食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质
蛋白质的含量一般是按照总氮量乘上一个合适的
蛋白质换算系数来求得的。这个系数决定于物质中蛋 白质的含氮量。蛋白质的含氮量一般为15—17%，平 均值为16%左右。所以只要测出样品（鸡蛋、青豆、 肉、玉米等）中的含氮量，再乘以换算系数，就可计 算出样品中的蛋白质含量。
（g）; m------试样的质量或体积（g或mL） F------氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；乳制品为6.38；
面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大 豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、 裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。 计算结果保留三位有效数字。
至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5-1h，取下放冷， 小心加20ml水，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗涤烧瓶，洗 液并入容量瓶，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
消化装置
加入试剂的作用：
K2SO4的作用：作为增温剂，提高溶液沸点；加速 对有机物的分解作用。 CuSO4的作用：作为催化剂。还可以作消化终点指 示剂：当完全消化后，反应停止，变为兰色。浓硫 硫酸的作用：硫酸使有机物脱水，并破坏有机物， 使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而 蛋白质则分解氮，与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性 溶液中。
5.2 蒸馏：
（1）仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。 洗涤方法：先煮沸蒸汽发生器，器中盛有2/3体积的用几滴硫酸 酸化过的水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。关闭反 应管下的管夹使蒸汽通过反应室的插管进入反应室，再由冷凝 管下端逸出（可在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸-指示剂 的锥形瓶，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，可证明蒸 馏器内部已洗涤干净） 。 排废：用右手轻提样品杯中棒状玻塞，使水流入反应室的同时， 立即用左手捏紧橡皮管，以断气源，盖好玻塞。由于反应室外 层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自 动抽到反应室外壳中。再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，反复 三次。关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪1～3min，可进行蒸 馏。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质是生物体内重要的营养成分，对于人体的生长发育和健康维护起着重要的作用。
因此，准确测定食品、药物、生物样品中的蛋白质含量，对于保障食品安全和科学研究具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，供大家参考。
首先，常用的蛋白质含量测定方法之一是比色法。
比色法是通过蛋白质与某种试剂发生化学反应，产生有色产物，再利用光度计测定产物的吸光度来间接测定蛋白质含量。
其中，最常用的试剂是布拉德福试剂和伯尼斯试剂。
这种方法操作简便，测定结果准确，因此被广泛应用于食品、生物样品的蛋白质含量测定。
其次，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是比浊法。
比浊法是通过蛋白质与某种试剂发生沉淀反应，根据沉淀的浑浊度来测定蛋白质含量。
常用的试剂有硫酸铵和三氯乙醛。
比浊法操作简便，成本低廉，适用于大批量样品的测定。
另外，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是氨基酸分析法。
氨基酸分析法是通过水解蛋白质，然后利用色谱仪或氨基酸分析仪测定水解产物中各种氨基酸的含量，从而计算出蛋白质的含量。
这种方法对于蛋白质的成分分析非常准确，但操作复杂，需要专业设备和技术支持。
最后，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是生物素标记法。
生物素标记法是将生物素标记在蛋白质分子上，然后利用生物素与酶的特异性结合来测定蛋白质含量。
这种方法对于高灵敏度的蛋白质测定非常有效，但需要专门的标记试剂和设备支持。
总之，蛋白质含量的测定方法有很多种，每种方法都有其适用的场合和特点。
在实际应用中，需要根据样品的特点和实验条件选择合适的测定方法，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的几种常用方法能够为大家在蛋白质含量测定方面提供一些帮助。
食品中蛋白质的含量测定
蛋白质的测定方法测定食品中的蛋白质含量有二种方法，一是凯氏微量法，二是自动定氮分析法。
一．凯氏微量法有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮，实验者可根据经济条件设备而定。
1.原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（NH4）2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO42.方法本法参照GB 5009.5 -85适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定3.试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
试剂均为分析纯。
3.1硫酸铜3.2硫酸钾3.3浓硫酸3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸）3.5 混合指示剂：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
3.6饱和氢氧化钠：500g氢氧化钠加入500ml水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。
3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液：需标定后使用(配制及标定方法见附录)4.仪器消化炉凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子天平凯氏定氮蒸馏装置：如图所示5. 操作步骤5.1样品处理：精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20ml，放入100ml 或500ml凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜，0.3g硫酸钾及3~20ml浓硫酸，放置过夜后小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，取下放冷后用约2～10ml蒸馏水冲洗瓶壁，混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明，取下放冷，小心加10~20ml水混匀，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法)
实验:食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
三、仪器与试剂（一）试剂（所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制）1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、浓硫酸（密度为1.8419g/L）4、2%硼酸溶液（20g/L）5、40%氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。
7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图3-所示。
图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤1、样品消化称取样品约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏定氮烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
食品中蛋白质含量的测定
❖ 5.滴定
❖ 用 0.1mol/L 盐酸标准滴定溶液滴定收集液至 刚刚出现紫红色为终点。 同一试样做两次平 行试验，同时做空白试验。
❖ 6.计算 ❖ 计算比较简单，此处不再做详细的叙述。
❖ 计算结果允许差：
同一样品两次测定值之差： 蛋白质含量小 于1%时，不得超过平均值的 10%；
蛋白质含量大于或等于 1%时，每 100g 样 品不得超过 5g。
四.国标法中凯氏定氮法测量的优缺点 分析
❖ 1.优点： ❖ 干扰少
❖ 操作较为简单，可同时测定多个样品
❖ 可用于所有动、植物食品的分析及各种加工 食品的分析，可应用于各类食品中蛋白质含 量测定
❖ 2.缺点：
❖ 太粗略，不准确
❖ 费时，需 8～10小时
❖ 凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价 氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮 还原为氮盐Байду номын сангаас形式,所以不可以测出物质中 所有价态的氮含量.
三.实验步骤
❖ 1.试剂和溶液
所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的 水。 ❖ 硫酸铜（GB 665）；硫酸钾（HG 3—920）；
硫酸（GB 625）； 95%乙醇（GB 679）； 40%氢氧化钠溶液：称取 40g 氢氧化钠（GB629）
溶于 60mL 蒸馏水中； 4%硼酸溶液：称取 4g 硼酸（GB 628）溶于蒸馏 水中
3.1.2 液体试样：取 10～20±0.05mL 试样（使试 样中含氮 30～40mg），移入凯氏烧瓶中，蒸发至近 干。
4.2 消化 ：向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫 酸钾10g、硫酸20mL 及数粒玻璃珠。将凯氏烧瓶斜 放（45°）在电炉上，缓慢加热。待起泡停 止，内 容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈 蓝绿色透明时，继续加热 0.5～1h。取下凯氏烧瓶 冷却至约 40℃，缓慢加入适量水，摇匀。冷却至室 温。
食品中蛋白质的测定
任务：1、请设计检验样品抽样单，并抽样，填写相关记录；2、食品中蛋白质种类及含量是标志食品营养价值的重要指标，查阅资料，了解并下载国家标准测定蛋白质的方法。
3、凯氏定氮法测定食品中蛋白质方法原理是什么？凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理是样品与浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜一同加热消化, 使蛋白质分解, 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出, 而样品中的有机氮转化为氨和硫酸结合成硫酸铵, 然后加碱蒸馏, 使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸溶液滴定, 根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
4、对照国家标准，列出实验所需仪器与试剂所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。
硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸；40％氢氧化钠溶液：称取40g 氢氧化钠溶于60ml 蒸馏水中；4％硼酸溶液：称取4g 硼酸溶于蒸馏水中稀释至100ml；0.050mol/l 盐酸标准滴定溶液；甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/l）与甲基红乙醇溶液（1g/l）按1∶2 体积比混合。
实验室常规仪器及下列各项：凯氏烧瓶：500ml；可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；绞肉机：篦孔径不超过4nm；组织捣碎机；粉碎机；研钵：玻璃或瓷质；化学消化器；凯氏定氮仪；空气滤过器5.样品在消化过程中，应加入浓硫酸、硫酸钾及硫酸铜，试分别说清他们各自的作用。
加硫酸作用：硫酸及催化剂与样品加热消化, 使蛋白质分解, 其中C、H 形成CO2和H2O 逸出, 而蛋白质中的氮则转化成( NH4 )2SO4加硫酸钾作用：在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解,它与硫酸反应生成硫酸氢钾,可提高反应温度,一般纯硫酸加热沸点330 ℃,而添加硫酸钾后,温度可达400 ℃,加速了整个反应过程。
此外,也可以加入硫酸钠,氢化钾盐类来提高沸点。
其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解,水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大,沸点增加。
加速了有机的分解。
但硫酸钾加入量不能太大,否则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨而造成损失。
食品中蛋白质的测定作业指导书
食品中蛋白质的测定GB5009.5-2010方法一1、范围本标准规定了食品中蛋白质的测定方法。
本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体式样的筛选测定。
本标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
凯氏定氮法2、规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3、原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
4、试剂和材料除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析純，水为GB/T6682规定的三级水。
4.1 硫酸铜（CuSO4·5H2O）。
4.2 硫酸钾（K2SO4）。
4.3 硫酸（H2SO4，密度为1.84g/L）。
4.4 硼酸（H2BO3）。
4.5 甲基红指示剂（C15H15N3O2）4.6 溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。
4.7 亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3·3H2O）。
4.8 氢氧化钠（NaOH）。
4.9 95%乙醇（C2H5OH）。
4.10 硼酸溶液（20g/L）:称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。
4.11 氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL4.12硫酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。
4.13甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL 4.14亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL 4.15溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL 4.16混合指示液：2份甲基红乙醇溶液（4.13）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（4.14）临用时混合。
测量蛋白质含量的几种方法以及优缺点
一、染料法
优点：因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
缺点：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
优点：方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。
其方法凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
四、紫外吸收法
优点：灵敏度高，仪器设备简单，操作简便。
缺点：准确度不高，有的检测不可用，有限制。
五、凯氏定氮法（Kjeldahl determination）优点：可用于所有食品的蛋白质分析中，操作相对简单费用低。
结果
准确、改进后可以用于微量蛋白质的测定。
缺点：最终测定的是总有机氮而不是蛋白质氮。
精确度低于双缩脲法、试剂有腐蚀性。
六、F olin－酚试剂法（Folin-phenol
Reagent Method ）
优点：灵敏度高，方便简单。
缺点：费时较长，精确控制操作时间
七、考马斯亮蓝法（Coomassie
brilliant blue staining ）
优点：灵敏度高，测定快速，应用广泛，只需一种试剂，用时间短。
缺点：有较大的偏差，而且去污剂等很多试剂对其有干扰。
培训：食品中蛋白质的测定GB_5009.5-2010
蛋白质概况
➢ 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、 O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、 Cu、Fe、I 等。
蛋白质检测方法简介
➢ 目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共有三 种：
1、凯氏定氮法（适用于各种食品中蛋白质的测定） 2、乙酰丙酮分光光度法（适用于各种食品中蛋白质的测 定） 3、燃烧法（适用于蛋白质含量在10 g/100 g 以上的粮食、 豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）
➢ 不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质 的食品测定。
蛋白质检测方法简介
➢ 4、近红外光谱技术是20世纪80年代后期迅速发展起来 的一项物理测试技术。近红外透射或反射光谱具有分 析样品用量少、分析速度快和结果稳定等优点，在食 品分析领域已经逐步得到了应用。
➢ 5、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来杜马斯燃 烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含量在我国也有了 应用。
第一法：凯氏定氮法
➢ 原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使 蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱 化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸标准滴 定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白 质的含量。其反应方程式如下：
➢ 蛋白质+ H2SO4 → （NH4） 2SO4 ➢ （NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 ➢ NH4OH → H2O + NH3 → NH4OH ➢ NH3+(标准) H2SO4→（NH4）2SO4 ➢ (标准) H2SO4+NaOH→Na2SO4+H2O
食品中蛋白质含量的测定
•图 1 常量蒸馏装置 1—电炉；2—蒸汽发生瓶；3— 大气夹；4—螺旋夹；5—加碱漏斗；6—凯氏烧瓶； 7—氮素球；8—冷凝管；9—接收瓶；12—蒸汽发生器；3—大 气夹；4—螺旋夹；5—小玻璃杯； 6—反应室；7—冷 凝管；8—接收瓶
❖ 铰肉机：篦孔径不超过 4nm；组织捣碎机；粉碎机； 研 钵：玻璃或瓷质。
食品中蛋白质的测定方法
应用化学2班 来宏伟
09102100108
GB/T 14771—1993 中华人民共和国国家标准 食品中蛋白质的测定方法
Method for determination of protein content in foods
❖ 一. 主题内容与适用范围 : ❖ 本标准规定了用凯氏定氮法测定食品中蛋
3.1.2 液体试样：取 10～20±0.05mL 试样（使试 样中含氮 30～40mg），移入凯氏烧瓶中，蒸发至近 干。
4.2 消化 ：向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫 酸钾10g、硫酸20mL 及数粒玻璃珠。将凯氏烧瓶斜 放（45°）在电炉上，缓慢加热。待起泡停 止，内 容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈 蓝绿色透明时，继续加热 0.5～1h。取下凯氏烧瓶 冷却至约 40℃，缓慢加入适量水，摇匀。冷却至室 温。
❖ 凯氏定氮法测定出的食品中蛋白质含量为 粗蛋白含量
五.改进措施
❖ 1.消化过程用碱液吸收瓶,防止SO2排入大气 中造成的环境污染
4.3 蒸馏
4.3.1 常量蒸馏
❖ 向接收瓶内加入 50mL4%硼酸溶液及4滴甲基红 -次甲基蓝混合指示液。将接收瓶置于蒸馏装置的 冷凝管下口，使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。 将盛有消化液的凯氏烧瓶连接在氮素球下，塑料 管下端浸入消化液中。沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢 加入 70mL40%氢氧化钠溶液（使漏斗底部始终留 有 少量碱液，封口）。加碱后烧瓶内的液体应为 碱性（黑褐色）。通入蒸汽，蒸馏 20min（始终 保持液面沸腾）。至少收集 80mL 蒸馏液。降低 接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏 3min。用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收 瓶 内，取下接收瓶。
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法GB/T14771-931 本标准规定了用凯氏定氮法测定食品中蛋白质的方法。
本标准适用于肉禽制品、豆制品、水产品、调味品、谷物制品、发酵制品、糕点、植物蛋白饮料等食品中蛋白质的测定。
2 引用标准GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备3 原理以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定。
根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。
4 试剂和溶液：所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。
4．1 硫酸铜（GB 665）。
4．2 硫酸钾（HG 3—920）。
4．3 硫酸（GB 625）。
4．4 40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠（GB 629）溶于60mL蒸馏水中。
4．5 4%硼酸溶液：称取4g硼酸（GB 628）溶于蒸馏水中稀释至100mL。
4．6 0.1mol/L盐酸标准滴定溶液：按GB 601规定的方法配制与标定。
4．7 95%乙醇（GB 679）。
4．8 甲基红-次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/L）与甲基红乙醇溶液（1g/L）按1+2体积比混合。
5 仪器、设备实验室常规仪器及下列各项：5．1 凯氏烧瓶：500mL。
5．2 可调式电炉。
5．3 蒸汽蒸馏装置：见图1和图2。
6 试样的制备6．1 固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切（剪）成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎。
6．2 液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。
6．3 粉状样品：取有代表性的样品至少200g（如粉粒较大也应用研钵研细），混合均匀。
6．4 糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀。
6．5 固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀。
6．6 肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。
食品中蛋白质的测定
食品安全国家标准食品中蛋白质的测定1范围本标准规定了食品中蛋白质的测定方法㊂本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定,第三法适用于蛋白质含量在10g/100g 以上的粮食㊁豆类奶粉㊁米粉㊁蛋白质粉等固体试样的测定㊂本标准不适用于添加无机含氮物质㊁有机非蛋白质含氮物质的食品的测定㊂第一法凯氏定氮法2原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵㊂碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量㊂3试剂和材料3.1试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂3.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂3.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂3.1.3硫酸(H2S O4)㊂3.1.4硼酸(H3B O3)㊂3.1.5甲基红指示剂(C15H15N3O2)㊂3.1.6溴甲酚绿指示剂(C21H14B r4O5S)㊂3.1.7亚甲基蓝指示剂(C16H18C l N3S㊃3H2O)㊂3.1.8氢氧化钠(N a O H)㊂3.1.995%乙醇(C2H5OH)㊂3.2试剂配制3.2.1硼酸溶液(20g/L):称取20g硼酸,加水溶解后并稀释至1000m L㊂3.2.2氢氧化钠溶液(400g/L):称取40g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂3.2.3硫酸标准滴定溶液[c(12H2S O4)]0.0500m o l/L或盐酸标准滴定溶液[c(H C l)]0.0500m o l/L㊂3.2.4甲基红乙醇溶液(1g/L):称取0.1g甲基红,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.5亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L):称取0.1g亚甲基蓝,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.6溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L):称取0.1g溴甲酚绿,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.7 A混合指示液:2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合㊂3.2.8 B混合指示液:1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合㊂4仪器和设备4.1天平:感量为1m g㊂4.2定氮蒸馏装置:如图1所示㊂4.3自动凯氏定氮仪㊂说明:1 电炉;2 水蒸气发生器(2L烧瓶);3 螺旋夹;4 小玻杯及棒状玻塞;5 反应室;6 反应室外层;7 橡皮管及螺旋夹;8 冷凝管;9 蒸馏液接收瓶㊂图1定氮蒸馏装置图5分析步骤5.1凯氏定氮法5.1.1试样处理:称取充分混匀的固体试样0.2g~2g㊁半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g (约当于30m g~40m g氮),精确至0.001g,移入干燥的100m L㊁250m L或500m L定氮瓶中,加入0.4g硫酸铜㊁6g硫酸钾及20m L硫酸,轻摇后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45ħ角斜支于有小孔的石棉网上㊂小心加热,待内容物全部碳化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色并澄清透明后,再继续加热0.5h~1h㊂取下放冷,小心加入20m L水,放冷后,移入100m L容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用㊂同时做试剂空白试验㊂5.1.2测定:按图1装好定氮蒸馏装置,向水蒸气发生器内装水至2/3处,加入数粒玻璃珠,加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾㊂5.1.3向接受瓶内加入10.0m L硼酸溶液及1滴~2滴A混合指示剂或B混合指示剂,并使冷凝管的下端插入液面下,根据试样中氮含量,准确吸取2.0m L ~10.0m L 试样处理液由小玻杯注入反应室,以10m L 水洗涤小玻杯并使之流入反应室内,随后塞紧棒状玻塞㊂将10.0m L 氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其缓缓流入反应室,立即将玻塞盖紧,并水封㊂夹紧螺旋夹,开始蒸馏㊂蒸馏10m i n 后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1m i n ㊂然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下蒸馏液接收瓶㊂尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点,如用A 混合指示液,终点颜色为灰蓝色;如用B 混合指示液,终点颜色为浅灰红色㊂同时做试剂空白㊂5.2 自动凯氏定氮仪法称取充分混匀的固体试样0.2g ~2g ㊁半固体试样2g ~5g 或液体试样10g ~25g (约当于30m g ~40m g 氮),精确至0.001g ,至消化管中,再加入0.4g 硫酸铜㊁6g 硫酸钾及20m L 硫酸于消化炉进行消化㊂当消化炉温度达到420ħ之后,继续消化1h ,此时消化管中的液体呈绿色透明状,取出冷却后加入50m L 水,于自动凯氏定氮仪(使用前加入氢氧化钠溶液,盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A 或B 的硼酸溶液)上实现自动加液㊁蒸馏㊁滴定和记录滴定数据的过程㊂6 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式(1)计算:X =(V 1-V 2)ˑc ˑ0.0140m ˑV 3/100ˑF ˑ100 (1) 式中:X 试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g /100g );V 1 试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(m L );V 2 试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(m L );c硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度,单位为摩尔每升(m o l /L );0.0140 1.0m L 硫酸[c (12H 2S O 4)=1.000m o l /L ]或盐酸[c (H C l )=1.000m o l /L ]标准滴定溶液相当的氮的质量,单位为克(g);m试样的质量,单位为克(g);V 3 吸取消化液的体积,单位为毫升(m L );F氮换算为蛋白质的系数,各种食品中氮转换系数见附录A ;100换算系数㊂蛋白质含量ȡ1g /100g 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g /100g 时,结果保留两位有效数字㊂注:当只检测氮含量时,不需要乘蛋白质换算系数F ㊂7 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂第二法 分光光度法8 原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在p H4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物㊂在波长400n m下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量㊂9试剂和材料9.1试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂9.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂9.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂9.1.3硫酸(H2S O4):优级纯㊂9.1.4氢氧化钠(N a O H)㊂9.1.5对硝基苯酚(C6H5N O3)㊂9.1.6乙酸钠(C H3C O O N a㊃3H2O)㊂9.1.7无水乙酸钠(C H3C O O N a)㊂9.1.8乙酸(C H3C O O H):优级纯㊂9.1.937%甲醛(H C HO)㊂9.1.10乙酰丙酮(C5H8O2)㊂9.2试剂配制9.2.1氢氧化钠溶液(300g/L):称取30g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂9.2.2对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L):称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20m L95%乙醇中,加水稀释至100m L㊂9.2.3乙酸溶液(1m o l/L):量取5.8m L乙酸,加水稀释至100m L㊂9.2.4乙酸钠溶液(1m o l/L):称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠,加水溶解稀释至500m L㊂9.2.5乙酸钠-乙酸缓冲溶液:量取60m L乙酸钠溶液与40m L乙酸溶液混合,该溶液p H4.8㊂9.2.6显色剂:15m L甲醛与7.8m L乙酰丙酮混合,加水稀释至100m L,剧烈振摇混匀(室温下放置稳定3d)㊂9.2.7氨氮标准储备溶液(以氮计)(1.0g/L):称取105ħ干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后移于100m L容量瓶中,并稀释至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于1.0m g氮㊂9.2.8氨氮标准使用溶液(0.1g/L):用移液管吸取10.00m L氨氮标准储备液于100m L容量瓶内,加水定容至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于0.1m g氮㊂10仪器和设备10.1分光光度计㊂10.2电热恒温水浴锅:100ħʃ0.5ħ㊂10.310m L具塞玻璃比色管㊂10.4天平:感量为1m g㊂11分析步骤11.1试样消解称取充分混匀的固体试样0.1g~0.5g(精确至0.001g)㊁半固体试样0.2g~1g(精确至0.001g)或液体试样1g ~5g (精确至0.001g ),移入干燥的100m L 或250m L 定氮瓶中,加入0.1g 硫酸铜㊁1g 硫酸钾及5m L 硫酸,摇匀后于瓶口放一小漏斗,将定氮瓶以45ʎ角斜支于有小孔的石棉网上㊂缓慢加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5h ㊂取下放冷,慢慢加入20m L 水,放冷后移入50m L 或100m L 容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用㊂按同一方法做试剂空白试验㊂11.2 试样溶液的制备吸取2.00m L ~5.00m L 试样或试剂空白消化液于50m L 或100m L 容量瓶内,加1滴~2滴对硝基苯酚指示剂溶液,摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色,再滴加乙酸溶液至溶液无色,用水稀释至刻度,混匀㊂11.3 标准曲线的绘制吸取0.00m L ㊁0.05m L ㊁0.10m L ㊁0.20m L ㊁0.40m L ㊁0.60m L ㊁0.80m L 和1.00m L 氨氮标准使用溶液(相当于0.00μg ㊁5.00μg ㊁10.0μg ㊁20.0μg ㊁40.0μg ㊁60.0μg ㊁80.0μg 和100.0μg 氮),分别置于10m L 比色管中㊂加4.0m L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0m L 显色剂,加水稀释至刻度,混匀㊂置于100ħ水浴中加热15m i n ㊂取出用水冷却至室温后,移入1c m 比色杯内,以零管为参比,于波长400n m处测量吸光度值,根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程㊂11.4 试样测定吸取0.50m L ~2.00m L (约相当于氮<100μg)试样溶液和同量的试剂空白溶液,分别于10m L 比色管中㊂加4.0m L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0m L 显色剂,加水稀释至刻度,混匀㊂置于100ħ水浴中加热15m i n ㊂取出用水冷却至室温后,移入1c m 比色杯内,以零管为参比,于波长400n m 处测量吸光度值,试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量㊂12 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式(2)计算:X =(C -C 0)ˑV 1ˑV 3m ˑV 2ˑV 4ˑ1000ˑ1000ˑ100ˑF (2) 式中:X 试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g/100g );C试样测定液中氮的含量,单位为微克(μg );C 0试剂空白测定液中氮的含量,单位为微克(μg );V 1 试样消化液定容体积,单位为毫升(m L );V 3 试样溶液总体积,单位为毫升(m L );m 试样质量,单位为克(g);V 2 制备试样溶液的消化液体积,单位为毫升(m L );V 4测定用试样溶液体积,单位为毫升(m L );1000换算系数;100换算系数;F氮换算为蛋白质的系数㊂蛋白质含量ȡ1g /100g 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g /100g 时,结果保留两位有效数字㊂。
食品中营养成分的测定方法
食品中营养成分的测定方法食品是人体能量和营养的重要来源，而食品中各种营养物质的含量也是不同的。
对于食品厂商和消费者而言，了解食品的营养成分含量显得尤为重要。
而为了准确地测定食品中营养成分的含量，科学家们开发出了许多测定方法。
本文将对食品中营养成分的常见测定方法进行概述。
一、蛋白质测定方法蛋白质是人体内组成骨骼肌、血液、器官等组织的重要成分。
而在食品中，蛋白质含量的测定对于判断食品的质量和营养价值具有重要的意义。
目前，常见的蛋白质测定方法有比色法、滴定法等。
其中，比色法是一种基于标准曲线的颜色衡量法，对于测定多种蛋白质都有一定的适用性。
而滴定法则是利用酸化剂消解食品中的蛋白质，并通过滴定来测定溶液中氨基酸的含量，从而计算出样品中蛋白质的含量。
这些蛋白质测定方法均具有一定的优缺点，在实际中应根据具体情况进行选择和使用。
二、糖类测定方法糖类是人体内的能量来源之一，也是许多食品的主要营养成分之一。
测定食品中的糖类含量对于判断食品的品质和营养价值同样十分重要。
常见的糖类测定方法包括显色法、分光光度法、色谱法等。
其中，显色法是一种基于还原糖物质还原性的测定方法，通常利用费林试剂、巴氏试剂等显色试剂对样品进行反应。
而分光光度法与色谱法则是通过特定光谱特征或色谱图的峰面积来确定样品中糖类的含量，这些方法相对来说测定结果更为准确和可靠。
三、脂肪测定方法脂肪是人体内储存的能量来源之一，同时也是食品中的重要能量和营养来源。
在食品测定中，糖类与脂肪测定方法的原理类似。
常见的脂肪测定方法包括电感耦合等离子体发射光谱法、红外光谱法等。
电感耦合等离子体发射光谱法是一种适用于测定多种元素含量的分析方法，可以通过检测食品样品中的有机元素含量来测定其中脂肪的含量。
而红外光谱法则是利用样品中吸收红外光的特定特征来测定样品中的化学成分含量，其同样对脂肪含量的测定具有一定的优势。
综上所述，食品中营养成分的测定方法涉及多个方面，基于不同的测定原理以及具体的实验要求，科学家们发展出了一系列测定方法，这些方法大大提高了我们对食品质量和营养价值的认识，为工业和消费者提供了科学、可靠的数据支撑。
任务05 测定食品中蛋白质-思维导图
控温消化炉，半自动凯氏定氮仪、消化管及消化管架、滴定管
硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿
3.仪器、 设备、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剂
硫酸铜
a催化作用：加速有机物的氧化分解。
b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；
c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑 色沉淀
硫酸钾
提高溶液沸点
浓硫酸
氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
（1）消化
4.实验操作
（2）加碱 蒸馏 吸收
（3）滴定
5、数据分析及处理 6、注意事项
一、 蛋白质
《食品分析与检验技术》
任务五 测定食品中蛋白质及氨基酸
元素：
定义
1
C、H、O、N元素，S、P、Fe、Cu
（一） 相关知识
单位
氨基酸。
人体必需氨基酸：
8必需
凯氏定氮法 2
苯蛋赖苏色亮异亮颉
（二） 测定方法
双缩脲法
1
紫外吸收法
Folin-试剂 1
凯氏定氮法 最常用方法 测定总氮最准确
（三） 应用
考马斯亮蓝法 1
案例
乳粉中蛋白质含量的测定？
1.方法
凯氏定氮法
前提
蛋白质含N量约为16％，蛋白质含量=总氮量*蛋白质系数。
消化
蛋白质与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮（硫酸铵）。
2.原理
加碱 蒸馏 吸收
碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收
滴定
盐酸标准溶液滴定
计算
标准酸的摩尔数~~~~样品总氮量~~蛋白质的量
蛋白质的测定
2、消化准备 将试样移入洗净、烘干、编号的
100 mL或500 mL的凯氏烧瓶内 ，加入0.2 g硫酸
铜，6 g硫酸钾及20 mL硫酸，加入2粒～3粒玻璃 珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角
斜支于有小孔的石棉网上。
消化
3、消化 将准备好的凯氏烧瓶以45°斜放于温控电炉上（先垫上石
棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），
④ 步骤
凯 氏 定 氮 法
消化
滴定 吸收
蒸馏
样品消化
总反应式： 2NH2（CH2）2COOH + 13H2SO4
（NH4）2SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O
（一定要用浓硫酸-98%）
<1> 加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入 硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
g) 混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与5份溴甲酚绿乙醇 溶液 (1g/L) ，临用时混合。 ( 也可用 2 份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与1份次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)临用时混合)。
盐酸标准滴定溶液配制与标定 [c(HCl)=0.0500 mol/L]
（GB/T 601-2002 化学试剂 标准滴定溶液的制备 1、配制 按下表的规定量取盐酸，注入1000 mL水中，摇匀。
2NH4Cl + 4H3BO3
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl标准溶液吸收，再用 NaOH 标 准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。
凯氏定氮法分析步骤再次说明
GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》第一法） （一）试样处理
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法一、生物化学方法生物化学法是通过测定蛋白质分解产物或检测蛋白质与一些化学试剂的反应来测定食品中蛋白质的含量。
常用的生物化学方法包括碱溶液提取法、伯努利法、生物素试验法等。
1.碱溶液提取法：该方法通过将食品样品用强碱溶液处理，使蛋白质变为溶液中的游离氮，然后用酸中和，从而测定蛋白质的含量。
这种方法操作简便、结果准确，但可能会引入一些误差。
2. 伯努利法：该方法是利用吸收波长处于280nm左右的多肽链或多肽链片段来测定蛋白质含量。
通过测定吸收光的强度来推算出蛋白质的浓度。
这种方法适用于含多肽链的样品。
3.生物素试验法：该方法是利用生物素与标记有酶的抗生素分子相结合，来测定蛋白质的含量。
这种方法非常灵敏，且测定结果稳定可靠。
二、光谱法光谱法是一种利用分子在特定波长下对光的吸收或散射来测定蛋白质含量的方法。
常用的光谱法有紫外-可见光光谱法和红外光谱法。
1. 紫外-可见光光谱法：该方法是利用蛋白质分子中芳香族化合物的吸收峰来测定蛋白质的含量。
其中，279nm波长的吸收峰对应着蛋白质的特征吸收峰。
通过测量吸光度来计算蛋白质的含量。
2.红外光谱法：该方法通过检测蛋白质分子中的功能基团振动特征来测定蛋白质的含量。
红外光谱法可以提供蛋白质的结构信息，且操作简便。
三、色度法色度法是一种利用颜色反应来测定蛋白质含量的方法。
常用的色度法包括比色法、光度法和电色谱法等。
1. 比色法：该方法是利用食品样品与其中一种试剂作用后的颜色反应来测定蛋白质的含量。
常用的试剂有布莱特试剂、Lowry试剂和比显色法等。
2. 光度法：该方法是利用针对蛋白质的特定试剂发生的光谱变化来测定蛋白质的含量。
常用的试剂有Coomassie蓝试剂，通过与蛋白质结合产生颜色反应，再通过测量吸光度来计算蛋白质的含量。
3.电色谱法：该方法是利用蛋白质的分子电荷特性来测定蛋白质的含量。
通过测定蛋白质在电场中的迁移速率来计算蛋白质含量。
综上所述，食品中蛋白质的测定方法较多，可以根据不同的食品样品和测定目的选择合适的方法，以获取准确的样品中蛋白质含量信息。
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食品中蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。
但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。
由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。
一凯氏定氮法我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。
(一)、常量凯氏定氮法衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。
即可计算该样品的蛋白质含量。
一般食品蛋白质含氮量为l6％，即1份氮素相当于6.25分蛋白质,以此为换算系数6.25，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同.如玉米、高梁、荞麦,肉与肉制品取6.25，大米取5.95、小麦粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取5.17，动物胶5.55。
测定原理：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。
(1) 消化反应：有机物(含C、N、H、O、P、S等元素)+H2S04-→(NH4)2S04+C02↑+S02↑+S03+H3PO4+CO2↑(2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH-→2NH3↑+2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3BO3-→(NH4)2B4O7+5H2O(3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O-→2NH4CH+4H3BO3 或(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2试剂与仪器：1、硫酸钾；2、硫酸铜；3、浓硫酸；4、4％硼酸溶液(饱和溶液)；5、40％氢氧化钠溶液；6、混合指示剂：临用时把(溶解于95％乙醇的)0.l％甲基红溶液10毫升和(溶于95％乙醇的0).l％甲基蓝溶液5毫升混合而成；7、0.1N盐酸标准溶液或0.1N硫酸标准溶液；8、凯氏定氮仪一套。
9、定氮瓶500ml二只。
10、三角瓶250ml 3只。
11、量筒50ml、lOml、lOOml。
12、吸管10ml。
13、酸式滴定管1支,规格25ml。
14、小漏斗1只。
操作方法：1、样品消化：精密称取0.200-2.00g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。
取下放冷，小心加100ml水，放冷。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸，用同一方法做试剂空白试验。
2、蒸馏、吸收：按图装好定氮装置。
接收瓶内加入50ml 4%硼酸溶液及混合指示剂5滴，并使冷凝管的下端插入液面下；将70ml 40%氢氧化钠溶液慢慢通过安全漏斗进入蒸馏烧瓶中，用直火加热蒸馏30分钟，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。
(接收瓶内的溶液呈蓝色)。
3、滴定：以0.1N盐酸标准溶液定至溶液灰色或淡紫色为终点。
同时作一试剂空白测定除不加样品外，丛消化开始操作完全相同。
计算：蛋白质(%)=（(V1-V2)×N×0.014×F）×100/ mV1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m：样品的质量（体积），g（ml）；F：氮换算为蛋白质的系数。
注：（1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。
（4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。
（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
（8）氨是否完全蒸馏出来，可用精密PH试纸试馏出液是否为碱性。
（9）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（10）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。
有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:（1）K氏烧瓶和取样量如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
（2）分解剂A H2SO4和K2SO4的添加量有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。
K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20mlB 催化剂用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。
（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。
（4）氨的蒸馏和吸收及滴定蒸馏有两种:1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）2 水蒸汽蒸馏蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。
吸收液有：1标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂2 硼酸用HCl进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。
〈6〉注意事项a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。
b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。
c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。
d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。
f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。
h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。
这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。
2 K氏微量定氮仪法3 K氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。
计算总氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。
4 K氏自动定氮法原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。
二水扬酸比色法1 原理：样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。
2 方法（１）标准曲线的绘制取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6分别加空白酸液 2ml分别加磷酸盐缓冲液 5ml稀释至总体体积至15ml分别加水扬酸钠 5ml37C水浴 15分钟加入次氯酸钠 2.5ml37C水浴 15分钟取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。
（2）样品处理：准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量瓶。