花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析摘要设计1对特异引物,以花生栽培种四粒红及其与野生种光叶花生的种间杂种为材料,对花生its1-5.8s-its2序列进行高保真pcr扩增,获得长度约800bp的单一条带,在对pcr产物进行克隆测序的基础上构建了花生属进化树。

关键词花生;内转录间隔区(its)序列;pcr;进化树中图分类号q789文献标识码a文章编号1007-5739(2009)08-0103-02内转录间隔区序列(its)广泛应用于被子植物系统进化研究,为禾本科、大豆属、棉属等植物的系统进化研究提供了宝贵的分子遗传学依据。

花生rdna有关研究报道较少,尽管有分离 rdna its的报道,但未在此基础上进行花生属植物的系统发育分析。

本研究对花生its序列进行分离、测序,并将其与genbank中登录的花生its 序列进行比较和分析,为花生的系统演化及花生的分类鉴定提供分子水平的证据。

1材料与方法1.1材料试验所用花生为栽培种四粒红(silihong)及四粒红与野生种光叶花生的杂交后代(silihong×arachis glabrata benth.)高世代材料。

花生种子取自山东省花生研究所莱西试验站。

根据bhagwat等报道的its序列,使用软件sergene.v7.1设计1对特异引物:its1&2-1∶5’-gtcgatgccgcacaaaccaggatt-3’its1&2-2∶5’-cgggcacaacggggctctca-3’这对引物的扩增区包含its1、5.8s和its2完整区域。

引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2方法取3~5粒花生未成熟的叶片置于1.5ml离心管中,加40μl0.25mol/l naoh,用1ml枪头套一pcr管将叶片捣碎,煮沸30s,加160μl含pvp-40的tris-hcl(ph值7.6),煮沸2min,10 000rpm离心5min,取上清液4℃保存,用时取1μl作模板。

取1-1d4-1、1-4d4-1、四粒红各品种未成熟叶片按上述步骤作简单处理,依次编号为1、2、3作为pcr模板。

pcr程序为:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃1.5min)30个循环,72℃ 10min。

先用takara taq dna聚合酶作pcr,确定有预期分子量大小的条带后再用高保真pfu dna聚合酶扩增,切胶回收dna,连接转化后挑取阳性克隆测序。

利用sergene.v7.1进行多序列比对。

用mega4.0软件以拟南芥核rdna序列为外群组(outgroup),采用3种方法(nj、me、mp)构建进化树,并进行bootstrap analysis 1 000检验[2]。

2结果与分析2.1its区序列的pcr扩增以总dna为模版,利用所设计的 2条引物pcr扩增出its区的特异性条带,分子量在800bp左右(图1),与genbank所登录的its序列片段长度相近。

用taq dna pol pcr体系和pfu dna pol pcr体系所扩增出的its区序列片段电泳迁移率相同。

2.2its1-5.8s-its2序列测定与多序列比对四粒红与野生种光叶杂交后代扩增产物6份穿刺培养物测序得到3条有差异的条带,分别命名为1-1、1-2、1-4。

四粒红扩增产物测序后得到的序列命名为3-3。

通过比对发现4条序列在its1-5.8s-its2区共有单核苷酸多态性位点14个,其中6个位于its1区,2个位于5.8s rdna中,6个位于its2区,其他植物上的研究认为5.8s rdna在进化上相当保守,而its1和its2则变化很大,本试验结果与这一结论一致。

2.3花生属进化树构建通过nj、me和mp法构建花生属进化树,其拓扑结构大致相似,但也有所区别。

总体看来,各个区组的材料分别聚集到一起,与基于传统形态学特征的花生属区组划分基本一致。

从本研究所构建的3棵进化树来看,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组在花生属中是比较原始的,花生区组(a)进化程度较高;gregory等根据花生属种间可交配性提出围脉(ex)区组、直立(er)区组和根茎(r)区组原根茎系较原始,而花生(a)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组、异形花(h)区组、匍匐(p)区组以及根茎(r)区组真根茎系进化程度较高。

研究结果表明,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组和异形花(h)区组亲缘关系较近;直立(er)区组和三叶(trie)区组关系密切,两者与匍匐(p)区组形成一大的分支。

在本研究构建进化树所涉及的花生材料当中,有3个未命名的种,其区组归属尚不明确,但从所构建的进化树上看,a.sp.dap-2004-1、a.sp.dap-2004-2应属于花生(a)区组,a.sp.dap-2004-3可能属于直立(er)区组或匍匐(p)区组。

本研究所得4条序列均与花生区组的序列聚为一类,其中1-1、1-4与四粒红(3-3)关系相近,而1-2与其关系较远,说明种间杂种既与母本有相似的地方,也与母本有一定的差异,为杂种的真实性提供了分子水平证据。

3参考文献[1] krapovickas a.the origin,variability and spread of the groundnut(arachishypogaea)(englishtranslation)[m].london:p.j.ucko and i.s.falk(eds.),1969.[2] krapovickas a,gregory w c.taxonomy of the genus arachis (leguminosae)[j].bonplandia,2007(16):1-18.[3] 汪小全,洪德元.植物分子系统学近五年的研究进展概况[j].植物分类学报,1997,35(5):465-480.[4] hamby r k,zimmer e a.ribosomal rna as a phylogenetic tool in plant systematics[m]∥soltis p s,soltis d e,doyle j j,et al.molecular sys-tematics of plants.new york:chapman &hall,1992.[5] prine g m.perennial peanuts for forage[j].soil crop sci. soc. fla.proc.,1973(32):33-35.[6] 顾红雅.限制性片段长度多态性(rfl ps)在植物系统与进行研究中的应用[m]∥陈家宽,杨继.植物进化生物学.武汉:武汉大学出版社,1994:209-231.[7] second g,wang z y.mitochondrial dna rfl p in genus oryza and cultivated rice[j].genet resour cropevol.,1992(39):125-140.[8] 陈之端,汪小全,孙海英,等.马尾树科的系统位置:来自rbcl 基因核苷酸序列的证据[j].植物分类学报,1998,36(1):1-7.[9] olmstead r g,palmer j d.chloroplast dna systematics:a re-view of methods and data analysis[j].amer j.bot.,1994(81):1205-1224.[10] wolfe k h,li w h,sharp p m.rates of nucleotide substitution vary greatly among plantmitochondrial,choroplast,and nuclear dnas[j].proc natl acad sci usa,1987(84):9054-9058.[11] 赵鸿,彭德良,朱建兰.rdna-its-pcr 技术在植物寄生线虫分子诊断中的应用[j].植物检疫,2004,18(2):1-6.[12] kollipara k p,singh r j,hymowitz t.phylogenetic and genomic relationships in the genus glycine willd.based on sequences from the its region of nuclearrdna[j].genome,1997(40):57-68.[13] ainouche m l,bayer r j.on the origins of the tetraploid bro-mus species(section b romus,poaceae):insights from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal dna[j].genome,1997(5):730-743.[14] 张文驹.应用rdna的its区探讨多倍体小麦的基因组起源[d].武汉:武汉大学,1998.[15] kim k j,jansen r parisons of phylogenetichypotheses among different data sets in dwarf dandelions(krigia):additional information from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomaldna[j].plant syst. evol.,1994(3-4):157-185.[16] sang t,crawford d j,kim s c,et al.radiation of theendemic genus dendroseris(asteraceae)on the juan fernandez islands:evidence from sequences of the its regions of nuclear ribosomal dna[j].amer j. bot.,1994(81):1494-1501.[17] wendel j f,schnabel a s,seelanan t.bidirectional interlo-cus concerted evolution following allopolyploidspeciation in cotton(gossypium)[j].proc. natl. acad. sci. usa,1995(92):280-284.[18] 杨琳,郭爱莲,何钧,等.玉米秸秆利用中木质素降解中的研究[j].西北大学学报(自然科学版),2001,31(4):334-336.[19] 李春香,杨群.pcr产物直接测序还是克隆测序?———密叶杉属rdna its序列的测定方法[j].植物学通报,2002,19(6):698-704.[20] 孙大容.花生育种学[m].北京:中国农业出版社,1998.。