克隆的筛选和快速鉴定

实验六克隆的筛选和快速鉴定

一、目的

掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。

二、原理

在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。

或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。

三、试剂与仪器

（一）试剂

1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。

配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml

20% SDS 10ml

250mmol/L EDTA 1.6ml

蔗糖27.2g

1.2%溴酚蓝 1.67ml

加ddH2O至200ml

2．10mg/ml 溴乙啶

3．TBE电泳缓冲液（5×）

4．Taq DNA聚合酶(5U/μl)

5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）

6．dNTP

7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

（二）仪器

1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip

4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机

7．紫外分析仪8．恒温水浴

四、操作步骤

（一）快速细胞破碎法测定

1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。

2

3．待转化的细菌菌落长到2mm时

4．用牙签挑取单克隆点在作好标记的方格内，然后挑同一克隆加入对应1.5ml离心管中（离心管中已加入50μl破碎细胞缓冲液）。

5．培养皿37℃培养6小时后4℃保存。

6．离心管于37℃水浴中，保温15分钟。

7．12000rpm，离心15分钟。

8．取上清约25μl，进行琼脂糖凝胶电泳。（胶浓度为1%）

9．紫外灯进行结果分析。

（二）菌落PCR快速鉴定法

1．直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入20μl PCR反应体系中。

2．用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。

试剂体积（20μl）

模板单克隆菌体

10 x buffer 2μl

10×dNTP 2μl

Primer P1 1μl

Primer P2 1μl

ddH2O 补足到20μl

Taq酶2U

3．0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。

4．观察并记录结果。