8基因工程分子标记技术及其应用

2.1 分子图谱的构建
主要包括以下步骤：
– 根据遗传材料之间的多态性确定亲 本组合，建立作图群体；
– 群体中不同植株或品系的标记基因 型分析；
– 标记间的连锁关系。
2.2品种、品系鉴定和杂种纯度分析
在国外，指纹图谱用来鉴定作物品种的 DUS（Distinctness，Unformity， Stability），为品种审定、保存、保护 提供依据。 指纹图谱要求：分辨率高，多态性强； 重复性好，稳定可靠。
Right primer
SBE1 CAPS marker derived from 3’-end was used to detect SBE1 gene in DH lines
SCAR标记
1.2 基于PCR技术的分子标记
简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR）或称微卫星DNA（Microsatellite Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。
M P1P21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16171819202122
SSR检测杂交种郑单958纯度
P1:父本；P2：母本； 1-22：杂交种
2.3 亲缘关系分析
DNA标记所检测的是作物基因组DNA水平的差异， 因而非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间 的比较可覆盖基因组，大大提高结果的可靠性。
–在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序 列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保 守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多 态性。
SSR标记
M P1P21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16171819202122
SSR检测杂交种郑单958纯度
P1:父本；P2：母本； 1-22：杂交种
相关序列扩增多态性(SRAP）
–美国加州大学蔬菜作物系Li 与Quiros 博士 于2001年提出。可用来扩增ORF区域。
–正向引物核心序列CCGG，反向AATT，17-18 bp
–特点： 分布均匀，多态性丰富（10个/组合）， 重现性好 多为共显性 多为外显子区域
常用的SRAP引物
靶位区域扩增多态性(TRAP)
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
相关序列扩增多态性( sequence related amplified polymorphism, SRAP)
靶位区域扩增多态性( target region amplified polymorphism ,TRAP)
–无种属特异性 –适合于自动化分析 –不需制备探针、杂交等程序，成本较低。 –DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组
DNA。
1.2 基于PCR技术的分子标记
RAPD缺点：
–是一种显性标记 –稳定性较差
1.2 基于PCR技术的分子标记
特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP） 或称序标位（Sequence Tagged Sites，STS）包括以下两种：
数量极多，遍及整个基因组；
多态性高，利用大量引物、探针可完成覆 盖基因组的分析；
表现为中性，即不影响目标性状的表达， 与不良性状无必然的连锁；
许多标记为共显性。
1. 几种常用的分子标记技术
基于Southern杂交的分子标记 基于PCR技术的分子标记 第三代分子标记：SNP
1.1 基于Southern杂交的分子标记
限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA）
1.1 基于Southern杂交的分子标记
限制性片段长度多态性， 简称RFLP – 优点：稳定，是一种共显性标记，可
区分纯合体与杂合体。 – 缺点：
Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG
Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT
– 缺点：多态性分布集中，合成探针困难，应 用并不广泛。
Genetic fingerprinting
Parents and offspring have similar genetic fingerprints
1.2 基于PCR技术的分子标记
随机扩增片段长度多态性DNA （Random Amplified Polymorphic DNA） 特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP） 简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR） 微卫星间隔 (Inter simple sequence repeat， 简称 ISSR)
CAP 标记
SBE1片段
Left primer
Indica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT
Indica (51) TACTTGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TACTAGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG
单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）
–是指基因组DNA中特定位置的单个核苷酸变 异而引起的DNA多态性。大约每1 000 bp就 存在一个SNP。
–基于构象的检测方法；以杂交为基础；实 时荧光PCR；引物延伸法；寡核苷酸连接分 析；内切酶技术；光谱和电子信号；其他 的方法，如磁性纳米技术等。
分析所需DNA量较大， 步骤较多，周期长， 制备探针及检测中要用到放射性同位素
Restriction fragment length polymorphism analysis
RFLP Based on the mutations
RFLP
1.1 基于Southern杂交的分子标记
小卫星DNA又称数目可变串联重复序列 （Variable Number of Tandem Repeat， VNTR）是一种重复DNA小序列，为10几百核苷酸，拷贝数10-10000不等。
Right primer
G C A T
G C A T
变性Βιβλιοθήκη Baidu
变性，退火
PCR
CEL I
走胶，检测
2 分子标记在育种中的应用
分子图谱的构建 品种、品系鉴定和杂交种纯度分析 亲缘关系分析 基因标记及标记辅助育种（Markerassisted Selection，MAS） 数量性状因位点（QTL）的分子标记辅 助选择
–品种资源的鉴定与保存 –研究作物的起源与发展进化 –指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效
划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据。
2.4 基因标记及标记辅助育种
分子标记技术及其应用
遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker） 分子标记（molecular marker）
分子标记的优越性：
直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受季节、环境 的限制，不存在表达与否的问题；
–美国农部北方作物科学实验室Hu 与Vick 于
2003 年提出，是基于已知的cDNA 或EST 序列信息 进行扩增。
–16～20 核苷的固定引物（来自靶EST 序列） 与任意引物（来自SRAP）。
种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要 性状基因标记、gDNA 与cDNA 指纹分析乃至图 位克隆等方面。
SNP标记
SBE1片段
Left primer
Indica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT
Indica (51) TCCATGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TCCATc TTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG
1.2 基于PCR技术的分子标记
随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD 技术
–是由Williams和Welsh（1990）同时发展起 来的一项遗传标记技术。RAPD一般采用10个 核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度 降至35℃左右。
RAPD标记
1.2 基于PCR技术的分子标记
RAPD的优点：
1.2 基于PCR技术的分子标记
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）， 又称选择性限制片段扩增（Selective Restriction Fragment Amplification）。
AFLP 标记
High percentage of polymorphic bands No prior sequence knowledge required Highly reproducible AFLP fingerprints Genome survey Saturation of target gene
微卫星间隔 (Inter simple sequence repeat，简称 ISSR)
–加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz 等于1994 年提出
–引物长度通常为 16-18 个碱基序列，由 1-4 个碱基组成的串联重复 (有时加上几个非重复 的锚定碱基) 组成。
–为显性标记，引物容易设计、实验重复性强、 操作简单、成本低。
–酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）
–序列特异性扩增区（Sequencecharacterized Amplified Region，SCAR） 和位点特异相关引物（Allele－Specific Associated Primers，ASAP）
The specific band in Xianyou 63 amplified with AFLP primer combination E-AAC/M-CAT
123
Complementary pattern amplified with AFLP primer p EcoRI-AAG/MseI-CAA. 1. Female parent Zhenxian 97A 2. Shanyou 63(Hybrid); 3. Male parent Minghui63.
Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG
Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT