花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

摘要设计1对特异引物,以花生栽培种四粒红及其与野生种光叶花生的种间杂种为材料,对花生its1-5.8s-its2序列进行高保真pcr扩增,获得长度约800bp的单一条带,在对pcr产物进行克隆测序的基础上构建了花生属进化树。

关键词花生;内转录间隔区(its)序列;pcr;进化树

中图分类号q789文献标识码a文章编号

1007-5739(2009)08-0103-02

内转录间隔区序列(its)广泛应用于被子植物系统进化研究,为禾本科、大豆属、棉属等植物的系统进化研究提供了宝贵的分子遗传学依据。花生rdna有关研究报道较少,尽管有分离 rdna its的报道,但未在此基础上进行花生属植物的系统发育分析。本研究对花生its序列进行分离、测序,并将其与genbank中登录的花生its 序列进行比较和分析,为花生的系统演化及花生的分类鉴定提供分子水平的证据。

1材料与方法

1.1材料

试验所用花生为栽培种四粒红(silihong)及四粒红与野生种光叶花生的杂交后代(silihong×arachis glabrata benth.)高世代材料。花生种子取自山东省花生研究所莱西试验站。

根据bhagwat等报道的its序列,使用软件

sergene.v7.1设计1对特异引物:

its1&2-1∶5’-gtcgatgccgcacaaaccaggatt-3’

its1&2-2∶5’-cgggcacaacggggctctca-3’

这对引物的扩增区包含its1、5.8s和its2完整区域。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2方法

取3~5粒花生未成熟的叶片置于1.5ml离心管中,加40μl

0.25mol/l naoh,用1ml枪头套一pcr管将叶片捣碎,煮沸30s,加160μl含pvp-40的tris-hcl(ph值7.6),煮沸2min,10 000rpm离心5min,取上清液4℃保存,用时取1μl作模板。取1-1d4-1、

1-4d4-1、四粒红各品种未成熟叶片按上述步骤作简单处理,依次编号为1、2、3作为pcr模板。

pcr程序为:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃

1.5min)30个循环,72℃ 10min。先用takara taq dna聚合酶作pcr,确定有预期分子量大小的条带后再用高保真pfu dna聚合酶扩增,切胶回收dna,连接转化后挑取阳性克隆测序。利用

sergene.v7.1进行多序列比对。

用mega4.0软件以拟南芥核rdna序列为外群组(outgroup),采用3种方法(nj、me、mp)构建进化树,并进行bootstrap analysis 1 000检验[2]。

2结果与分析

2.1its区序列的pcr扩增

以总dna为模版,利用所设计的 2条引物pcr扩增出its区的特

异性条带,分子量在800bp左右(图1),与genbank所登录的its序列片段长度相近。用taq dna pol pcr体系和pfu dna pol pcr体系所扩增出的its区序列片段电泳迁移率相同。

2.2its1-5.8s-its2序列测定与多序列比对

四粒红与野生种光叶杂交后代扩增产物6份穿刺培养物测序得到3条有差异的条带,分别命名为1-1、1-2、1-4。四粒红扩增产物测序后得到的序列命名为3-3。

通过比对发现4条序列在its1-5.8s-its2区共有单核苷酸多态性位点14个,其中6个位于its1区,2个位于5.8s rdna中,6个位于its2区,其他植物上的研究认为5.8s rdna在进化上相当保守,而its1和its2则变化很大,本试验结果与这一结论一致。

2.3花生属进化树构建

通过nj、me和mp法构建花生属进化树,其拓扑结构大致相似,但也有所区别。总体看来,各个区组的材料分别聚集到一起,与基于传

统形态学特征的花生属区组划分基本一致。从本研究所构建的3棵进化树来看,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组在花生属中是比较原始的,花生区组(a)进化程度较高;gregory等根据

花生属种间可交配性提出围脉(ex)区组、直立(er)区组和根茎(r)区组原根茎系较原始,而花生(a)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组、异形花(h)区组、匍匐(p)区组以及根茎(r)区组真根茎系进化程度较高。

研究结果表明,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组和异形花(h)区组亲缘关系较近;直立(er)区组和三叶(trie)区组关系密切,两者

与匍匐(p)区组形成一大的分支。

在本研究构建进化树所涉及的花生材料当中,有3个未命名的种,其区组归属尚不明确,但从所构建的进化树上

看,a.sp.dap-2004-1、a.sp.dap-2004-2应属于花生(a)区

组,a.sp.dap-2004-3可能属于直立(er)区组或匍匐(p)区组。

本研究所得4条序列均与花生区组的序列聚为一类,其中1-1、1-4与四粒红(3-3)关系相近,而1-2与其关系较远,说明种间杂种既与母本有相似的地方,也与母本有一定的差异,为杂种的真实性提供

了分子水平证据。

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