蛋白酶活力测定分析
蛋白酶活力测定实验报告
蛋白酶活力测定实验报告
实验目的：
通过测定蛋白酶的活力，了解其功能和活性。
实验原理：
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，可以将蛋白质分解为多肽和氨基酸。
蛋白酶活力是指单位时间内酶水解蛋白质的能力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
本实验使用的方法是酶促反应测定法。
首先，将待测蛋白酶与底物混合，反应一定时间后，停止反应并添加淀粉溶液产生反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定反应产物。
实验步骤：
1. 预备试剂：制备蛋白酶和底物的工作液，制备淀粉溶液和反应终止剂，制备碘化钾溶液。
2. 实验装置：准备滴定装置和试管架。
3. 设置实验条件：保持温度恒定，控制pH值。
4. 实验操作：在试管中加入待测蛋白酶和底物工作液，反应一定时间后，加入淀粉溶液和反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定。
5. 记录数据：记录滴定所需碘化钾的体积，计算出酶活力。
实验结果：
根据实验数据，计算出蛋白酶的活力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
实验讨论：
分析实验结果，比较不同条件下蛋白酶的活力差异，并讨论影响蛋白酶活力的因素。
实验结论：
通过分析实验结果，得出结论，总结蛋白酶活力与其他因素之间的关系，并提出可能的应用前景。
实验总结：
总结实验过程，评价实验结果及数据，提出改进意见，并对今后可能的研究方向进行展望。
参考文献：
列出所参考的文献。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
蛋白酶活力的测定
1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。
1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。
简述蛋白酶活力测定的原理
简述蛋白酶活力测定的原理蛋白酶活力测定是一种用于评估酶分解蛋白质的能力的方法。
蛋白质是生命活动不可或缺的重要分子，然而，它们需要在体内被分解为较小的分子才能被利用。
其中，蛋白酶是一种特殊的酶，它能够将蛋白质分解为较小的肽链或氨基酸。
蛋白酶活力测定的原理主要基于蛋白质分解后的产物——氨基酸的检测。
在这个测定中，蛋白质被蛋白酶分解为氨基酸，然后这些氨基酸与一些特定的化学物质反应，产生一种有颜色的产物，这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。
通过测量溶液的吸光度，可以定量地测定蛋白酶的活力。
具体来说，测定蛋白酶活力的步骤如下：1.准备测试样品：将待测的蛋白酶与适当底物（即待分解的蛋白质）混合，置于适宜的反应条件下。
2.设定反应时间：在一定时间内，蛋白酶将底物分解为氨基酸。
为了确保反应在最佳条件下进行，需要设定一个适当的反应时间。
3.终止反应：在反应达到设定时间后，需要终止酶促反应，以便停止蛋白质的分解。
通常使用一种称为终止液的化学物质来实现这一步骤。
4.显色反应：终止液中的化学物质将与氨基酸反应，生成一种有颜色的产物。
这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。
5.吸光度测量：使用分光光度计测量溶液的吸光度。
吸光度的大小与溶液中氨基酸的浓度成正比，因此可以用来计算蛋白酶的活力。
通过这种测定方法，可以评估不同样品中蛋白酶的相对活力，并了解在不同条件下的酶促反应动力学。
这对于研究蛋白质分解过程、优化蛋白质分解反应的条件以及生物工程等领域都具有重要意义。
此外，蛋白酶活力测定也可以用于诊断和治疗某些与蛋白质分解相关的疾病，如胰腺炎等。
总之，蛋白酶活力测定的原理是基于蛋白质分解后的氨基酸形成染料，通过测量溶液的吸光度来定量测定蛋白酶活力。
这种方法在生物学、生物工程和医学等领域具有广泛的应用价值。
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。
酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。
1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。
1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
蛋白酶活性检验方法
蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。
2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。
2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
蛋白酶比活力实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白酶比活力的概念及测定方法。
2. 掌握利用比色法测定蛋白酶比活力的原理和操作步骤。
3. 通过实验，了解蛋白酶在不同条件下的活性变化，为实际应用提供参考。
二、实验原理蛋白酶比活力是指单位质量的蛋白质所具有的酶活性。
在实验中，通过测定蛋白酶在一定条件下对底物（如酪蛋白）的水解程度，可以计算出蛋白酶的比活力。
本实验采用比色法，通过测定底物水解产生的产物（如酪氨酸）的吸光度变化，间接反映蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白酶样品- 酪蛋白- 0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液- 0.1mol/L Folin-酚试剂- 0.4mol/L三氯乙酸- 0.05mol/L氢氧化钠溶液- 2.5mol/L硼砂缓冲溶液（pH10.5）- 680nm比色计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 移液器- 电子天平- 恒温水浴锅- 10mL具塞试管- 50mL容量瓶- 试管架四、实验步骤1. 准备实验试剂：- 配制0.1mol/L Folin-酚试剂：将钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、硫酸锂、液溴等试剂按比例混合，微火回流加热10小时，加入碳酸钠和蒸馏水，定容至1000mL。
- 配制0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
- 配制0.05mol/L氢氧化钠溶液：按GB601配制。
- 配制2.5mol/L硼砂缓冲溶液（pH10.5）：称取硼酸钠19.08g，加水溶解并定容至1000mL，称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL，取甲液500mL乙液400mL混合，用水稀释至1000mL。
2. 实验操作：- 将酪蛋白溶解于0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中，配制成2%酪蛋白溶液。
- 将蛋白酶样品用0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至适宜浓度。
- 取10mL具塞试管，加入2%酪蛋白溶液1mL，然后加入蛋白酶溶液1mL，置于37℃恒温水浴锅中反应30分钟。
蛋白酶比活力实验报告
蛋白酶比活力实验报告蛋白酶比活力实验报告引言：蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，广泛存在于生物体内。
通过测定蛋白酶的比活力，可以评估其催化反应的速率和效率。
本实验旨在通过比较不同条件下蛋白酶的活力，探究影响蛋白酶活性的因素。
实验方法：1. 实验材料准备：- 蛋白酶溶液：从动物组织中提取的蛋白酶溶液，浓度为10 mg/mL。
- 底物溶液：使用明胶作为蛋白酶的底物，浓度为1%。
- 缓冲液：pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
- 试管：用于混合反应液的透明试管。
- 恒温水浴：用于控制反应温度的设备。
2. 实验步骤：- 步骤一：在不同温度下测定蛋白酶的活力。
- 将5 mL蛋白酶溶液和5 mL底物溶液混合，并放置于恒温水浴中，分别设置不同温度条件（如25℃、37℃、50℃）。
- 在反应开始后的1分钟、2分钟、3分钟等时间点，取出一定量的反应液，立即停止反应。
- 使用布拉德福法测定反应液中未被水解的底物浓度，计算蛋白酶的比活力。
- 步骤二：在不同pH条件下测定蛋白酶的活力。
- 在不同pH值的缓冲液中，重复上述步骤一的实验操作。
- 测定不同pH条件下蛋白酶的比活力，并比较其差异。
实验结果：1. 温度对蛋白酶活力的影响：- 在25℃、37℃和50℃下进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.05 U/mg、0.1 U/mg和0.02 U/mg。
- 结果显示，蛋白酶的活力随着温度的升高而增加，但当温度过高时（如50℃），蛋白酶的活力反而下降。
2. pH值对蛋白酶活力的影响：- 在pH为7.4、8.0和9.0的缓冲液中进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.08 U/mg、0.06 U/mg和0.04 U/mg。
- 结果显示，蛋白酶的活力在中性条件下（pH 7.4）最高，而在酸性和碱性条件下，蛋白酶的活力均降低。
讨论与结论：通过本实验，我们可以得出以下结论：1. 温度对蛋白酶活力有显著影响，适宜的温度可以提高蛋白酶的催化效率，但过高的温度会导致酶的变性，从而降低活力。
蛋白酶活性的测定方法
结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参 数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行 显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、 操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检 测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、 电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和 实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定 剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性 的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大 化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存 在异常值、缺失值或重 复数据，需要进行数据 清洗，确保数据准确性 和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状 图、折线图或散点图， 可以直观地展示蛋白酶 活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行 适当的数学转换，如对 数转换或归一化处理， 以便更好地分析数据。
蛋白酶提取、活力测定实验总结
发酵实验总结生物技术1002 1610100311 刘小波摘要：1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。
2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。
3、实验结果：实验原理：1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。
2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。
实验材料：玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。
实验方法：蛋白酶的筛选：1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。
蛋白酶酶活力的测定
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社
蛋白酶活力测定
3
在实际应用中，蛋白酶活力测定具有广泛的应用 价值，如食品工业中蛋白质水解、洗涤剂生产中 的酶催化反应等。
研究展望
随着生物技术的不断发展，蛋白酶活力测定技术也在不断改进和完善。未来，可以通过开发 新型的蛋白酶活力测定方法，提高测定灵敏度和特异性，进一步拓展其应用范围。
在研究蛋白酶的底物特异性、抑制剂作用机制等方面，可以结合计算机模拟技术、光谱学技 术等手段，深入探究酶的催化机制和作用机理。
随着蛋白质组学和代谢组学研究的深入，蛋白酶活力测定在生物标志物发现、疾病诊断和治 疗等方面的应用将更加广泛。同时，随着人类对生物大分子结构和功能的认识不断深入，蛋 白酶活力测定在药物设计和发现等领域也将发挥更加重要的作用。
THANKS
感谢观看
数据记录与处理
06 详细记录实验数据，并进行必
要的计算和处理，以得出实验 结论。
实验操作技巧
温度控制
确保酶反应在恒温条件下进行，以减 少温度对酶活力的影响。
02
pH调节
使用适当的缓冲液调节反应液的pH值， 以保证酶活力的稳定。
01
03
避免污染
在整个实验过程中，要严格控制实验 环境，避免样品和试剂受到污染。
对照实验
进行对照实验时，要确保对照组与实 验组条件一致，以消除误差对实验结 果的影响。
05
04
精确测量
在实验过程中，要使用精确的测量工 具和方法，确保实验数据的准确性。
05
结果分析与解读
结果分析
酶活力单位
通过实验数据，计算出蛋白酶的酶活力单位， 以评估酶的催化活性。
酶促反应速率
分析酶促反应速率，了解酶促反应的进程和 快慢。
底物浓度与酶活力的关系
蛋白酶活性检测实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
2. 了解蛋白酶的特性和作用。
3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。
二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。
蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。
2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。
3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。
（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。
（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。
（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。
（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。
（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。
6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。
（2）分析蛋白酶的特性和作用。
五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。
（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。
2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。
（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。
六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
蛋白酶活力的测定
实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。
2、深入了解酶的活力和比活力的概念。
二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。
2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。
3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。
4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。
5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。
三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。
（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。
（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。
以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。
将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。
二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。
三、试剂及仪器1．福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。
使用时用2倍体积的水稀释。
2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。
3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。
4．2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。
5．pH7.2磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。
6．标准酪氨酸溶液：准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。
7．仪器：分光光度计、试管四、操作步骤1．标准曲线绘制编号0 1 2 3 4 5 6 7 80 1 2 3 4 5 6 7 8标准酪氨酸溶液(mL)[100g/mL]水(mL) 10 9 8 7 6 5 4 3 2稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g数，即为K值。
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂1. Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。
蛋白酶活性测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食物与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）一、原理采用可溶性淀粉为底物，在必然的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。
二、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使历时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL滚水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。
实验二十一(10) 蛋白酶活力的测定
实验目的
掌握测定蛋白酶活力的原理和方法
学习酶活力的计算方法
蛋白酶概述
内肽酶 外肽酶 二肽酶
氨肽酶 羧肽酶
蛋 白 酶
中性蛋白酶
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产生
焙烤行业； 啤酒工业； 医药工业； 纺织工业； 皮革工业； 饲料工业；
2. 酶液的制备（已制备）
3. 活力测定 3.1 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴，5 min； 3.2 按照下表操作，进行酶催化反应；
0
待测酶液 0.4 M 三氯乙酸 2% 酪蛋白溶液 0.4 M 三氯乙酸 1 mL 2 mL 1 mL ——
1
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
2
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
40℃恒温水浴锅保温，20 min 测定680 nm处吸光值 酶活力单位定义： 40℃，最适pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的 酶量为1U。 计算公式
4 酶活力= 10 ×K× n×A680
思考题
该方法测定蛋白酶活力的误差来源主要有哪些
5. 1.398中性蛋白酶 (neutral protease) 6. 2% 酪蛋白溶液（casein solution） 7. 标准酪氨酸溶液（100 μg mL-1）
仪器
分光光度计
试管
烧杯 移液管
恒温水浴锅
离心机 漏斗
实验步骤
1. 标准曲线 （已完成） 参考标曲，求出K值,K=94. n=20 000
1.398中性蛋白酶
分子量约43kD
最适pH 7. 2- 7. 4,
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成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温 度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋 酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移 取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入福 林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较， 计算出被测酶制剂的活力。
[X]
OD
OD= K′·C[X]
蛋白酶活力测定分析
注 意:
①选择λmax
λmax =680nm
②OD值的范围 OD=0.2～0.6 OD=0.43
4．制作标准曲线
酪氨酸浓度C OD
C1
OD1
C2
OD2
C3
OD3
···
···
Cn
ODn
蛋白酶活力测定分析
福林—酚法测定蛋白酶活力 方法要点
配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定
pH最适=7～8
2709 pH最适=9～11； 209 pH最适=9.5～11
蛋白酶活力测定分析
温度的影响
OD
T最适
T（℃）
蛋白酶活力测定分析
3350：T最适 ：45℃-47℃ 40℃以下稳
定
1398：T最适 ：30℃-37℃（pH：6.0-
6.5 ）
T最适 ：40℃-50℃（pH：7.0-
7.5 ）
蛋白酶活力测定
一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作手续 五、计算 六、注意事项
蛋白酶活力测定分析
一、概述
1．什么是酶？ 2．影响酶催化反应的
因素 3．什么是酶的活力? 4．测定意义 5. 测定方法
蛋白酶活力测定分析
生物催化剂
一种酶只作用一种底 物：
淀粉酶：只能催
特殊催化功能的蛋白质
化淀粉水解 → 低聚糖；
白无在温T味色弱最度适，至酸溶黄中
色 于 沉
稀粉淀碱沫，ppHH、， 几最适浓乎无酸不臭，
时间
t0
恒溶温于水水浴，有吸缓湿冲性溶，液干 t= t0
燥时稳定，潮湿时迅速
例子： 537 0.5%酪变蛋质白。 40℃
3.0 10min
例子： 1398 0.5%酪蛋白 40℃
7.5 10min
例子： 2709 0.5%酪蛋白 40℃
CH2—COOH HO—C —COOH
CH2—COOH
B液：0.1mol/L柠檬酸纳 29.4g Na3C6H5O7·2H2O → 1000ml
用时：A∶B=18.6∶1.4混合
蛋白酶活力测定分析
柠檬酸—柠檬酸钠溶液的pH计算
弱酸—弱酸盐缓冲体系
pH = pka1+lg（C酸/C盐） = 3.13+ lg（C酸/C盐）
2709：T最适 ：45℃-55℃
稳定。
蛋白酶活力测定分析
40℃以下
作用时间的影响
Q（反应物的消A 耗量或dQ生成物K 的生成量)
dt dQ
v dt
o
t0
t
蛋白酶活力测定分析
结论
酶催化反应 在反应初速度时间内 最适温度 最适pH 饱合底物浓度 在最大活力处比较
蛋白酶活力测定分析
蛋白酶的活力定义：
10
10min
蛋白酶活力测定分析
2.显色反应
钼蓝+钨蓝
蓝色物质
福林试剂 + 酪氨酸 OH-
HO — —CH2—CH—COOH 还原性 NH2
蛋白酶活力测定分析
Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 HCL
Li2SO4 Br2
显色剂
显色剂
亮金黄色
福林试剂→
蛋白酶活力测定分析
3．朗伯-比尔定律及其应用
在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶
液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白） 所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。
表示为：单位/g或单位/ml。通常人
们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为
5万单位，即：50000μg/g =0.05g酪氨酸 /1g酶粉。
生皮蛋白 质
测定意义
胶原蛋白（80%-85%）
底物浓度 pH 温度 时间
蛋白酶活力测定分析
底物浓度
V Vmax
底物浓度C C0
饱和浓度
蛋白酶活力测定分析
溶液pH的影响
OD
pH pH最适
蛋白酶活力测定分析
酶的分类
❖ 酸性蛋白酶
3350 pH最适=2～4； 7401 ❖ 中性蛋白酶
pH最适=3.0
1398 pH最适=7～7.5； 166 ❖ 碱性蛋白酶
二、测定原理
福林试剂，在碱性情况下极不 稳定。可被酚类化合物还原， 而呈蓝色反应。由于蛋白质或 水解产物中含有酚基的氨基酸 (酪氨酸、色氨酸等)也呈这个 反应，因此可以利用这个原理 来测定蛋白酶活性的强弱。
蛋白酶活力测定分析
1．酶催化反应
酶催化
酪蛋白
酪氨酸
条件
条件： 选择： 措施：
底物浓度
C0 C≥ C0
弹性蛋白 非胶原蛋白 网硬蛋白
间质蛋白
酶的活力会下降 酶的催化能力强
蛋白酶活力测定分析
测定方法
乙醇滴定法、甲醛滴定法等 Folin-酚法，紫外分光光度法，残 氮量测定法等等。 Gross法、明胶粘度下降法、凝乳 作用法 酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋 白酶原激活作用的大小来表示。
蛋白酶活力测定分析
蛋白酶活力测定分析
三、试剂
➢ 10﹪ CL3CCOOH 水溶液
➢ 0.55mol/L碳酸钠溶液
➢ 缓冲溶液
➢ 福林试剂
显色剂
一种杂多酸
磷钼酸 H3[P（Mo3O10）4] 磷钨酸 H3[P（W3O10）4]
蛋白酶活力测定分析
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O Na2MoO4·2H2o
H2O 85﹪H3PO4 浓HCL
100g 25g 100ml 50ml 100ml
Li2 SO4 50g 回流 10hr +
Δ
H2O 50ml
混匀 + 溴水 15`
Δ
冷却 →黄色 → 过滤
金黄色溶液
蛋白酶活力测定分析
(1)柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液 pH=3.0
A液：0.1mol/L柠檬酸 21.01g C6H8O7·H2O → 1000ml
E —— 吸光度 A —— 消光值 OD —— 光密度
有色真溶液
E = K·Ｃ·L
入射光强度I0 C
= lg（I0/I）
L
= K′· C
透过光强度I
透光率 T = I I0 蛋白酶活力测定分析
朗伯-比尔定律的应用
[X] → [RX] → OD
OD=K·C[RX]
被测组分的浓度与光密度OD成直线关系
糊精、
酶的特性:
蛋白酶：只能催 化蛋白质水解 → 氨
基酸、肽；
（1）作用有专一性、选择性
（2）催化速度快 （3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质
在激烈振荡、加热、 紫外线、X-射线的照 射，重金属盐作用下， 它的二、三结构会发 生改变。而变性，失 去催化能力这种现象
叫做酶的失活
蛋白酶活力测定分析