第8章 酵母基因工程PPT幻灯片
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酵母菌的基因工程PPT课件
多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
7. 缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要
人工修正。
.
3
5.2 .1 酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
有用的蛋白结构域
1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
.
10
酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。
Irs反向重复序列 600bp，重组FLP编码产 物驱动Irs的同源重组 REP编码产物控制质粒 的稳定性STB REP的结 合位点
接合酵母属中的 pSRI、pSR1、pSB2和 pSR1以及克鲁维酵母属 中的pKD1质粒等，均有 类似的结构。
.
11
酵母菌种的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线性质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线 性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100 个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的 毒素蛋白基因。
.
16
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳 定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下， 转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但 是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率 的严重制约。
原生质转化法德一个显著特点是，一个受体 细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化 的原生质占转化子总数的25%-33%。
7. 缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要
人工修正。
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5.2 .1 酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
有用的蛋白结构域
1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
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酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。
Irs反向重复序列 600bp，重组FLP编码产 物驱动Irs的同源重组 REP编码产物控制质粒 的稳定性STB REP的结 合位点
接合酵母属中的 pSRI、pSR1、pSB2和 pSR1以及克鲁维酵母属 中的pKD1质粒等，均有 类似的结构。
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酵母菌种的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线性质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线 性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100 个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的 毒素蛋白基因。
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酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳 定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下， 转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但 是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率 的严重制约。
原生质转化法德一个显著特点是，一个受体 细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化 的原生质占转化子总数的25%-33%。
基因工程及其应用幻灯片
• 运载体的作用有哪些？
作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转 移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对 外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
• 基因的运载工具——运载体：
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒
• 质粒：
白细胞介素-2 大肠杆菌 治疗某些癌症
a—干扰素 酵母菌
治疗癌症或病毒感染
乙型肝炎疫苗 酵母菌
预防病毒性肝炎
溶血栓剂
哺乳动物细治疗心血管病（心脏病） 胞
胰岛素是治疗糖尿病的特效 药，长期以来只能依靠从猪、牛 等动物的胰腺中提取，100Kg胰 腺只能提取4-5g的胰岛素，其产 量之低和价格之高可想而知。
酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（三）基因操作的基本步骤 • 步骤四：目的基因的检测和表达
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
（三）基因操作的基本步骤
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了 表达吗？
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能
基因工程及其应用幻灯片
优选第二节基因工程及其应用
（一）基因操作的工具
• 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶， 能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
特点：特异性。 即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列， 并且能在特定的切点上切割DNA分子。
我国大豆食用油近七成是“转基因”产品
与杂交育种、诱变育种相比较，基因工程育 种的优点有哪些？ 目的性强、克服远源杂交不亲和性、育种周期短
作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转 移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对 外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
• 基因的运载工具——运载体：
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒
• 质粒：
白细胞介素-2 大肠杆菌 治疗某些癌症
a—干扰素 酵母菌
治疗癌症或病毒感染
乙型肝炎疫苗 酵母菌
预防病毒性肝炎
溶血栓剂
哺乳动物细治疗心血管病（心脏病） 胞
胰岛素是治疗糖尿病的特效 药，长期以来只能依靠从猪、牛 等动物的胰腺中提取，100Kg胰 腺只能提取4-5g的胰岛素，其产 量之低和价格之高可想而知。
酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（三）基因操作的基本步骤 • 步骤四：目的基因的检测和表达
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
（三）基因操作的基本步骤
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了 表达吗？
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能
基因工程及其应用幻灯片
优选第二节基因工程及其应用
（一）基因操作的工具
• 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶， 能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
特点：特异性。 即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列， 并且能在特定的切点上切割DNA分子。
我国大豆食用油近七成是“转基因”产品
与杂交育种、诱变育种相比较，基因工程育 种的优点有哪些？ 目的性强、克服远源杂交不亲和性、育种周期短
第八章基因工程ppt第八章基因工程.pptx
表达载体
大肠杆菌表达载体 哺乳动物表达载体
16
质粒载体
大肠杆菌质粒载体 PBR322 枯草杆菌质粒载体 PNC3 酵母菌质粒载体 农杆菌Ti质粒载体 Ti
噬菌体载体
噬菌体载体 Cos噬菌体载体
病毒载体
SV40病毒载体 乳头瘤病毒载体
17
一 常用的克隆载体
1. 质粒（plasmid）：
种类很多，但作为克隆载体须具备。
3＇-末端:Pst1 : 5＇-CTGCAG-3＇ 3＇-GACGTC-5＇
（2）产生平末端(blunt end):
Sma1:
5＇-CCCGGG-3＇
3＇-GGGCCC-5＇
10
4.同功异源酶(isochizomers): 来源不同, 识别和切割位点相同
如:BamH 1 和 Bst 1
5.同尾酶(isoaudamers): 识别序列不同,但产生相同的粘性末端 BamH 1 :GGATCC Sau3A 1: NGATCN
如：—半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选） 编码
A :载体中含一个LacZ基因 半乳糖苷酶
X-gal(无色)
X(蓝色)+gal(半乳糖)
*其中X为有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合
成无色的X-gal
B:在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫半 乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落为 蓝色。
25
C.若Lac Z基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖 苷酶，菌落为无色（白色）。
26
②取代型载体（又叫替换型载体） 理P258
图8-4基因工程原
在DNA分子的中央，插入一段DNA片段： 具有多克隆位点的反向重复序列 当外源DNA插入时其可被置换掉 作用：提高了克隆外源DNA的能力。
酵母菌的基因工程课件
拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
基因工程ppt课件高三
03
基因工程在医学领域的应用
基因治疗
基因治疗是指通过改变人类基因来治疗遗传性疾病和获得性病变的方法 。
基因治疗可以分为直接基因治疗和间接基因治疗。直接基因治疗是将正 常的基因导入病变细胞，以取代异常基因；间接基因治疗则是通过调节
病变细胞的基因表达来达到治疗目的。
基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病等领域具有广泛的应用前景 ，例如囊性纤维化、镰状细胞贫血、癌症等疾病的基因治疗研究已经取 得了一定的成果。
基因工程的发展历程
自20世纪80年代以来，基因工程技术不断发展 和完善，已经广泛应用于农业、工业、医学等领 域。
基因工程的未来发展
随着基因编辑技术的发展和应用，基因工程将在 未来发挥更加重要的作用，有望解决许多人类面 临的重大问题。
基因工程的应用领域
农业领域
基因工程在农业上的应用主要包 括抗虫、抗病、抗除草剂等转基 因作物的培育，以及提高农作物
合成生物学
通过设计和构建人工基因组和细胞系统，实现生物体的定制化，为工 业生产、环境保护等领域提供新的解决方案。
基因工程面临的挑战与问题
安全问题
基因工程操作可能引发不可预测的后果，如基因突变、生态失衡等，需要建立严格的安 全评估和监管机制。
伦理问题
基因工程涉及到人类和动物的遗传信息，可能引发隐私、公平和尊严等方面的伦理问题 ，需要制定相应的伦理准则和法规。
开展基因工程伦理
教育
在学校、社区、企事业单位等各 个层面开展基因工程伦理教育， 引导人们正确看待基因工程技术 的利与弊，树立正确的科技伦理 观念。
05
未来展望与挑战
基因工程的未来发展趋势
基因治疗
利用基因工程技术治疗遗传性疾病和癌症等严重疾病，提高患者的 生活质量和生存率。
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性 繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知 菌类，共由56个属和500多个种组成。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
基因工程[可修改版ppt]
![基因工程[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/2166df4b7375a417866f8fb2.png)
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限
可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组 和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组 和转移
2.2 DNA重组
2.2.1 DNA的一般性质 2.2.1.1 DNA的组成和结构
腺嘌呤脱氧核苷酸(A) 鸟嘌呤脱氧核苷酸(G) 胞嘧啶脱氧核苷酸(C) 胸腺嘧啶脱氧核苷酸(T)
主要途径： 限制性内切核酸酶酶切法 PCR扩增法 化学合成法
2.2.2 获得DNA片段的主要途径
2.2.2.1 限制性内切核酸酶和DNA片段化 限制性内切核酸酶(restriction endonuclease) 功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列, 并在合适的 反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有 3´OH和5´P的DNA片段。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。 切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。
这些酶的普遍缺点： 热稳定性差，DNA热变性后即被灭活。
Taq酶
来自水生嗜热菌Thermus aquaticus YT-1，该菌是 1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得 到。生长在70～75℃极富矿物质的环境中。
Taq聚合酶的特点及浓度：
具有良好的热稳定性。在70～75℃时生物学活性最 高；92.5℃时半衰期为130 min。
人类DNA的长度相当于3200公里
2 nm
11 nm
30 nm
DNA双螺旋短区域 染色质节段
由紧密包装的核小体组 成的30nm的染色质纤维
染色体节段的一部分 中期染色体的凝缩节段
染色体
300 nm
700 nm
1400 nm
可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组 和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组 和转移
2.2 DNA重组
2.2.1 DNA的一般性质 2.2.1.1 DNA的组成和结构
腺嘌呤脱氧核苷酸(A) 鸟嘌呤脱氧核苷酸(G) 胞嘧啶脱氧核苷酸(C) 胸腺嘧啶脱氧核苷酸(T)
主要途径： 限制性内切核酸酶酶切法 PCR扩增法 化学合成法
2.2.2 获得DNA片段的主要途径
2.2.2.1 限制性内切核酸酶和DNA片段化 限制性内切核酸酶(restriction endonuclease) 功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列, 并在合适的 反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有 3´OH和5´P的DNA片段。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。 切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。
这些酶的普遍缺点： 热稳定性差，DNA热变性后即被灭活。
Taq酶
来自水生嗜热菌Thermus aquaticus YT-1，该菌是 1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得 到。生长在70～75℃极富矿物质的环境中。
Taq聚合酶的特点及浓度：
具有良好的热稳定性。在70～75℃时生物学活性最 高；92.5℃时半衰期为130 min。
人类DNA的长度相当于3200公里
2 nm
11 nm
30 nm
DNA双螺旋短区域 染色质节段
由紧密包装的核小体组 成的30nm的染色质纤维
染色体节段的一部分 中期染色体的凝缩节段
染色体
300 nm
700 nm
1400 nm
基因工程及应用PPT课件
（2）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（3）将杂化载体 （环状的DNA）引入宿主细胞（受体细胞），使目的基因及载体上 其它基因得以转录和翻译。
例题解析
1、 农业上大量使用化肥存在许多负面影响，“生物固氮”已 成为一项重要研究课题，实验证明，生物固氮是某些微生物（如 根瘤菌、蓝藻等）将空气中的N2固定为NH3的过程。
一个是有些甚至相当多疾病无法治疗 ，这就 是中西 医学结 合的缘 由。然 而，由 于二者 是两套 理论、 两股道 上跑的 车，（ 高血压 心脏病 糖尿病 ）风马 牛不相 及，从 理论上 讲就没 有结合 的可能 ，只是 形式上 的融合 罢了。 故出现 西医对 治疗不 了的疾 病只好 求助中 医，而 中医则 往往采 用西医 诊断中 医治疗 ，以及 中西治 疗法一 块用的 局面。 （肺血液血小板红血球白血球） 至于循证医学、比较医学、后现代医学 、行为 医学等 所谓“ 医学” ，都称 不上一 门独立 的医学 科学， 关于这 一点在 灵魂医 学有关 章节中 将有相 关点评 。（肿 瘤癌症 胃癌肠 癌肺癌 ）
弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、 禽流感 面前竟 束手无 策，在 糖尿病 、癌症 、心脑 血管疾 病、尿 毒症等 相当多 疾病面 前更是 不得不 求助或 借助中 医治疗 。一个 是疗效 不确实 ，一个 是有些 甚至相 当多疾 病无法 治疗， 这就是 中西医 学结合 的缘由 。然而 ，由于 二者是 两套理 论、两 股道上 跑的车 （肺血 液血小 板红血 球白血 球）， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。（ 肺炎青 霉素肝 炎）
西医学是最近三四百年来建立在解剖 学、生 物学及 现代科 学技术 基础上 、（高 血压心 脏病糖 尿病） 发展起 来的一 门以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 、新兴 的现代 医学科 学理论 体系。 主要采 用科学 实验方 法，（ 传染病 丙肝乙 肝甲肝 ）从宏 观到微 观，直 至目前 的分子 基因层 次水平 ，发展 极为迅 速，超 过其它 任何一 门医学 科学， 成为世 界医学 史上的 主流。 （肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）
例题解析
1、 农业上大量使用化肥存在许多负面影响，“生物固氮”已 成为一项重要研究课题，实验证明，生物固氮是某些微生物（如 根瘤菌、蓝藻等）将空气中的N2固定为NH3的过程。
一个是有些甚至相当多疾病无法治疗 ，这就 是中西 医学结 合的缘 由。然 而，由 于二者 是两套 理论、 两股道 上跑的 车，（ 高血压 心脏病 糖尿病 ）风马 牛不相 及，从 理论上 讲就没 有结合 的可能 ，只是 形式上 的融合 罢了。 故出现 西医对 治疗不 了的疾 病只好 求助中 医，而 中医则 往往采 用西医 诊断中 医治疗 ，以及 中西治 疗法一 块用的 局面。 （肺血液血小板红血球白血球） 至于循证医学、比较医学、后现代医学 、行为 医学等 所谓“ 医学” ，都称 不上一 门独立 的医学 科学， 关于这 一点在 灵魂医 学有关 章节中 将有相 关点评 。（肿 瘤癌症 胃癌肠 癌肺癌 ）
弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、 禽流感 面前竟 束手无 策，在 糖尿病 、癌症 、心脑 血管疾 病、尿 毒症等 相当多 疾病面 前更是 不得不 求助或 借助中 医治疗 。一个 是疗效 不确实 ，一个 是有些 甚至相 当多疾 病无法 治疗， 这就是 中西医 学结合 的缘由 。然而 ，由于 二者是 两套理 论、两 股道上 跑的车 （肺血 液血小 板红血 球白血 球）， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。（ 肺炎青 霉素肝 炎）
西医学是最近三四百年来建立在解剖 学、生 物学及 现代科 学技术 基础上 、（高 血压心 脏病糖 尿病） 发展起 来的一 门以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 、新兴 的现代 医学科 学理论 体系。 主要采 用科学 实验方 法，（ 传染病 丙肝乙 肝甲肝 ）从宏 观到微 观，直 至目前 的分子 基因层 次水平 ，发展 极为迅 速，超 过其它 任何一 门医学 科学， 成为世 界医学 史上的 主流。 （肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）
基因工程及其应用课件幻灯片
3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒是大肠 杆菌的质粒，其中常 含有抗药基因，如四 环素的标记基因。质 粒的存在与否对宿主 细胞生存没有决定性 作用，但复制只能在 宿主细胞内进行。
练习
1.以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌 落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物
１、基因工程与作物育种
1993年，中国农业科学院的 科学家成功地培育出了抗棉 铃虫的转基因抗虫棉，抗虫 的基因来自苏云金杆菌。苏 云金杆菌形成的伴胞晶体是 一种毒性很强的蛋白质晶体， 能使棉铃虫等鳞翅目害虫瘫 痪致死。科学家将编码这个 蛋白质的基因导入作物，使 作物自身具有抵御虫害的能 力。
要获得目的基因，主要有两条途径：一条是从供 体细胞的DNA中直接分离基因，另一条是人工合 成基因。
2、目的基因与运载体结合
细菌
供体细胞
取出质粒
取出DNA
用限制酶切断DNA
用连接酶连 接目的基因
用与提取目的基因 相同的限制酶切割质粒 使之出现一个切口，将 目的基因插入切口处， 让目的基因的黏性末端 与切口上的黏性末端互 补配对后，在连接酶的 作用下连接形成重组 DNA分子。
培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体
三、基因工程基本步骤
1、获取目的基因
基因工程的第一步，是取得人们所需要的特定基 因，也就是目的基因如抗虫基因，抗病基因、种 子的贮存蛋白基因，以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等都是目的基因。
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒是大肠 杆菌的质粒，其中常 含有抗药基因，如四 环素的标记基因。质 粒的存在与否对宿主 细胞生存没有决定性 作用，但复制只能在 宿主细胞内进行。
练习
1.以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌 落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物
１、基因工程与作物育种
1993年，中国农业科学院的 科学家成功地培育出了抗棉 铃虫的转基因抗虫棉，抗虫 的基因来自苏云金杆菌。苏 云金杆菌形成的伴胞晶体是 一种毒性很强的蛋白质晶体， 能使棉铃虫等鳞翅目害虫瘫 痪致死。科学家将编码这个 蛋白质的基因导入作物，使 作物自身具有抵御虫害的能 力。
要获得目的基因，主要有两条途径：一条是从供 体细胞的DNA中直接分离基因，另一条是人工合 成基因。
2、目的基因与运载体结合
细菌
供体细胞
取出质粒
取出DNA
用限制酶切断DNA
用连接酶连 接目的基因
用与提取目的基因 相同的限制酶切割质粒 使之出现一个切口，将 目的基因插入切口处， 让目的基因的黏性末端 与切口上的黏性末端互 补配对后，在连接酶的 作用下连接形成重组 DNA分子。
培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体
三、基因工程基本步骤
1、获取目的基因
基因工程的第一步，是取得人们所需要的特定基 因，也就是目的基因如抗虫基因，抗病基因、种 子的贮存蛋白基因，以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等都是目的基因。
酵母菌优秀PPT课件-优秀PPT文档
佛山市高明 鸿鹰食品有
限公司
产品名称 瓜子仁
荣华花生
开心果
商 标
规格
吉 昌
散装
散装
旭 明
散装
生产 日期 200604-07
200603-24
200604-10
主要不合格 项目 酵母
酵母
霉菌
28
4. 酱油、醋
酵母和霉菌嗜好酸性反应，因而能使醋 发生霉变。含一定盐分的食品，对一般细菌 生长是不利的，但酵母对盐则有抵抗性，而 且能够生长，所以酱油也会受到侵犯。
二是微生物指标不合格。微生物指标不合格主要是 霉菌、酵母超标。抽查中有个别产品微生物指标不 合格。其中有1种产品的酵母实测值为480cfu/g，是 标准规定值的近20倍
三是产品标签标注不规范。
27
烘炒食品产品质量国家监督抽查部分 质量较差的产品及其企业名单
企业名称
广州番禺区 越秀食品厂
广州市番禺 钟村荣华 食品厂
14
酵母菌的危害：
➢少数耐高渗的酵母菌和鲁氏酵母、蜂蜜酵母可 使蜂蜜和果酱等败坏； ➢有的酵母菌是发酵工业的污染菌，影响发酵的 产量和质量； ➢某些酵母菌会引起人和植物的病害，例如白假 丝酵母可引起皮肤、粘膜、呼吸道、消化道等多 种疾病.
15
四、食品中常见的酵母属
（一）酵母属 酵母中最重要、应用最广泛的一类： 1.酒类的酿造、面包发酵 2.引起高糖食品（果酱等）变质 3.能抵抗高浓度食盐溶液
30
作业题
1. 酵母菌的特征 2. 什么是冷链？
31
3
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
细菌菌落
4
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
红酵母菌落
限公司
产品名称 瓜子仁
荣华花生
开心果
商 标
规格
吉 昌
散装
散装
旭 明
散装
生产 日期 200604-07
200603-24
200604-10
主要不合格 项目 酵母
酵母
霉菌
28
4. 酱油、醋
酵母和霉菌嗜好酸性反应，因而能使醋 发生霉变。含一定盐分的食品，对一般细菌 生长是不利的，但酵母对盐则有抵抗性，而 且能够生长，所以酱油也会受到侵犯。
二是微生物指标不合格。微生物指标不合格主要是 霉菌、酵母超标。抽查中有个别产品微生物指标不 合格。其中有1种产品的酵母实测值为480cfu/g，是 标准规定值的近20倍
三是产品标签标注不规范。
27
烘炒食品产品质量国家监督抽查部分 质量较差的产品及其企业名单
企业名称
广州番禺区 越秀食品厂
广州市番禺 钟村荣华 食品厂
14
酵母菌的危害：
➢少数耐高渗的酵母菌和鲁氏酵母、蜂蜜酵母可 使蜂蜜和果酱等败坏； ➢有的酵母菌是发酵工业的污染菌，影响发酵的 产量和质量； ➢某些酵母菌会引起人和植物的病害，例如白假 丝酵母可引起皮肤、粘膜、呼吸道、消化道等多 种疾病.
15
四、食品中常见的酵母属
（一）酵母属 酵母中最重要、应用最广泛的一类： 1.酒类的酿造、面包发酵 2.引起高糖食品（果酱等）变质 3.能抵抗高浓度食盐溶液
30
作业题
1. 酵母菌的特征 2. 什么是冷链？
31
3
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
细菌菌落
4
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
红酵母菌落
《酵母基因工程》课件
药物
利用酵母细胞生产某些药物的活性成分或中间体，可降低生产成本和提高产量。
改良农作物和食品品质
农作物改良
通过基因工程技术将优良性状基因转入酵母细胞，再将其返回植物细胞，实现农作物的 遗传改良，提高产量和抗逆性。
食品品质
通过酵母基因工程改良食品加工过程中的菌种，提高食品的口感、营养价值和安全性。
基因治疗和基因组编辑
基因治疗
利用酵母基因工程技术将正常基因转入 病变细胞，替代或修复缺陷基因，从而 达到治疗遗传性疾病和恶性肿瘤的目的 。
VS
基因组编辑
通过酵母基因工程技术实现精准的基因组 编辑，如CRISPR-Cas9系统，可对人类 、动物和植物的基因进行精确的敲除、插 入和突变等操作，为遗传疾病治疗、农作 物改良等领域提供有力工具。
04
CATALOGUE
酵母基因工程面临的挑战和解决方案
基因表达调控的复杂性
总结词
酵母基因表达调控涉及多个层面，包括转录 、转录后和翻译后调控，具有高度复杂性。
详细描述
酵母基因表达调控涉及转录因子、顺式元件 和反式元件之间的相互作用，以及mRNA的 稳定性、翻译效率和蛋白修饰等。这些因素 共同决定了基因的表达水平和细胞命运。
02
CATALOGUE
酵母基因工程的工具和技术
基因克隆和鉴定技术 样本中分离出来，获得其DNA序 列的过程。
基因鉴定
利用分子生物学技术，如测序、 基因表达谱分析等，对克隆得到 的基因进行功能、结构和表达特 征的鉴定。
酵母转化技术
药物。
基因治疗
利用酵母作为载体，将 外源基因导入人体细胞 内，治疗遗传性疾病和
癌症。
生物能源
通过基因工程手段改良 酵母，提高其生物燃料
利用酵母细胞生产某些药物的活性成分或中间体，可降低生产成本和提高产量。
改良农作物和食品品质
农作物改良
通过基因工程技术将优良性状基因转入酵母细胞，再将其返回植物细胞，实现农作物的 遗传改良，提高产量和抗逆性。
食品品质
通过酵母基因工程改良食品加工过程中的菌种，提高食品的口感、营养价值和安全性。
基因治疗和基因组编辑
基因治疗
利用酵母基因工程技术将正常基因转入 病变细胞，替代或修复缺陷基因，从而 达到治疗遗传性疾病和恶性肿瘤的目的 。
VS
基因组编辑
通过酵母基因工程技术实现精准的基因组 编辑，如CRISPR-Cas9系统，可对人类 、动物和植物的基因进行精确的敲除、插 入和突变等操作，为遗传疾病治疗、农作 物改良等领域提供有力工具。
04
CATALOGUE
酵母基因工程面临的挑战和解决方案
基因表达调控的复杂性
总结词
酵母基因表达调控涉及多个层面，包括转录 、转录后和翻译后调控，具有高度复杂性。
详细描述
酵母基因表达调控涉及转录因子、顺式元件 和反式元件之间的相互作用，以及mRNA的 稳定性、翻译效率和蛋白修饰等。这些因素 共同决定了基因的表达水平和细胞命运。
02
CATALOGUE
酵母基因工程的工具和技术
基因克隆和鉴定技术 样本中分离出来，获得其DNA序 列的过程。
基因鉴定
利用分子生物学技术，如测序、 基因表达谱分析等，对克隆得到 的基因进行功能、结构和表达特 征的鉴定。
酵母转化技术
药物。
基因治疗
利用酵母作为载体，将 外源基因导入人体细胞 内，治疗遗传性疾病和
癌症。
生物能源
通过基因工程手段改良 酵母，提高其生物燃料
酵母遗传课件
ARS若克隆到质粒中，可使质粒DNA在酵母中自主复制。 1）ARS的结构
A：ACS在所有的ARS都完全相同或相似 ARS B：ACS的3’末端
C：ACS的5’末端，富含AT，C之间无同源性，无共有序列
酵母遗传
6
（2）ARS-结合蛋白：可能起始酿酒酵母的复制。
起始识别复合物（ORC）：与A、B区结合，可能使复 制起始蛋白。Abf1p与蛋白结合可提高复制效率。
特点： 1)大多数mtDNA（线粒 体DNA）中无重复核苷酸 序列—重要特点 2)半自主性
图7－7
酵母遗传
9
第三节 酵母菌中的质粒
• 1. 2μm质粒：双链、环状DNA、50－100个拷贝，不 赋予宿主细胞遗传表型，属于隐蔽质粒。
• 最显著的特点：两个反向重复顺序（IR ），其上有 FRT（专一性重组位点），它们被一个较大的单一区 （约2.7kb）和一个较小的单一区（约2.3kb）隔开。 FRT重组产生两种构型的质粒，即A型和B型。
32
（2）接合型转换机理
• 转换过程中受体位点（ MAT ）被转变成供体型的序列（ HML 和 HMR ）。 MAT 的突变可阻止交配型转换鉴别出转换所需的位点。 通过 HML 或 HMR 中的缺失突变发现了这个转变过程具有单向性 的特点。
酵母遗传
33
酵母遗传
34
第六节 酵母菌的载体系统
• 1. 克隆载体 • （1）酵母整合型载体 • （2）酵母附加体质粒载体（YEp)
质外壳包裹着的粒子状态存在于细胞之中，不具有
体外侵染的特性。也称为类病毒颗粒（virus-like
particle）.
分类：L-dsRNA:编码自身和M型的蛋白外壳和RNA聚合
酶
A：ACS在所有的ARS都完全相同或相似 ARS B：ACS的3’末端
C：ACS的5’末端，富含AT，C之间无同源性，无共有序列
酵母遗传
6
（2）ARS-结合蛋白：可能起始酿酒酵母的复制。
起始识别复合物（ORC）：与A、B区结合，可能使复 制起始蛋白。Abf1p与蛋白结合可提高复制效率。
特点： 1)大多数mtDNA（线粒 体DNA）中无重复核苷酸 序列—重要特点 2)半自主性
图7－7
酵母遗传
9
第三节 酵母菌中的质粒
• 1. 2μm质粒：双链、环状DNA、50－100个拷贝，不 赋予宿主细胞遗传表型，属于隐蔽质粒。
• 最显著的特点：两个反向重复顺序（IR ），其上有 FRT（专一性重组位点），它们被一个较大的单一区 （约2.7kb）和一个较小的单一区（约2.3kb）隔开。 FRT重组产生两种构型的质粒，即A型和B型。
32
（2）接合型转换机理
• 转换过程中受体位点（ MAT ）被转变成供体型的序列（ HML 和 HMR ）。 MAT 的突变可阻止交配型转换鉴别出转换所需的位点。 通过 HML 或 HMR 中的缺失突变发现了这个转变过程具有单向性 的特点。
酵母遗传
33
酵母遗传
34
第六节 酵母菌的载体系统
• 1. 克隆载体 • （1）酵母整合型载体 • （2）酵母附加体质粒载体（YEp)
质外壳包裹着的粒子状态存在于细胞之中，不具有
体外侵染的特性。也称为类病毒颗粒（virus-like
particle）.
分类：L-dsRNA:编码自身和M型的蛋白外壳和RNA聚合
酶
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主要内容
第一节 酵母基因工程表达体系 酵母基因表达宿主系统 酵母菌表达载体 酵母菌的转化系统
第二节 常见的酵母基因表达系统 第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 酵母基因工程应用举例
第一节 酵母基因表达体系——宿主 系统
• 酵母菌（Yeast）是一群 以芽殖或裂殖方式进行 无性繁殖的单细胞真核 生物，分属于子囊菌纲、 担子菌纲、半知菌类， 共由56个属和500多个 种组成。
酵母表达载体
• 酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵 母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体 （shuttle vector）。
• 酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序 列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可 以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性 基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖 和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要 是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列) 或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)， 以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
酵母菌表达宿主系统
酿酒酵母的缺点： ① 发酵时会产生乙醇，难以进行高密度发酵，直接导致外
源基因很难达到很高的水平 ② 缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌的蛋白质能力
较差 ③ 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往
往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞 紧密结合，而不能大量分泌 ④ 表达菌株传代不稳定，表达质粒易丢失 ⑤ 分泌效率低，大于30KD的蛋白质几乎不分泌
酵母表达载体
1．酵母载体的基本结构 •DNA复制起始区：通常来自于2μ质粒的复制起始区及酵母 基因组的自主复制序列 •筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选 •整合介导区:能有效介导载体与宿主之间发生同源重组 •有丝分裂稳定区 •表达盒：启动子，分泌信号序列，终止子
酵母表达载体
酿酒酵母中的2μ环状质粒 •环状质粒，拷贝数达50至100 个。 •IRs反向重复序列，600bp •FLP编码产物驱动IRs的同源重 组 •REP编码产物控制质粒的稳定 性 •STB REP的结合位点 •接合酵母属中的pSR1和pSB1， 以及克鲁维酵母属中的pKD1 等均与2μ质粒类似。
• 酵母菌是比较成熟的真 核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本 要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。
酵母菌表达宿主系统
（1）酿酒酵母 优点： ① 酿酒酵母长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安
全性好，已被FDA认定为安全性生物，其表达产物不需 经过大量宿主安全性实验 ② 生长迅速，工艺简单，成本低 ③ 是真核生物，可以对蛋白进行翻译后加工 ④ 表达产物可分泌表达，易于纯化 ⑤ 遗传背景清楚，易进行操作
酵母菌表达宿主系统
（2）乳酸克鲁维酵母表达系统 •可以高密度发酵，不需要甲醇防爆装置，工业化生产时不降 低生产率及酵母菌的再繁殖能力。
•乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异 源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条 件下，也能稳定遗传40代以上。
•乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均 优于酿酒酵母表达系统。
酵母表达载体
2．酵母载体的种类 • 酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类
• 酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分 为下列五类：
① 酵母整合型质粒YIp ② 酵母附加体质粒YEp ③ 酵母复制型质粒YRp ④ 酵母着丝粒质粒YCp ⑤ 酵母人工染色体YAC
酵母表达载体
（1）酵母整合型质粒YIp：缺乏酵 母的复制起始位点，不能在酵母中自 主复制，含有酵母的筛选标记ura3基 因。具有整合介导区，所以，它只有 整合到酵母染色体中才能稳定。
（3）酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区 (ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其 转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个。 •ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。 •以ARS为复制子的质粒称为YRp，以2μ质粒上的复制元件为复制子的 质粒称为YEp •上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后， 质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌表达宿主系统
（3） 产朊假丝酵母 •食品及药品工业的安全生物 •不具有酵解抑制有氧氧化效应，因而在严格好气的条件下不 会产生乙醇 •发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可以达到92g/L •在廉价的糖蜜中就能生产，成本低
酵母菌表达宿主系统
（4）栗酒裂殖酵母 裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，是一类不能出芽生殖而 只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母。 与其他酵母相比，它具有更多的与高等真核生物相似的特性： 线粒体结构，启动子结构，转录机制，对蛋白N-端乙酰化功 能均更接近于哺乳动物细胞。
已有多种蛋白利用此系统进行了表达，如人蛋白凝血因子 VIII a，人白细胞介素IL-6等。
酵母菌表达宿主系统
（5）巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生长， 甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。
表达系统优势： •生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表 达。 •由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源 基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因的高 效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20 余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
•含有酵母菌染色体DNA同源序列的 YIp质粒的构建 •在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色 体DNA特定序列和标记基因，构建 出来的质粒称为YIp。目的基因表达 盒通常插在染色体DNA特定序列中， 这样目的基因就能高效整合入酵母菌
酵母表达载体
（2）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2μ质粒DNA复制有关的序 列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高。
第一节 酵母基因工程表达体系 酵母基因表达宿主系统 酵母菌表达载体 酵母菌的转化系统
第二节 常见的酵母基因表达系统 第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 酵母基因工程应用举例
第一节 酵母基因表达体系——宿主 系统
• 酵母菌（Yeast）是一群 以芽殖或裂殖方式进行 无性繁殖的单细胞真核 生物，分属于子囊菌纲、 担子菌纲、半知菌类， 共由56个属和500多个 种组成。
酵母表达载体
• 酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵 母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体 （shuttle vector）。
• 酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序 列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可 以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性 基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖 和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要 是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列) 或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)， 以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
酵母菌表达宿主系统
酿酒酵母的缺点： ① 发酵时会产生乙醇，难以进行高密度发酵，直接导致外
源基因很难达到很高的水平 ② 缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌的蛋白质能力
较差 ③ 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往
往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞 紧密结合，而不能大量分泌 ④ 表达菌株传代不稳定，表达质粒易丢失 ⑤ 分泌效率低，大于30KD的蛋白质几乎不分泌
酵母表达载体
1．酵母载体的基本结构 •DNA复制起始区：通常来自于2μ质粒的复制起始区及酵母 基因组的自主复制序列 •筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选 •整合介导区:能有效介导载体与宿主之间发生同源重组 •有丝分裂稳定区 •表达盒：启动子，分泌信号序列，终止子
酵母表达载体
酿酒酵母中的2μ环状质粒 •环状质粒，拷贝数达50至100 个。 •IRs反向重复序列，600bp •FLP编码产物驱动IRs的同源重 组 •REP编码产物控制质粒的稳定 性 •STB REP的结合位点 •接合酵母属中的pSR1和pSB1， 以及克鲁维酵母属中的pKD1 等均与2μ质粒类似。
• 酵母菌是比较成熟的真 核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本 要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。
酵母菌表达宿主系统
（1）酿酒酵母 优点： ① 酿酒酵母长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安
全性好，已被FDA认定为安全性生物，其表达产物不需 经过大量宿主安全性实验 ② 生长迅速，工艺简单，成本低 ③ 是真核生物，可以对蛋白进行翻译后加工 ④ 表达产物可分泌表达，易于纯化 ⑤ 遗传背景清楚，易进行操作
酵母菌表达宿主系统
（2）乳酸克鲁维酵母表达系统 •可以高密度发酵，不需要甲醇防爆装置，工业化生产时不降 低生产率及酵母菌的再繁殖能力。
•乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异 源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条 件下，也能稳定遗传40代以上。
•乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均 优于酿酒酵母表达系统。
酵母表达载体
2．酵母载体的种类 • 酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类
• 酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分 为下列五类：
① 酵母整合型质粒YIp ② 酵母附加体质粒YEp ③ 酵母复制型质粒YRp ④ 酵母着丝粒质粒YCp ⑤ 酵母人工染色体YAC
酵母表达载体
（1）酵母整合型质粒YIp：缺乏酵 母的复制起始位点，不能在酵母中自 主复制，含有酵母的筛选标记ura3基 因。具有整合介导区，所以，它只有 整合到酵母染色体中才能稳定。
（3）酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区 (ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其 转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个。 •ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。 •以ARS为复制子的质粒称为YRp，以2μ质粒上的复制元件为复制子的 质粒称为YEp •上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后， 质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌表达宿主系统
（3） 产朊假丝酵母 •食品及药品工业的安全生物 •不具有酵解抑制有氧氧化效应，因而在严格好气的条件下不 会产生乙醇 •发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可以达到92g/L •在廉价的糖蜜中就能生产，成本低
酵母菌表达宿主系统
（4）栗酒裂殖酵母 裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，是一类不能出芽生殖而 只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母。 与其他酵母相比，它具有更多的与高等真核生物相似的特性： 线粒体结构，启动子结构，转录机制，对蛋白N-端乙酰化功 能均更接近于哺乳动物细胞。
已有多种蛋白利用此系统进行了表达，如人蛋白凝血因子 VIII a，人白细胞介素IL-6等。
酵母菌表达宿主系统
（5）巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生长， 甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。
表达系统优势： •生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表 达。 •由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源 基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因的高 效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20 余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
•含有酵母菌染色体DNA同源序列的 YIp质粒的构建 •在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色 体DNA特定序列和标记基因，构建 出来的质粒称为YIp。目的基因表达 盒通常插在染色体DNA特定序列中， 这样目的基因就能高效整合入酵母菌
酵母表达载体
（2）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2μ质粒DNA复制有关的序 列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高。