克隆的筛选和快速鉴定
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
实验二 阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取(5学时)
实验二阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取（5学时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法。
二、实验原理：1、蓝白斑筛选原理2、碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、羧苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶四、实验步骤1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液2mL加入离心管中，4000r/min离心1min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在离心管中。
（每组至少做6管）3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的离心管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
冰上放置15min让质粒DNA复性(千万不可用旋涡震荡器)。
6、12000r/min离心10min，将上清转至另一个离心管中。
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法主要分为以下几个步骤：
1. 基因突变体的诱导：通过物理、化学或生物诱变剂处理靶基因，以产生所需的突变。
这些诱变剂可以包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。
2. 突变体的筛选：通过表型筛选或DNA测序，从处理过的基因中找出突变的个体。
表型筛选是通过观察表型变化来挑选突变体，而DNA测序则是直接对基因序列进行分析。
3. 突变基因的克隆：使用PCR（聚合酶链式反应）或基因文库技术，将突变基因从基因组中扩增出来。
这一步需要用到特定的引物或探针，以便准确地识别和扩增目标基因。
4. 克隆的验证：通过DNA测序等技术，对克隆的基因进行验证，确保其与原始突变基因一致。
5. 表达载体构建：将克隆的突变基因插入到表达载体中，以便在宿主细胞中进行表达。
这一步通常涉及到载体DNA和目的DNA的酶切、连接和转化等操作。
6. 表达和功能分析：将构建的表达载体转染到适当的宿主细胞中，进行表达和功能分析。
这一步可以包括对表达产物的检测、对细胞表型的影响等方面的研究。
7. 突变基因的应用：根据研究结果，将突变基因应用于相关的生物工程或医学研究中。
例如，可以用于研究基因功能、开发新药物或改良农作物等。
克隆突变基因的方法涉及多个技术领域，如分子生物学、生物化学和遗传学等。
这些技术的不断发展和改进，使得我们能够更快速、更准确地鉴定和克隆突变基因，为相关研究提供有力支持。
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。
首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。
这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。
一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。
比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。
你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。
比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。
时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。
所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。
二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。
在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。
这就像开锁要用对钥匙一样呢。
要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。
各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。
引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。
要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。
还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
单克隆筛选方法
单克隆筛选方法单克隆筛选方法是一种用于筛选出特定单克隆抗体的技术手段。
单克隆抗体是一种能够特异性识别和结合特定抗原的抗体分子，具有广泛的应用价值。
单克隆筛选方法的出现，为研究人员提供了一种高效、准确的手段，以快速获得所需的单克隆抗体。
一、单克隆筛选方法的背景单克隆抗体的研发一直是生物医药领域的热点之一。
传统的制备单克隆抗体的方法，如杂交瘤技术，虽然能够获得单克隆抗体，但操作复杂、耗时长且效率低下，限制了其在实际应用中的推广。
为了解决这个问题，研究人员陆续提出了许多新的筛选方法，其中单克隆筛选方法就是其中之一。
单克隆筛选方法主要是基于高通量筛选平台和多样性库的组合使用。
首先，需要构建一个包含大量抗体序列的多样性库，这个库中包含了各种可能的抗体变量区序列。
然后，将这个库与目标抗原进行筛选，通过多轮筛选，逐渐筛选出对目标抗原具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体。
三、单克隆筛选方法的流程单克隆筛选方法通常包括以下几个步骤：1. 构建多样性库：通过将人体免疫系统中的抗体序列进行随机变异，构建一个具有多样性的抗体库。
这个库中包含了大量不同的抗体变量区序列。
2. 筛选抗原结合：将构建好的多样性库与目标抗原进行筛选。
通常，可以通过将目标抗原与库中的抗体变量区序列进行杂交，筛选出与目标抗原结合的候选抗体。
3. 亲和力筛选：通过逐渐提高筛选条件，筛选出具有高亲和力的单克隆抗体。
通常，可以通过改变抗原浓度、筛选时间等参数来实现。
4. 特异性筛选：通过将候选抗体与与目标抗原类似的结构进行竞争结合，筛选出对目标抗原具有高特异性的单克隆抗体。
5. 鉴定和验证：对筛选出的单克隆抗体进行鉴定和验证。
这包括对抗体的亲和力、特异性、稳定性等进行评价，确保其具有良好的性能。
四、单克隆筛选方法的优势相比传统的制备单克隆抗体的方法，单克隆筛选方法具有以下几个优势：1. 高效性：单克隆筛选方法利用高通量筛选平台，能够同时对大量的抗体进行筛选，提高了筛选效率。
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的鉴定引言：单克隆抗体是一种重要的生物医学研究工具，可用于疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其特异性、亲和性和稳定性的重要步骤，以保证其在实际应用中的准确性和可靠性。
本文将介绍单克隆抗体鉴定的基本原理、常用的鉴定方法和相关的实验步骤。
一、单克隆抗体鉴定的基本原理单克隆抗体鉴定的基本原理是通过筛选和鉴定细胞克隆，确定具有特定抗原识别能力的单个细胞克隆，然后将其扩增并纯化得到单克隆抗体。
鉴定的关键在于筛选出具有高特异性、高亲和力和稳定性的单克隆抗体。
二、单克隆抗体鉴定的常用方法1. 杂交瘤技术：杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体鉴定方法之一。
该技术通过将抗原刺激的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，然后通过限稀稀释法或酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
2. 胶体金法：胶体金法是一种快速、灵敏的单克隆抗体鉴定方法。
该方法利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合，形成可见的颜色反应，通过观察颜色变化来确定是否存在特定的抗原-抗体反应。
3. 免疫组化技术：免疫组化技术是一种广泛应用于单克隆抗体鉴定的方法。
该技术通过将细胞或组织样本与单克隆抗体反应，然后通过显色剂或荧光染料来观察特定抗原的表达情况，以判断单克隆抗体的特异性和亲和力。
三、单克隆抗体鉴定的实验步骤1. 抗原制备：首先需要制备纯化的抗原，可通过基因工程技术获得重组蛋白或通过提取生物体中的抗原蛋白。
2. 免疫动物免疫：将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 杂交瘤细胞融合：将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：通过限稀稀释法或ELISA等方法筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体扩增：将筛选出的单克隆抗体进行扩增，并经过多次培养和纯化，以获得足够的纯净抗体。
6. 单克隆抗体鉴定：通过免疫组化技术、胶体金法等方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性、亲和力和稳定性。
目的基因序列克隆的筛选与鉴定
目的基因序列克隆的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。
一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。
最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。
将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。
在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。
以下就常用技术的基本原理加以介绍。
一、根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)、G418等。
当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。
如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。
例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。
载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。
例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。
根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。
第七章重组体克隆的筛选和鉴定总结
固相支 待测基因 一抗 持滤膜 产物蛋白
125I标记的二抗
125I 标记的二 固相支 待测基因 一抗 二抗 抗结合蛋白 持滤膜 产物蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 二抗 产物蛋白
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法
Southe rn blot 筛选结 果
酶切前
酶切后
载体
插入片断
4. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
第三节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
四、 核酸分子杂交检测法
1、原理： 1）. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。
2）. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 3）. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P
荧光素
2、菌落噬菌斑原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
3. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探 针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂 交，在底片上曝光显示。
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
重组克隆的筛选与鉴定
4、 选择得过程
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素 抗性基因失活,可用四环素﹢环丝氨酸 得平板,选择重组克隆。
Tetr插入失活得细菌,其生长可被四环素 抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活得细菌,能抗四环素,正常生长, 但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
二、利用抗生素抗性基因:pBR322
以pBR322为例,说明利用抗生素抗性基因得插 入失活得原理。
1、 原理
在pBR322上有多个单一得限制酶位点,如 BamH I位点,恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点,那么涉及 四环素抗性得基因就损坏,因此,带有重组 pBR322质粒得细胞,仍对氨苄青霉素有抗性, 但对四环素得抗性消失(敏感)。
pUC18/19得结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因:编码-半乳糖苷酶得部分肽
段。 Lac Z上有插入外源DNA得MCS位点。
4、 筛选得方法:蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子,就是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性得方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素得培 养基,能合成-半乳糖苷酶。
该技术已广泛应用于基因得表达、基因 定位、克隆基因得筛选、酶切图谱得制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传 病疾病得诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交得基础
1、 变性与退火 DNA以双链形式存在,在进行分子杂交
时,先将双链DNA分子解聚为单链,这一 过程称为变性。
两条单链通过碱基互补,聚合成稳定得 双链区得过程称为退火或复性。
图 表型筛选加酶切筛选
０
A
A
T T
TA AT
dna 克隆的基本过程
dna 克隆的基本过程DNA克隆的基本过程DNA克隆是指通过人工手段将一个DNA分子复制成许多完全相同的DNA分子的过程。
这一技术的应用非常广泛，可以用于基因工程、医学研究、生物学研究等领域。
下面将介绍DNA克隆的基本过程。
第一步：DNA提取DNA克隆的第一步是从细胞中提取DNA。
细胞可以来自任何生物体，包括人类、动物、植物等。
DNA提取可以通过多种方法进行，常用的方法是利用细胞裂解酶和蛋白酶将细胞膜和细胞核膜破坏，释放出DNA分子。
第二步：DNA片段的制备在DNA克隆中，需要将待克隆的DNA分子切割成较小的片段。
这可以通过限制性内切酶进行，限制性内切酶能够识别特定的DNA序列并切割DNA链。
切割后的DNA片段可以是几百到几千个碱基对长。
第三步：载体的选择在进行DNA克隆时，需要选择一个合适的载体来携带待克隆的DNA 片段。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中自主复制。
噬菌体是一种病毒，可以感染细菌并将其DNA插入到细菌染色体中。
第四步：DNA连接将DNA片段和载体进行连接是DNA克隆的关键步骤。
这一步骤需要使用DNA连接酶，该酶能够将DNA片段的末端与载体的末端连接起来，形成一个完整的DNA分子。
连接后的DNA分子被称为重组DNA。
第五步：转化将重组DNA引入到宿主细胞中是进行DNA克隆的下一步。
转化可以通过多种方法进行，包括热冲击法、电穿孔法和化学法等。
这些方法都能够使宿主细胞吸收外源DNA，并将其整合到细胞染色体中。
第六步：筛选和鉴定为了确定哪些细胞成功地转化了重组DNA，需要进行筛选和鉴定。
常用的筛选方法是将转化后的细胞培养在含有特定抗生素的培养基上，只有带有重组DNA的细胞才能生长下来。
鉴定可以通过PCR扩增和DNA测序等方法进行。
第七步：扩增成功鉴定后，可以通过培养和扩增来获得大量的重组DNA。
重组DNA 可以在细胞中自主复制，从而得到足够多的DNA分子。
阳性克隆筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因插入到载体质粒中，并通过转化大肠杆菌，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
具体步骤包括：质粒提取、DNA片段的扩增、质粒与DNA片段的连接、转化大肠杆菌、阳性克隆的筛选与鉴定。
二、实验材料1. 仪器设备：- 离心机- PCR仪- 紫外分光光度计- 电泳仪- 热浴箱- 离心管- 研钵- 移液器- 平板培养箱2. 试剂：- 质粒提取试剂盒- DNA提取试剂盒- PCR试剂- DNA连接酶- 转化试剂- 抗生素（氨苄青霉素、四环素等）- 培养基（LB、固体LB培养基等）- 其他常用试剂（如：DNA酶、RNA酶、缓冲液等）3. 实验材料：- 目的基因片段- 载体质粒- 大肠杆菌菌株（如DH5α）三、实验方法1. 质粒提取：使用质粒提取试剂盒，按照说明书提取含有目的基因的质粒。
2. DNA片段的扩增：采用PCR技术，以目的基因片段为模板，扩增目的基因。
3. 质粒与DNA片段的连接：将PCR产物与载体质粒进行连接反应，构建重组质粒。
4. 转化大肠杆菌：将连接好的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。
5. 阳性克隆的筛选：- 培养液筛选：将转化后的菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，培养过夜。
- 蓝白斑筛选：观察菌落颜色，白色菌落可能为含有目的基因的阳性克隆。
- 抗生素平板筛选：将白色菌落接种到含有氨苄青霉素和四环素的LB固体培养基上，培养过夜，验证菌落是否具有抗生素抗性。
6. 阳性克隆的鉴定：- 酶切鉴定：将白色菌落提取质粒，进行酶切反应，电泳检测酶切产物。
- PCR鉴定：将白色菌落提取质粒，进行PCR反应，检测目的基因是否存在。
四、实验结果1. 质粒提取：成功提取出含有目的基因的质粒。
2. DNA片段的扩增：PCR产物在预期位置出现特异性条带。
3. 质粒与DNA片段的连接：连接反应成功，转化大肠杆菌。
4. 阳性克隆的筛选：- 培养液筛选：成功筛选出白色菌落。
PCR法筛选重组克隆[详细讲解]
![PCR法筛选重组克隆[详细讲解]](https://img.taocdn.com/s3/m/521f91cdcf2f0066f5335a8102d276a200296063.png)
实验三PCR法筛选重组克隆【实验目的】1.学习和了解常用重组克隆筛选方法的原理；2.掌握PCR法快速筛选重组克隆的操作方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以 －半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交（见实验十一）等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码 －半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的 肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使 肽基因失活不能形成 互补作用，也就是说，宿主细胞表现为 －半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
克隆基因的筛选原理是什么
克隆基因的筛选原理是什么克隆基因的筛选原理是指通过人工手段从大量基因样本中筛选出具有特定功能的基因，并将其放入宿主细胞中进行进一步研究和应用。
克隆基因的筛选原理主要包括基因文库构建、基因识别和筛选、基因克隆和鉴定几个关键步骤。
基因文库构建是克隆基因筛选的第一步。
基因文库是将一个生物体的全基因组按照一定的方法嵌入到携带载体中，使得携带载体中每一个片段都代表原生的一部分基因组。
构建基因文库的关键在于获取高质量的DNA样本和选择合适的携带载体。
DNA样本可通过提取原生生物体中的基因组DNA获得，或者从cDNA 文库中选择目标基因进行片段化、并连接载体。
选取合适的携带载体要考虑到质粒大小、复制能力、选择标记以及宿主菌的特点等因素。
构建好的基因文库可进一步用于基因识别和筛选。
基因识别和筛选是克隆基因筛选的关键环节。
通过基因识别和筛选可以找到含有特定功能基因的片段。
常用的基因识别和筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、亚克隆筛选等。
杂交筛选是目前常用的筛选方法之一，它是利用目标DNA序列与抗原DNA进行互相杂交，然后用标记技术检测杂交融合的特定单链DNA。
PCR筛选是利用特异引物进行PCR扩增，通过扩增产物的特异性确认目标基因。
亚克隆筛选是通过对目标基因片段进行酶切、分离纯化、与载体连接等操作，用于提取目标基因并确认其准确性和特异性。
基因克隆是克隆基因筛选的核心步骤。
基因克隆是将目标基因提取出来，并与携带载体连接，将得到的重组载体导入宿主细胞中进行繁殖。
常用的基因克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶连接、DNA凝胶电泳纯化等。
限制性内切酶切割是将目标基因和携带载体通过限制性内切酶在特定位点进行酶切，然后通过连接酶将两者进行连接。
DNA凝胶电泳纯化是通过凝胶电泳将目标基因和携带载体分离，然后提取纯化后的DNA进行进一步实验。
基因鉴定是克隆基因筛选的最后一步。
通过基因鉴定可以确认克隆的基因是否与目标基因一致，并确定其序列和功能。
植物抗病基因的克隆与鉴定
植物抗病基因的克隆与鉴定植物病害是世界各地农民和园艺爱好者所面临的一个普遍问题。
为了保护农作物和花卉的健康，植物学家和遗传学家们一直在致力于研究植物抗病基因的克隆和鉴定。
抗病基因的发现与研究为了确定植物中的抗病基因，研究人员首先需要从这些植物中分离出基因。
基于现代分子生物学技术，研究人员能够对基因进行克隆和鉴定。
最近，科学家们在研究拟南芥的抗黑线病基因时取得了一定的进展。
研究表明，该抗病基因能够依靠其基因编码产物来刺激植物的免疫反应，从而保护植物不受病原体的伤害。
抗病基因的克隆与鉴定抗病基因的克隆过程通常包括两个步骤：DNA文库构建和筛选。
DNA文库是指植物细胞中所有基因序列的集合。
文库中的DNA通常是通过群体DNA提取方法或单细胞PCR方法获得的。
研究人员将DNA文库插入DNA载体中，构建出含有全部植物基因序列的基因文库。
接下来，研究人员需要验证一些基因是否为抗病基因。
通常这种工作是通过功能鉴定进行的。
功能鉴定的方法有很多种，包括转基因技术、基因敲除技术、基因启动子分析和蛋白质互作鉴定等。
利用这些技术，研究人员可以确定哪些基因与植物的免疫反应有关联。
抗病基因的功能分析与利用基因鉴定后，研究人员通常会进行功能分析和利用。
其中一种方法是通过转移、喷雾或浸泡等方式利用基因工程技术将抗病基因转接到植物中去。
这个过程通常称为转基因。
转基因作物被引入后，它们就能够抵御一系列的病原体，从而提高农民的产量和收益。
此外，研究人员还在寻找其他类型的抗病基因。
研究表明，一些植物物种的抗病基因和人类免疫系统中的基因有些相似之处。
这可能意味着这些植物基因能够为人类的免疫系统研究提供思路。
未来，研究人员将继续利用分子生物学和基因工程技术去寻找新型抗病基因，从而保护我们的农业和花卉生产。
简述基因克隆主要过程
简述基因克隆主要过程基因克隆是指将一个特定的基因从一个细胞或生物体中复制并插入到另一个细胞或生物体中的过程。
这项技术的发展为生物学和医学研究提供了重要的工具，也给基因治疗和转基因技术等领域带来了巨大的希望。
下面将以简述的形式介绍基因克隆的主要过程。
基因克隆的主要过程可以分为以下几个步骤：1. 提取DNA：首先，需要从源细胞或组织中提取目标基因的DNA。
这可以通过破碎细胞壁和细胞膜来释放DNA分子。
常用的提取方法包括化学法、机械法和酶法等。
2. 制备载体：接下来，需要准备一个载体来携带目标基因。
载体可以是环状的质粒DNA或病毒基因组。
质粒是一种小型DNA分子，它可以在细胞内自主复制，并且可以被插入到其他细胞中。
病毒基因组则是利用病毒的自身复制机制来传递基因。
3. 限制性内切酶切割：为了将目标基因插入到载体中，需要使用限制性内切酶来切割DNA。
限制性内切酶是一种能够识别特定DNA 序列并切割它们的酶。
通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标基因和载体的DNA分子切割为互补的粘性末端。
4. 连接目标基因和载体：将目标基因和载体的DNA分子连接起来，可以使用DNA连接酶。
这种酶可以将目标基因和载体的DNA分子的末端粘性连接在一起，形成一个完整的复合DNA分子。
5. 转化或转染：将连接好的复合DNA分子引入到目标细胞中。
转化可以通过热激冲击、电穿孔或化学方法等多种方式实现。
转染则是将复合DNA分子包装成特定的脂质体或使用病毒作为载体，将其引入到细胞内。
6. 筛选和鉴定：在转化或转染后，需要对细胞进行筛选和鉴定，以确认是否成功插入了目标基因。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR扩增等。
通过筛选和鉴定，可以确定哪些细胞成功地表达了目标基因。
7. 扩增和表达：成功鉴定出含有目标基因的细胞后，可以将这些细胞进行扩增和培养。
这样可以获得大量表达目标基因的细胞，并进一步研究其功能和应用。
总结起来，基因克隆的主要过程包括提取DNA、制备载体、限制性内切酶切割、连接目标基因和载体、转化或转染、筛选和鉴定，以及最终的扩增和表达。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
目的基因的筛选和鉴定方法有几种
目的基因的筛选和鉴定方法有几种目前，对于目的基因的筛选和鉴定方法有多种。
这些方法涵盖了从基因库中高通量筛选到基因序列分析的多个方面。
下面将介绍一些常用的筛选和鉴定目的基因的方法。
1. 克隆与基因文库筛选克隆与基因文库筛选是一种最常见的方法，适用于突变体或陌生基因的鉴定。
该方法基于将多个基因或突变体克隆到载体上，并通过对每个克隆体的筛选和鉴定来确定目的基因。
常见的技术包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析、序列比对和Southern印迹等。
2. PCR扩增和测序PCR扩增和测序是一种高效的方法，适用于特定基因的筛选和鉴定。
通过设计引物来扩增目的基因的特定区域，并通过测序分析来确认目的基因的存在和序列。
PCR扩增和测序方法广泛应用于基因突变分析、基因表达差异鉴定等方面。
3. 蛋白质互作筛选蛋白质互作筛选是一种重要的方法，适用于鉴定与目的基因相互作用的蛋白质。
常见的蛋白质互作筛选方法包括酵母双杂交、GST pull-down和共沉淀等。
这些方法通过使用目的基因表达的融合蛋白或亚细胞定位标记来筛选与目的基因相互作用的蛋白质。
4. 表达差异分析表达差异分析是一种用于鉴定目的基因表达差异的方法，广泛应用于基因调控研究和疾病相关基因的鉴定。
常见的表达差异分析方法包括差异表达基因分析、差异外显子使用分析、差异剪切事件分析等。
这些方法通过比较不同组织、时间点或处理条件下基因的表达差异来鉴定目的基因。
5. 功能验证和鉴定功能验证和鉴定方法用于评估目的基因的功能和作用机制。
常见的方法包括转基因动物模型构建、RNA干扰和基因敲除等。
这些方法通过改变目的基因的表达或功能来确定其对生物体的影响，并进一步研究其作用机制。
总结起来，目的基因的筛选和鉴定方法包括克隆与基因文库筛选、PCR扩增和测序、蛋白质互作筛选、表达差异分析以及功能验证和鉴定等多种方法。
这些方法在基因研究的不同方面发挥着重要作用，并为我们深入了解基因的功能和表达调控提供了有效的手段。
分子克隆技术步骤
分子克隆技术步骤第一步：选取目标DNA在开始分子克隆之前，需要从一个生物体中选择一个含有所需DNA序列的样本。
这可以是任何生物体的DNA，例如人类、动物、植物或微生物。
第二步：DNA提取从所选生物体提取DNA。
这可以通过使用一系列化学和物理方法来完成，例如细胞裂解、蛋白酶处理、DNA沉淀和洗涤等。
第三步：选择一个合适的载体载体是一种DNA分子，可以容纳目标DNA序列并将其复制。
在分子克隆中最常使用的载体是质粒。
质粒是圆形的双链DNA分子，存在于许多细菌和酵母种类中，并被广泛用于分子生物学研究。
第四步：限制性内切酶切割将目标DNA和载体同时使用限制性内切酶（Restriction Enzymes）酶切。
限制性内切酶是一种可以识别和切割特定DNA序列的酶。
通过在目标DNA和载体的特定位置上切割，可以为将两者连接提供互补的末端。
第五步：DNA连接将目标DNA和载体连接在一起。
将目标DNA和载体的DNA片段混合，并在其末端形成互补碱基，然后使用DNA连接酶将两者连接在一起。
连接后的DNA分子被称为重组质粒。
第六步：转化将重组质粒引入细菌或酵母等微生物细胞中，这个过程称为转化。
这可以通过将细菌细胞暴露在低温高压胁迫下来实现，使得细胞膜变得更加渗透性，可以将质粒引入细胞内。
第七步：筛选和鉴定筛选出含有重组质粒的细菌或酵母细胞。
一种常用的筛选方法是将细菌培养在含有抗生素的培养基上，只有携带重组质粒的细菌才能在含有抗生素的环境下存活。
此外，还可以使用标记基因和特定染色剂等方法来鉴定重组质粒。
第八步：扩增和纯化用培养液扩增含有重组质粒的细菌或酵母细胞。
随着细菌或酵母细胞的生长，它们会复制重组质粒并将其传递给后代细胞。
然后使用一系列纯化步骤，如离心、洗涤和电泳等手段，将其中的重组质粒提取纯化。
总结：分子克隆技术的主要步骤包括选取目标DNA、DNA提取、选择合适的载体、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定，以及扩增和纯化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验六克隆的筛选和快速鉴定
一、目的
掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。
二、原理
在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。
利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。
利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。
然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。
在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。
或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。
三、试剂与仪器
（一）试剂
1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。
配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml
20% SDS 10ml
250mmol/L EDTA 1.6ml
蔗糖27.2g
1.2%溴酚蓝 1.67ml
加ddH2O至200ml
2．10mg/ml 溴乙啶
3．TBE电泳缓冲液（5×）
4．Taq DNA聚合酶(5U/μl)
5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）
6．dNTP
7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
（二）仪器
1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip
4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机
7．紫外分析仪8．恒温水浴
四、操作步骤
（一）快速细胞破碎法测定
1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。
2
3．待转化的细菌菌落长到2mm时
4．用牙签挑取单克隆点在作好标记的方格内，然后挑同一克隆加入对应1.5ml离心管中（离心管中已加入50μl破碎细胞缓冲液）。
5．培养皿37℃培养6小时后4℃保存。
6．离心管于37℃水浴中，保温15分钟。
7．12000rpm，离心15分钟。
8．取上清约25μl，进行琼脂糖凝胶电泳。
（胶浓度为1%）
9．紫外灯进行结果分析。
（二）菌落PCR快速鉴定法
1．直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入20μl PCR反应体系中。
2．用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。
试剂体积（20μl）
模板单克隆菌体
10 x buffer 2μl
10×dNTP 2μl
Primer P1 1μl
Primer P2 1μl
ddH2O 补足到20μl
Taq酶2U
3．0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。
4．观察并记录结果。