cq值与初始模板量的对数之间存在线性关系，所以在此阶段进行定量分析最合适。
线性期（高变异性）随着PCR反应体系各成分的消耗，其中的一种或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR产物不再加倍，该阶段不再是指数级扩增。
平台期反应停止，不再产生更多产物，并且如果放置时间够长，PCR产物将开始降解。