2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明

中国药品标准 2008年第 9卷第 1期 46
种比例的乙腈-甲醇-水为流动相, 结果均基本相同, 淫羊藿苷色谱峰和淫羊藿定 C 色谱峰完全重叠, 色 谱参数无显著的改变, 一般情况, 除峰宽较宽外, 对 称性 (拖尾因子 ) 、理论板数等系统适用性参数均较 好。另一方面, 紫外扫描结果表明, 淫羊霍苷和淫羊 霍足 C 的紫外吸收光谱基本一致, 这必然影响使用 二极管阵列检测器鉴别色谱峰纯度的准确性。这些 可能都是导致人们稍有不慎即不能发现淫羊藿苷色 谱峰和淫羊藿定 C 色谱峰完全重叠问题的原因所 在。
文献标识码: A
文章 编号: 1009- 3656( 2008) - 1- 46- 4
Analysis on Problem s of V alidation Test for S terility Test, M icrob ial lim itD eterm ination and Bacterial Endotoxins Test
[ 6] 洪怡, 肖卫红, 卢全德. 高效液相色谱法测定 肾康胶囊中淫羊 藿苷的含量. 中国医院药学杂志, 2006, 26 ( 4) : 495-4951
[ 7] 赵大成. 高效液 相色 谱法 测定 强阳保 肾丸 中淫 羊藿 苷的含 量. 医药导报, 2006, 25( 2 ) : 150-1511
目前无菌用过滤膜有普通膜、有机膜、低吸附膜 等, 有的申报单位对供试品及其溶剂的特性不加考 虑选择滤器, 造成滤膜被破坏, 实验失败。应根据供 试品及其溶剂的特性不同选择不同材质的滤膜, 保 证滤膜在过滤前后的完整性。试验时采用全封闭过 滤器要注意观察膜的状态。某些油性供试品或采用 蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。 2 微生物限度检查方法学验证问题及分析 211 验证菌株不完整 21111 微生物限度检查中细菌、霉菌和酵母菌的计 数方法的验证, 应该采用 5种试验菌, 有些申报单位 只对部分试验菌进行方法验证, 常见的是缺少对黑 曲霉菌的验证。 21112 中国药典 2005年版对控制菌增加了大肠菌 群检查和梭菌检查, 在对控制菌进行检查方法验证 时, 有些申报单位往往忽视了对上述内容的验证。 212 方法选择不正确 21211 不同的样品套用同一检验方法, 有些申报单 位为了使验证资料在审核时一次通过, 把所有品种 ( 无论有无抑菌活性 ) 均用薄膜过滤法处理, 甚至每 个品种的冲洗量都定为 1 000 mL, 既增加了实验过 程的复杂性、造成浪费, 又易于造成微生物生物活性 的破坏, 影响试验结果。不同的供试品、不同的验证 菌应通过验证找出适宜的检查方法, 按照由简到繁 的原则进行试验。 21212 不同的菌株套用同一检验方法。有些申报 单位在对不同的验证菌株进行试验时, 无论用常规 法回收率是否能达到 70% 以上, 均采用较复杂的方 法进行前处理, 增加了实验过程的复杂性。应对每 个验证菌进行分别的试验, 考察药品本身的抑菌特 性。 21213 方法描述不够详细, 没有可操作性, 如某药 品验证资料 / 将规 定量的 供试品 按薄膜 过滤 法过 滤, 冲洗, 在 最后一次冲洗液 中加入小于 100 CFU 的试验菌, 过滤。取出滤膜接种至 ,,中, 或将培养 基加至滤筒中 0。缺少供 试液配制、浓度、冲洗 液、
准确、可靠及检验方法的完整性。它在保证检验方 法的科学性和检验结果的准确性方面大大缩短了中 国药典与国外药典的差距, 是促使我国药品此类检 查方法更加合理、科学和严谨的重要途径, 同时也是
作者简介: 国明, 女, 副主任药师。学科及研究方向: 药检管理。联系电话: 0531- 81216529。
D rug Standards o f C hina 2008, vo l19 N o11
Guo M ing, Zhu Q ing- fen, Zheng L -i zhen( Shandong In stitu te for Drug C on trol, Jinan 250012)
各国药典中无菌、微生物限度和细菌内毒素检 查作为药品安全性控制的重要检测项目方法已日臻 完善, 但对此类检查开展方法学验证是 2005年版中 国药典新增内容, 验证的意义在于保证检验结果的
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参考文献
[ 1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 北京: 化学工业出版 社, 2005 年版一部: 229( 羊藿 )、445( 壮骨伸筋胶囊 ) 、453( 安 神补脑液 ) 、470( 抗骨增生胶囊 ) 、501 ( 乳疾灵颗 ) 、574( 益气 养血口服液 )1
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
[ 2] 国家药品监督管理 局. 国家中 成药标 准汇编, 中成药 地方标 准上升 国家标 准部 分, 2002 年, 骨 伤科分 册: 278 ( 藤 黄健骨 丸 ) 、369( 仙灵骨葆 胶 囊 ) 、373 ( 仙 灵 骨葆 片 ) ; 内 科肾 系分 册: 321 (参茸强肾片 ) 1
[ 3] 中华人民共和国卫 生部药品 标准. 中 成药成 方制剂, 第十八 册: 71 ( 古汉养生精 ) 1
同样, 当以乙腈-水系统为流动相时, 无论其中 不含或含微量醋酸或磷酸、三乙胺, 或者应用它们的 梯度洗脱, 结果均基本相同, 色谱参数无明显改善。 313 根据我们的不完全统计, 在国家药品标准中, 多数品种以乙腈-水系统为流动相测定淫羊藿苷含 量 [ 1] , 但除壮骨伸筋胶囊 [ 1] 和藤黄健骨丸 [ 2] 外, 还 有仙灵骨葆胶囊 [ 2] 、仙灵骨葆片 [ 2 ] 、参茸强肾片 [ 2 ] 、 古汉养生精 [ 3] 等是以甲醇-水系统作为流动相测定 淫羊藿苷含量, 为严格控制产品质量, 建议修订所有 相关品种的含量测定方法。同时, 以甲醇-水系统作 为流动相测定药品制剂中淫羊藿苷含量的文献报道 还较多 [ 4-11 ] , 我们的研究结果提示, 在研究建立某一 指标的含量测定方法时, 应进行充分的方法学验证, 保证方法的专属性、准确性。
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冲洗量及冲洗次数等重要试验信息, 无法确定其检 验方法。 213 供试液制备混乱
常见到有的申报单位试验时供试液稀释级别选 择错误, 甚至有的固体供 试品选用 10b浓度。 2005 年版药典要求验证过程中的供试液, 应取样品的最 低稀释级, 除原液外, 一般指 10- 1的稀释级别 ( 特殊 情况除外 ), 有 的申请单位误解了最低稀释级的含 义, 常将供试品配制成 10- 2、10- 3的浓度。 214 试验次数不足
有的申请单位验证过程仅提供了 1次试验的数 据, 或者将同一供试品溶液同时分别作 3份平行, 作 为 3次试验, 对于菌液组也仅提供了 1次试验的数 据, 无法保证验证试验的完整性。计数验证应进行 3次独立平行试验, 要求分别取样 3次, 菌液组也应 独立进行 3次平行试验, 并在 3次平行试验基础上 应分别计算每次试验菌的回收率, 分别对每次试验 结果进行判断。 215 对照组设置或操作错误 21511 微生物限度检查计数方法常见验证时缺少 稀释剂对照。某些供试品需要采取适当方法消除或 抑制供试品中抗菌活性, 在对供试液进行特殊处理 时, 既要考察供试品的抑菌活性, 又要考察供试液制 备过程中微生物受影响的程度, 因此要求增加稀释 剂对照组以判断供试液制备过程中是否对微生物造 成破坏。有的申报单位对供试液采取了消除抑菌作 用的特殊处理方法, 但未用稀释剂对照组进行对照, 使验证试验失去科学性及准确性。有的则在用常规 法进行检测时增加了稀释剂对照, 使试验过程复杂 化。 21512 稀释剂对照组实验方法与试验组不一致, 进 行稀释剂对照组的试验时, 有的单位采用稀释剂加 菌液注皿的常规培养方法。稀释剂对照组应与试验 组的处理方法一致, 如采用薄膜过滤法, 就应用相应 稀释液替代供试品, 加入试验菌, 按照试验组的供试 液制备方法, 薄膜过滤、冲洗, 培养。需要注意保持 冲洗量和冲洗方法与试验组供试液的方法一致。 21513 控制菌验证中阴性对照菌的问题, 有的阴性 对照菌的验证方法按照阴性对照菌的自身检查方法 进行, 失去了设置阴性对照组的意义。设立阴性对 照组, 是为了验证该控制菌检查方法的专属性, 阴性 对照组的增菌培养、检查等应与验证菌一致。如验 证沙门菌检查法时的阴性对照菌用 金黄色葡萄球 菌, 其增菌及检查过程应与沙门菌的一致。