第8章 酵母基因工程PPT幻灯片

酵母菌表达宿主系统
酿酒酵母的缺点： ① 发酵时会产生乙醇，难以进行高密度发酵，直接导致外
源基因很难达到很高的水平 ② 缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌的蛋白质能力
较差 ③ 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往
往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞 紧密结合，而不能大量分泌 ④ 表达菌株传代不稳定，表达质粒易丢失 ⑤ 分泌效率低，大于30KD的蛋白质几乎不分泌
酵母表达载体
• 酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵 母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体 （shuttle vector）。
• 酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序 列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可 以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性 基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖 和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要 是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列) 或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)， 以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
酵母菌表达宿主系统
（2）乳酸克鲁维酵母表达系统 •可以高密度发酵，不需要甲醇防爆装置，工业化生产时不降 低生产率及酵母菌的再繁殖能力。
•乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异 源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条 件下，也能稳定遗传40代以上。
•乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均 优于酿酒酵母表达系统。
酵母表达载体
2．酵母载体的种类 • 酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类
• 酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分 为下列五类：
① 酵母整合型质粒YIp ② 酵母附加体质粒YEp ③ 酵母复制型质粒YRp ④ 酵母着丝粒质粒YCp ⑤ 酵母人工染色体YAC
酵母表达载体
（1）酵母整合型质粒YIp：缺乏酵 母的复制起始位点，不能在酵母中自 主复制，含有酵母的筛选标记ura3基 因。具有整合介导区，所以，它只有 整合到酵母染色体中才能稳定。
酵母表达载体
1．酵母载体的基本结构 •DNA复制起始区：通常来自于2μ质粒的复制起始区及酵母 基因组的自主复制序列 •筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选 •整合介导区:能有效介导载体与宿主之间发生同源重组 •有丝分裂稳定区 •表达盒：启动子，分泌信号序列，终止子
酵母表达载体
酿酒酵母中的2μ环状质粒 •环状质粒，拷贝数达50至100 个。 •IRs反向重复序列，600bp •FLP编码产物驱动IRs的同源重 组 •REP编码产物控制质粒的稳定 性 •STB REP的结合位点 •接合酵母属中的pSR1和pSB1， 以及克鲁维酵母属中的pKD1 等均与2μ质粒类似。
主要内容
第一节 酵母基因工程表达体系 酵母基因表达宿主系统 酵母菌表达载体 酵母菌的转化系统
第二节 常见的酵母基因表达系统 第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 酵母基因工程应用举例
第一节 酵母基因表达体系——宿主 系统
• 酵母菌（Yeast）是一群 以芽殖或裂殖方式进行 无性繁殖的单细胞真核 生物，分属于子囊菌纲、 担子菌纲、半知菌类， 共由56个属和500多个 种组成。
酵母菌表达宿主系统
（1）酿酒酵母 优点： ① 酿酒酵母长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安
全性好，已被FDA认定为安全性生物，其表达产物不需 经过大量宿主安全性实验 ② 生长迅速，工艺简单，成本低 ③ 是真核生物，可以对蛋白进行翻译后加工 ④ 表达产物可分泌表达，易于纯化 ⑤ 遗传背景清楚，易进行操作
已有多种蛋白利用此系统进行了表达，如人蛋白凝血因子 VIII a，人白细胞介素IL-6等。
酵母菌表达宿主系统
（5）巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生长， 甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。
表达系统优势： •生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表 达。 •由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源 基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因的高 效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20 余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
（3）酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区 (ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其 转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个。 •ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。 •以ARS为复制子的质粒称为YRp，以2μ质粒上的复制元件为复制子的 质粒称为YEp •上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后， 质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
•含有酵母菌染色体DNA同源序列的 YIp质粒的构建 •在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色 体DNA特定序列和标记基因，构建 出来的质粒称为YIp。目的基因表达 盒通常插在染色体DNA特定序列中， 这样目的基因就能高效整合入酵母菌
酵母表达载体
（2）酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2μ质粒DNA复制有关的序 列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高。
• 酵母菌是比较成熟的真 核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本 要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加Fra Baidu bibliotek能力。
酵母菌表达宿主系统
（3） 产朊假丝酵母 •食品及药品工业的安全生物 •不具有酵解抑制有氧氧化效应，因而在严格好气的条件下不 会产生乙醇 •发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可以达到92g/L •在廉价的糖蜜中就能生产，成本低
酵母菌表达宿主系统
（4）栗酒裂殖酵母 裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，是一类不能出芽生殖而 只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母。 与其他酵母相比，它具有更多的与高等真核生物相似的特性： 线粒体结构，启动子结构，转录机制，对蛋白N-端乙酰化功 能均更接近于哺乳动物细胞。