中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定 PPT课件
中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件
本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。
7
8
1.0
0
0
1.0
0
0
4
4
0.140 0.582 （稀释5倍）
中国药科大学生化设计性实验报告
6
参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图
根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量
中国药科大学生化设计性实验报告
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参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
（三）菠萝蛋白酶活力的测定
2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg 4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528% （五）结果讨论
从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：
1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响； 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨
何威 刘鄂龙
中国药科大学生化设计性实验报告
1
参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶； 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验； 3、学习酶比活力的计算；
菠萝蛋白酶的提取和活力测定
三、实验材料和试剂
1、实验材料
新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白
2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化 钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁 冻存备用
菠萝汁
纱布过滤
酶复合物沉淀
（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
1、标准曲线的制作 按下表操作
试管号 标准蛋白 （0.1mg/ml) 1 0 0 1.0 4 0 2 0.1 0 0.9 4 0.115 3 0.2 0 0.8 4 0.148 4 0.4 0 0.6 4 0.245 5 0.6 0 0.4 4 0.395 6 0.8 0 0.2 4 0.525 7 1.0 0 0 4 8 0 1.0 0 4
离 心
澄清液
2000r/min，7min离心 加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心
钠加 溶适 液量 ，
1.5% 氯 化
酶复合物
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液， 摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中 蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
应该注意的事项
1.操作过程温度的控制，确保所得的蛋 白不失活。 2.弄清所加试剂和每步操作对实验结果 的影响。 3.在酶活力的测定中，加入氢氧化钠是 为了终止反应。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影 响。需要多次实验确定所加的量，避免 反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。
一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用
1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中， 可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。 并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质 的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的 精加工。 3、干酪：用于干酪素的凝结
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
背景介绍
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠 萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶（FruitBromelain）， 从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶（Stem Bromelain）。 菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的巯基蛋白酶，能分 解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋 白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一 种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、 明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶 解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症； 它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中 小面积深度烧伤的治疗。这里就菠萝蛋白酶的三种提取方 法
菠萝蛋白酶的制备及活力测定
1%酪蛋白溶液（ml）
8
1
8
0
8
0
迅速摇匀，室温下静置30min
取上清液于275nm波长下测定吸光值
五、结果与讨论
1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。
(A2+A3)/2－A1
酶活性= —————————
0.15×1/100×1/10
2、洗涤与保护
（1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I；
（2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II；
四、实验步骤
1、提取
（1）取一定量的菠萝皮汁（约ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中；
（2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min；
（3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。
4、酶活测定
（1）酶液制备
取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS(磷酸盐缓冲液)定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。
（2）活性测定
取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37℃水浴保温至恒定）
试剂
管号
1
菠萝蛋白酶的制备及其活力测定
1、防腐剂：5%苯甲酸钠溶液：取5g苯甲酸钠加蒸馏水至100ml，混匀，即得。
2、沉淀剂：0.2%鞣酸溶液：取鞣酸0.6g，加乙醇至300ml，溶解混匀，即得。
3、洗涤剂Ⅰ：0.1%EDTA用0.5%的EDTA稀释即得。
1.5%Na Cl ：取Na Cl 12g ，加纯水至800ml，混匀，即得。
4、洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌：取乙酸锌2.5g，加水至500ml，混匀，即得。
0.06%抗坏血酸：取抗坏血酸0.12g，加水至200ml，混匀，即得。
0.5%EDTA：取EDTA1.5g，加水至300ml，混匀，即得。
5、洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠：取硫代硫酸钠0.5g，加水至100ml，混匀，即得。
0.1% L-半胱氨酸溶液10ml【配制方法：取L-半胱氨酸0.1g,加水10ml,加1mol/L 盐酸溶液(浓盐酸1ml加水至12ml即得)6～8滴，最后用6mol/L的氢氧化钠试液（240g氢氧化钠加水至1000ml即得）中和至pH3～4。
】扩大10倍体积。
6、菠萝蛋白酶活力测定试剂：（此试剂暂不配制，看提取情况再定）0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0):取6.8g磷酸二氢钾(136.09g/mol)加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，即得。
激活剂【取6.8g磷酸二氢钾加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，加15mol的硫代硫酸钠(158g/mol)，加6molEDTA-2Na(374.26g/mol),现用现配。
】1%酪蛋白：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml烧杯中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，转移至100ml容量瓶内定容，保存于冰箱内。
1mol/L氢氧化钠：去氢氧化钠40g加水至1000ml，即得。
也可以用6mol的稀释。
器材：榨汁机、离心机(本实验室的那太不好用，申请调换)、冰箱、干燥器、研钵、剪刀、紫外分光光度计。
菠萝蛋白酶的制备及活性测定
菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromel ain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(AnanaCOmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。
菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。
一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。
八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murach i，et a1．，1964)。
1981年，Marcan o首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Will statt er，Bergma nn和Ma rtin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembr omela in E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruitbromel ainE．C．3．4．22．5)。
Murach i和Neu rath、E1．G harbaw i和Whi taker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。
结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。
Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Mur aclli 的分析结果相似。
1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。
菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的制备及活力测定
3
菠萝蛋白酶的生物学特征
三、储运特性 库房通风低温干燥 所需灭火剂：水,泡沫 沙土,二氧化碳 干粉 所需灭火剂： 泡沫,沙土 二氧化碳,干粉 泡沫 沙土 二氧化碳 四、物理性质 白色至浅棕黄色无定形粉末。溶于水， 白色至浅棕黄色无定形粉末。溶于水，水溶液无色至淡黄 有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白。 色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白。 主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。 主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。尚有水 解酰胺基键和酯类的作用。 解酰胺基键和酯类的作用。 分子量： 分子量：约33000DA 等电点pH值 等电点 值：9.35 最适pH值 最适 值：7 最适温度： ℃ 最适温度：45℃
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实验仪器与试剂
1、仪器：压榨机、吸附槽、虹吸管、盐析槽、离心 仪器：压榨机、吸附槽、虹吸管、盐析槽、 溶解罐、玻璃棒、烧杯、漏斗、抽滤机、 机、溶解罐、玻璃棒、烧杯、漏斗、抽滤机、电子 天平等 2、试剂：菠萝、0.05%苯甲酸钠溶液、4%高岭土、 试剂：菠萝、0.05%苯甲酸钠溶液、4%高岭土、 苯甲酸钠溶液 高岭土 16%氢氧化钠溶液 质量分数7% 9%的食盐 盐酸、 氢氧化钠溶液、 7%— 的食盐、 16%氢氧化钠溶液、质量分数7%—9%的食盐、盐酸、 质量分数为25 硫酸铵、体积分数1 25﹪ 质量分数为25﹪硫酸铵、体积分数1：3的盐酸等
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2、吸附
将汁液移人吸附槽中 将汁液移人吸附槽中 搅拌 ，同时加入 4 吸附槽 高岭土， ％的高岭土，搅拌约 20 min，在 10℃吸附 ， ℃ 30～60 min，用虹吸排掉上清液收集高岭土 ～ ， 吸附物
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菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响中国药科大学药学院 09级药化一、实验目的1、了解菠萝蛋白酶的提取方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、了解菠萝蛋白酶的纯化4、了解菠萝蛋白酶的化学修饰5、修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33 000 , 等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取菠萝蛋白酶，糖类、多元醇使得酶的稳定性得到增强。
三、实验材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CM Sepharose FF 凝胶（1.1cm×30.0cm）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH计、搅拌棒3、试剂：0.2%单宁、5 %苯甲酸钠溶液、0. 1 %/0.5%EDTA 溶液、1. 5%氯化钠溶液、0. 5%乙酸锌溶液、0.06 %抗坏血酸溶液、0. 5%硫代硫酸钠、1 %L - 半胱氨酸溶液、20mM pH4.0 的醋酸缓冲液、1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）、双缩脲试剂、pH7.0 的干酪素溶液、酶液激活液（pH4.5 ，L-cys 和EDTA-2Na 配制）、三氯乙酸溶液、标准酪蛋白试剂、0.1M盐酸、0.1M氢氧化钠、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖、50%甘油、O．1mol/L 柠檬酸盐缓冲液(pH 3．0)、NEM四、实验过程1、提取：菠萝洗净榨汁。
菠萝蛋白酶测定实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（5）班马俊宇201430520516摘要：本次实验通过对菠萝皮中存在的菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离；并采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量，利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后的水解产物酪氨酸，在280nm处吸光值的高低，判断酶活性的大小。
从实验结果看出，纯化程度越高，提取液中蛋白质的含量先降低，后升高。
同时，实验测得菠萝蛋白酶的比活力、回收率随纯化程度的提高而先升高后降低。
关键词：菠萝蛋白酶纯化酶活性蛋白质含量前言菠萝蛋白酶主要分布于菠萝的茎和果实中，能分解蛋白质、肽、脂和酰胺，具有较高的生物活性，在各个生产领域中得到广泛的应用[1]。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能[2]。
菠萝萝蛋白酶 p H 在 4.0~5.5处于较稳定的状态，在中性环境中酶活保持最高，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活[3]。
本实验研究粗提取、盐析和透析所得到的菠萝蛋白酶提取液中的蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等，对酶的纯化情况进行研究。
1 实验材料与仪器1．1 实验材料与试剂新鲜菠萝（3个），盐析粗提液（PBS），酪蛋白试剂，激活剂，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，乙醇1．2 实验仪器电子天平，台式天平，恒温水浴锅，冰箱，高速离心机，分光光度计，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，滤纸，试管，试管架，滴管，玻璃棒，纱布，洗耳球，标签纸，橡皮筋DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2 实验方法2．1 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min 至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的提取和活力测定
根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图
根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量
（三）菠萝蛋白酶活力的测定
1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml, 离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶 和0.9m激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号 、 、 、 、 ，各加 1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37℃水浴； 5、然后按下表操作
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶； 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验； 3、学习酶比活力的计算；
二、实验基本原理
菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶， 能分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄 色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不 溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。
酶复合物
（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
1、标准曲线的制作 按下表操作
试管号 标准蛋白 （0.1mg/ml) 待测酶蛋白 (ml) 磷酸缓冲液 (ml) 考马斯亮蓝 (ml) 吸光度A 0 0.115 0.148 0.245 0.395 0.525 0.582 1 0 0 1.0 4 2 0.1 0 0.9 4 3 0.2 0 0.8 4 4 0.4 0 0.6 4 5 0.6 0 0.4 4 6 0.8 0 0.2 4 7 1.0 0 0 4 8 0 1.0 0 4 0.140 （稀释5倍）
中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶酶活力影响因素及测定酶活力方法的研究进展
1.1 湿度、温度和 pH[1-2]
在干燥环境中，菠萝蛋白酶活力相对稳定，随着环境湿度 增大，高水分增加了酶结构的柔性，也使蛋白酶发生自水解作 用，酶失活速率加快。详见表 1。
表 1 湿度对菠萝蛋白酶的影响 Tab.1 Effect of humidity on bromelain
度达到 0.035 mg/mL 时，修饰酶的活力高达 147.25 %。
1.5 有机溶剂[7]
将果菠萝蛋白酶分别加至不同浓度有机溶剂中处理 60 min，
分别在含对应浓度的有机溶剂的测活体系中测定它们的剩余酶
活力，结果见表 3，随着有机溶剂浓度增大，酶活力呈直线下降，
当甲醇、乙醇、乙二醇浓度分别达到 25.5 %、20.5 %和 24.0 %
2.2 紫外分光光度法[15]
菠萝蛋白酶在一定的温度与 pH 条件下，水解酪蛋白底物， 然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀除 去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸 光度计算其酶活力。1 g 固体酶粉(或 1 mL 液体酶)，1 min 水 解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸为一个酶活力单位，以 U/g(U/mL) 表示。该方法所需试剂较少，操作手续较简便，但灵敏度较低。
饰，得到菠萝蛋白酶的修饰酶。PEG 作为一种修饰剂与菠萝
蛋白酶相连从而在菠萝蛋白酶外形成一个保护膜，一定程度上
抵抗了热、酸碱的破坏。与天然菠萝蛋白酶相比，经 PEG 修 饰的酶在热稳定性及酸碱稳定性上都有显著提高。并且 Ca2+ 和 Mg2+对修饰酶的活力有很强的激活作用。当 Ca2+的浓度达 到 0.05 mg/mL 时，修饰酶的活力高达 257.66 %；当 Mg2+的浓
提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定ppt课件
〔7〕焦耳热：电泳过程中释放的热量与电流强度 的平方成正比。当电流强度或电极缓冲液中离子强 度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨 率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支 持物。
• 在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)构 成氧的自在基，后者又使单体构成自在基，从而 引起聚协作用。
• TEMED在低 pH时失效，会使聚协作用延迟。
• 冷却〔低温〕也可使聚合速度变慢。
• 一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延伸， 妨碍聚协作用。
• 这些要素在实践操作时都应予以控制。
• 光聚合：
• 聚丙烯酰胺的根本构造
• 为丙烯酰胺单位构成的长链， 链与链之间经过 甲叉桥结合在一同。链间纵横交错，构成三维网 状构造，使凝胶具有分子筛性能。
• 网状构造还能限制蛋白质等样品的分散运动，使 凝胶具有良好的抗对流作用。
• 此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲 水凝胶。该构造中不带电荷，在电场中电渗景象 极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于 作区带电泳的支持介质。
• 基于上述缘由，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳 中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和外形的影 响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr的函数。
• 当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。
• 符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K • MW ：蛋白质的分子量， • m R ：相对迁移率，b：斜率，K：截距。 • 当条件一定时，b与K均为常数 • 知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得